郭 杰 ，孫中理 ，蔡海燕 ，余 杭 ，張 穎 ，張 翼

(1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，四川成都611130； 2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川成都611130； 3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000)

獼猴桃果酒皂土下膠計量評估實驗比較

郭 杰1，2，3，孫中理1，2，3，蔡海燕1，2，3，余 杭1，2，3，張 穎1，2，3，張 翼1，2，3

(1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，四川成都611130； 2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川成都611130； 3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000)

果酒產(chǎn)品常在貨架期內(nèi)因物理、化學(xué)或微生物不穩(wěn)定而產(chǎn)生渾濁、失光或沉淀現(xiàn)象。這種現(xiàn)象極大影響了產(chǎn)品的感官品質(zhì)及銷售情況。生產(chǎn)中常用皂土下膠的方式避免其中因蛋白質(zhì)不穩(wěn)定而產(chǎn)生的渾濁沉淀問題。為預(yù)防皂土下膠過度或不足，常采用以下實驗方法評估皂土下膠計量：三氯乙酸（trichloroacetic acid）試劑法、加熱法及酒精沉淀法。本實驗以梯度皂土計量的下膠方式對獼猴桃果酒進行處理后，對此3種方法進行實驗比較。結(jié)果表明，三氯乙酸法所測定的下膠劑量較加熱法高；加熱法測定的下膠劑量接近自然條件下的沉淀劑量，其中6 h加熱處理較30 min加熱處理更適用于氣溫較高地區(qū)；酒精沉淀法在本實驗中無法測定下膠劑量。

獼猴桃果酒； 蛋白質(zhì)穩(wěn)定； 下膠； 皂土

果酒產(chǎn)品常在貨架期內(nèi)因物理、化學(xué)或微生物不穩(wěn)定而產(chǎn)生渾濁、失光或沉淀現(xiàn)象。這種現(xiàn)象極大影響了產(chǎn)品的感官品質(zhì)及銷售情況。在生產(chǎn)過程中，為了避免部分因蛋白質(zhì)或多酚類物質(zhì)不穩(wěn)定而引起的渾濁沉淀現(xiàn)象，常采用澄清劑去除酒液中的不穩(wěn)定蛋白或已經(jīng)產(chǎn)生的懸浮渾濁物[1]，皂土便是果酒中的常用澄清劑之一。

皂土（Bentonite），又稱膨潤土或蒙脫土（Mont-morillonite），其通用化學(xué)式為 Al2O34SiO2·nH2O-內(nèi)嵌離子。皂土主要的存在形態(tài)呈極小的片狀結(jié)晶，且在水解過程中易形成膠體。水解后，四面體結(jié)構(gòu)的SiO44-會在八面體結(jié)構(gòu)的AlO66-上面與3個氧通過硅鍵鏈接（如圖1），多個此結(jié)構(gòu)通過氫鍵鏈接形成薄片結(jié)構(gòu)。四面體和八面體結(jié)構(gòu)的電荷數(shù)不同，使其表面帶有負電荷，這也使得皂土薄片結(jié)構(gòu)之間形成間隙，而內(nèi)嵌的Na+或Ca2+的陽離子則存在于此間隙之間（見圖2）。由于果酒中的酸性環(huán)境使蛋白質(zhì)或多酚類分子帶正電荷，所以在酒液環(huán)境內(nèi)蛋白質(zhì)分子會通過置換皂土間隙內(nèi)的陽離子，形成沉淀，從而脫離酒液環(huán)境[2]。

圖1 SiO44-與AlO66-結(jié)構(gòu)及其鏈接

圖2 蒙脫土結(jié)構(gòu)示意圖[1]

下膠過度可能導(dǎo)致下膠劑在酒液中有殘留，或者去除了香氣物質(zhì)；而下膠不足則會導(dǎo)致部分未沉淀的不穩(wěn)定蛋白或多酚類物質(zhì)在裝瓶之后，再次形成沉淀。對果酒進行下膠處理之前，為了預(yù)防因皂土下膠過度或者不足，常采取一系列的確定下膠劑量的相關(guān)試驗手段。生產(chǎn)中常用的試驗手段有：三氯乙酸（trichloroacetic acid）試劑測試法、加熱測試法及酒精沉淀測試法。這些實驗是通過分析下膠處理后的澄清酒液中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性來評估下膠劑量的。簡單來說，在通過一定劑量的皂土下膠處理后，如測定其蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性較高且滿足相應(yīng)的條件，則說明該劑量可以達到預(yù)期的效果，反之則說明劑量不足。3種實驗方法沉淀蛋白質(zhì)的機理分別為：三氯乙酸試劑測試能使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變,使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水集團暴露，從而聚集沉淀[3]；加熱測試則是通過溫度升高使得蛋白質(zhì)的2級、3級、4級結(jié)構(gòu)改變，從而聚集沉淀[4]；而酒精沉淀測試則是由于酒精可破壞蛋白質(zhì)的水化層，從而使蛋白質(zhì)的溶解度下降而析出沉淀。

因為這些蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的測試實驗機理不同，所以通過不同實驗方法所推測的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性存在一定差異。本實驗采用梯度皂土劑量對獼猴桃酒進行下膠處理，然后通過4種方法測定其下膠劑量和預(yù)測蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，分析其結(jié)果的差異性。

1 材料與方法

1.1 材料

酒樣：產(chǎn)自四川省什邡市紅什2號獼猴桃所釀制的獼猴桃果酒。

儀器：小型Z6紙板過濾裝置；50 mm，0.45 μm水系針頭過濾器；水浴鍋、離心機；SGZ-200A型濁度計。

1.2 試驗方法

精確量取9份獼猴桃果酒酒液，每份700 mL，用完全水解的濃度為5%的皂土進行下膠處理。下膠皂土劑量分別為：0.1 g/L、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4g/L，留1份700 mL未處理的酒液作為對照樣。將每種酒液裝瓶密封，放置在室溫暗室沉淀7 d。所有酒液經(jīng)過小型Z6紙板過濾機過濾、排氣處理之后，將每種酒液依次進行以下蛋白質(zhì)穩(wěn)定性測試。

1.2.1 三氯乙酸試劑測試法

測定澄清酒液的初始濁度。精確抽取20 mL的澄清酒液移至大試管中，加入2 mL的55%三氯乙酸溶液，混合均勻后在沸水中加熱2 min，冷卻至室溫后測量其濁度。

1.2.2 加熱測試法

表1 三氯乙酸試劑測試結(jié)果表

取100 mL酒液至密封小瓶內(nèi)。將小瓶置于80℃的恒溫水浴加熱鍋內(nèi)，加熱30 min后，搖晃均勻后取出20 mL酒液，冷卻至室溫測量其濁度。剩余酒液繼續(xù)加熱5.5 h，取出冷卻至室溫，測量其濁度。

1.2.3 酒精沉淀處理法

取出20 mL澄清酒液測量其初始濁度，之后移至大試管加入20 mL的99.5%vol酒精，混合均勻，測量其濁度。

2 結(jié)果與分析

2.1 三氯乙酸試劑測試(見表1)

根據(jù)Berg和Akyoshi[5]的研究，Coleman Nephlos值約等于5.6倍差值濁度，根據(jù)其實驗結(jié)果說明，Coleman Nephlos值與酒中蛋白質(zhì)穩(wěn)定程度的關(guān)系見表2。

表2 Coleman Nephlos與白葡萄酒中蛋白質(zhì)穩(wěn)定程度的關(guān)系[5]

三氯乙酸試劑測試結(jié)果表明（見表1），在下膠劑量小于等于0.8 g/L時，差值濁度隨著下膠劑量的增加有著顯著地降低，而在0.8～1.0 g/L時，差值濁度下降不明顯，但是在0.8 g/L的Coleman Nephlos值達到穩(wěn)定程度，所以在下膠劑量為0.8 g/L時，該獼猴桃果酒達到蛋白質(zhì)穩(wěn)定。

2.2 加熱測試（表3、表4）

表3 80℃下加熱30 min的處理結(jié)果

由表3、表4看出，30 min加熱處理下的酒液，在0.4 g/L的下膠劑量達到蛋白質(zhì)穩(wěn)定，6 h加熱處理下的酒液，在1.0 g/L的下膠劑量才達到穩(wěn)定。在30 min加熱測試中，0.1～0.4 g/L的下膠劑量區(qū)域內(nèi)，各下膠計量之間差值濁度變化明顯，其他樣本區(qū)域變化不明顯；在6 h加熱測試中，0.1～0.8 g/L的下膠劑量區(qū)域內(nèi)，各下膠計量之間差值濁度變化明顯。這也說明經(jīng)30 min加熱處理后的酒液仍然存在蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的潛在問題。

2.3 酒精沉淀實驗

在酒精沉淀測試結(jié)果中發(fā)現(xiàn)（如表5），對于所有的下膠劑量差值濁度值都較大，且變化不明顯，無法判定蛋白質(zhì)穩(wěn)定時的下膠劑量。

2.4 4種評估方法差值濁度與不同下膠計量對比(見圖3)

由圖3可知，通過酒精沉淀測定法處理的酒液所表現(xiàn)的差值濁度遠遠大于其他方法。其原因可能主要是因為所形成的懸浮顆粒，不僅僅有酒液中所析出沉淀的總蛋白質(zhì)及多酚類物質(zhì)，還有獼猴桃果酒中所含的多糖類物質(zhì)[6]。因大部分多糖類物質(zhì)與蛋白質(zhì)相似，會隨著酒精含量升高而使其溶解度降低，而達到過飽和形成沉淀。所以，即使經(jīng)過1.4 g/L的皂土下膠處理，使酒液中脫去大部分蛋白質(zhì)，但是無法脫去多糖類物質(zhì)，這也就導(dǎo)致了多糖類物質(zhì)會在酒精沉淀測試中表現(xiàn)出較大的NTU差值。此外，部分多糖類物質(zhì)對酒中的有機酸鹽穩(wěn)定有促進作用[7]，所以可以推測，在隨著酒精度的增加，多糖物質(zhì)的沉淀，酒液中有機酸鹽的溶解度降低，可能也會產(chǎn)生有機酸鹽結(jié)晶，使其濁度增加。

表4 80℃下加熱6 h的處理結(jié)果

表5 酒精沉淀測試結(jié)果

圖3 4種評估方法差值濁度與不同下膠計量對比圖

根據(jù)實驗結(jié)果，用50%vol的酒精濃度所測量的每個樣本之間差異性不大，無法用此推測應(yīng)使用的下膠劑量。所以，在實驗設(shè)計中或許應(yīng)將添加無水酒精的劑量減少。正因為所添加酒精劑量缺少相應(yīng)文獻參考，再加上此法可使酒中的多糖物質(zhì)沉淀，所以，此方法可能更推薦作為其他蛋白質(zhì)穩(wěn)定性測定方法的輔助，而不是作為主要的測量方法。

加熱測定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法是目前在世界范圍內(nèi)最常用的方法，因為果酒在裝瓶以后，形成沉淀或者澄清度降低的主要原因為環(huán)境溫度的變化[8]。加熱測試正是對自然條件下的極端化試驗，比之其他實驗更接近自然瓶裝儲存條件。比之30 min加熱的測量方式，Bladwin[9]更加推薦使用6 h加熱的測量方法，尤其是在夏季溫度較高的地區(qū)。這是由于在氣溫較高的地區(qū)，瓶裝成品酒的儲存環(huán)境更容易產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀，所以也就需要更加嚴格的實驗手段，來測量其下膠劑量。本實驗也證實了6 h加熱測量的下膠劑量高于30 min所測量的下膠劑量。通過比較兩個加熱試驗的數(shù)據(jù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的差值濁度數(shù)據(jù)在6 h的加熱處理中均大于30 min的，所以推測6 h的測量方法可能會有一定的過度測量。Nordestgaard等[10]也有同樣的相關(guān)推測，6 h的加熱處理不僅僅沉淀了葡萄酒中的蛋白性物質(zhì)，其他物質(zhì)也會在6 h的加熱下而產(chǎn)生沉淀，降低葡萄酒的澄清程度。

三氯乙酸試劑測量方法為使蛋白質(zhì)化學(xué)變性法。根據(jù)Esteruelas等[6]的實驗，三氯乙酸的添加所沉淀的蛋白物質(zhì)的量至少要比自然沉淀的量多出3倍，多糖類物質(zhì)是自然沉淀的2倍。這個現(xiàn)象在本實驗中也有所體現(xiàn)，在同等計量的條件下，三氯乙酸試劑有可能造成過度測量下膠劑量值。

3 結(jié)語

根據(jù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以化學(xué)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性而沉析出為作用機理的三氯乙酸法有可能會造成過度測量下膠計量值。加熱測試法則比之其他實驗更接近造成自然瓶裝儲存條件中的不穩(wěn)定蛋白沉淀析出的原理模式，其中6 h的加熱測試比之30 min的加熱測試更加適合于高氣溫地區(qū)使用，但也有潛在的過度測量問題。而本實驗所用的酒精測量法無法給出準確下膠計量值，只可作為輔助測量方法，不能獨立測量。

因?qū)嶒炂谙尴拗?，本實驗無法給出在通常瓶儲條件下，各方法所測量的下膠計量所能保證的蛋白質(zhì)穩(wěn)定時間期限，且未找到相關(guān)文獻，所以有待于后續(xù)實驗加以確認。

[1]李艷敏,趙樹欣.不同酒類澄清劑的澄清機理與應(yīng)用[J].中國釀造,2008(1)：1-4.

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中國酒業(yè)協(xié)會白酒文化國際推廣委員會9月13日在北京成立

本刊訊：據(jù)《中國酒業(yè)新聞》報道，2017年9月13日，“中國酒業(yè)協(xié)會白酒文化國際推廣委員會”成立大會在北京正式召開。會議由中國酒業(yè)協(xié)會副理事長兼秘書長宋書玉主持，中國酒業(yè)協(xié)會理事長王延才、商務(wù)部流通產(chǎn)業(yè)促進中心主任路政閩、商務(wù)部流通產(chǎn)業(yè)促進中心統(tǒng)計與信息化處副處長王水平、貴州茅臺酒股份有限公司銷售公司董事長王崇林、五糧液股份有限公司副總經(jīng)理朱忠玉、洋河股份(蘇酒集團)副總經(jīng)理張學(xué)謙、山西杏花村國貿(mào)投資有限責(zé)任公司董事長潘杰等20多位嘉賓與企業(yè)領(lǐng)導(dǎo)出席會議。

會議宣布成立中國酒業(yè)協(xié)會白酒文化國際推廣委員會。與會專家與領(lǐng)導(dǎo)還結(jié)合企業(yè)的實際情況，對中國白酒“走出去”的進展情況及經(jīng)驗進行了溝通與交流，并就白酒“國際化”所面臨的問題，以及如何“走出去”提出了工作建議。

據(jù)悉，為滿足我國酒行業(yè)的發(fā)展需要，進一步加強協(xié)會組織建設(shè)，細化服務(wù)領(lǐng)域，提升協(xié)會服務(wù)職能，經(jīng)中國酒業(yè)協(xié)會第五屆理事會第五次(擴大)會議討論通過，決定成立中國酒業(yè)協(xié)會白酒文化國際推廣委員會，組織關(guān)聯(lián)企業(yè)，推動中國白酒國際化，向世界傳播中國白酒的文化底蘊和消費方式，深入分析國際酒類消費市場，建立白酒國際技術(shù)標準體系，探索中國白酒國際化的表達方式，促進白酒在國際市場、國際領(lǐng)域健康持續(xù)發(fā)展。（江源薦，黃筱鸝編輯）

來源：中國酒業(yè)新聞 2017-09-14

Comparison of the Methods for Determination of the Use Level of Bentonite in Kiwi Fruit Wine

GUO Jie1,2,3,SUN Zhongli1,2,3,CAI Haiyan1,2,3,YU Hang1,2,3,ZHANG Ying1,2,3and ZHANG Yi1,2,3
(1.Sichuan Food Fermentation Industry Research and Design Institute,Chengdu,Sichuan 611130;2.Sichuan Liquor Making Bio-technology&Application Key Laboratory,Chengdu,Sichuan 611130;3.National Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing,Luzhou,Sichuan 646000,China)

Hazes,gloss loss and precipitate often occur in fruit wine during shelf period due to physical and chemical reasons or microbial instability.Such phenomena will badly influence the sensory quality of fruit wine and its sales.In practice,bentonite is commonly used to eliminate the haze/precipitate induced by unstable proteins.In order to avoid excessive/insufficient use of bentonite,the methods including trechloroacetic acid test(TCA),heat test,and alcohol precipitation test were adopted respectively to evaluate the clarifying effects of bentonite.Through the comparison of the three methods,we found out that the use level of bentonite measured by TCA was higher than that measured by heat test;6 h heat test was recommended in high-temperature area instead of 30 min heat test;alcohol precipitation test could not determine the use level of bentonite in the experiment.

kiwi fruit wine;protein stability;clarification;bentonite

TS262.7；TS261.4

A

1001-9286（2017）10-0047-05

10.13746/j.njkj.2017242

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（2017JY0214）。

2017-09-11

郭杰（1973-），男，工程師，長期從事食品發(fā)酵工程相關(guān)工作。

孫中理（1987-），男，酒類研究學(xué)碩士，工程師，長期從事果酒、葡萄酒工藝研究工作。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-09-21；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170921.1505.001.html。