趙剛，劉微微，高偉瑋，馬潔

不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)的間充質干細胞成骨再生相關基因的比較

趙剛，劉微微，高偉瑋，馬潔

（天津市康婷生物工程有限公司，天津 天津 300385）

目的 比較血小板裂解物和胎牛血清培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞和胎盤間充質干細胞成骨再生相關基因的表達情況。方法 采用a-MEM+胎牛血清和a-MEM+血小板裂解物+抗壞血酸培養(yǎng)骨髓來源間充質干細胞、臍帶來源間充質干細胞和胎盤來源間充質干細胞。CCK8法檢測兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的三種間充質干細胞的增殖能力；流式鑒定兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的P3代間充質干細胞表型；RT-qPCR法檢測P3代間充質干細胞骨再生關鍵因子（RUNX2、Osterix、OPN）的基因表達情況。結果 兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的P3代間充質干細胞流式鑒定陽性率均高于98%，陰性率均低于2%；a-MEM培養(yǎng)液+血小板裂解物+抗壞血酸培養(yǎng)出的間充質干細胞，其決定成骨再生相關基因的表達均顯著性高表達。結論 a-MEM培養(yǎng)液+血小板裂解物+抗壞血酸培養(yǎng)體系培養(yǎng)出的間充質干細胞可作為骨組織再生的種子細胞應用于骨缺損修復。

間充質干細胞；多向分化；骨缺損

骨組織工程技術被認為是治療大面積骨缺損的有效手段，其中種子細胞是骨組織工程的重要內容[1-2]。經研究證實間充質干細胞具有多向分化潛能，體外在一定條件下可誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神經細胞等，因其具有良好的成骨分化性能而受到研究人員的重點關注[3-6]。然而，間充質干細胞應用于骨組織工程治療骨缺損，需要將其誘導分化為成骨細胞后方可應用。間充質干細胞體外誘導分化為成骨細胞需要一個較長的過程，并且在誘導分化的過程中間充質干細胞的增殖能力、活力等都有所下降，不利于其發(fā)揮治療骨缺損的作用[7-9]。因此，本研究從間充質干細胞的培養(yǎng)體系入手，改進間充質干細胞的培養(yǎng)體系，通過細胞水平、分子水平檢驗培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞（BMSCs）、臍帶間充質干細胞（UC-MSCs）和胎盤間充質干細胞（P-MSCs）中成骨再生關鍵因子的表達情況，為骨組織工程的種子細胞培養(yǎng)方式的選擇提供真實可信的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 a-MEM培養(yǎng)基、磷酸緩沖液（Hyclone公司）；胎牛血清（百靈公司）；青鏈霉素（華北制藥）；CCK8（上海同仁）；I型膠原酶、胰蛋白酶、堿性磷酸酶試劑盒、茜素紅（sigma）；Trizol（invitrogen公司）；real-time PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMII、反轉錄試劑盒PrimScriptTM RT Master Mix（TakaRa公司）；CD14-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE（BD公司）；Ficoll淋巴分離液（GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)：用磷酸緩沖液沖洗骨髓，1 500 rpm離心5 min，去上清；加入與沉淀等體積的磷酸緩沖液，混合均勻；按照骨髓：Ficoll=1:1的體積比例，將骨髓緩慢加入Ficoll液面上，2 000 rpm離心20 min；吸取間白膜層單核細胞，加入磷酸緩沖液沖洗，1 500 rpm離心5 min，棄上清；分別用a-MEM+10%FBS+青鏈霉素（a-MEM+FBS）和a-MEM+5%血小板裂解物+50 mmol/L抗壞血酸+青鏈霉素（a-MEM+PL）于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4 d后第1次換液，以后每3天換1次液。待細胞長至80%培養(yǎng)瓶面積時傳代。

臍帶間充質干細胞的分離培養(yǎng)：無菌條件下剝離臍帶組織的外膜和臍帶組織內動、靜脈，分離出華通氏膠并剪碎至2～3 mm3，將剪碎的華通氏膠組織塊貼于培養(yǎng)瓶底面，2 h后向培養(yǎng)瓶內添加適量的兩種培養(yǎng)液，1 w之后換液；根據組織塊周圍爬出細胞的情況消化傳代。

胎盤間充質干細胞的分離培養(yǎng)：無菌條件下去除胎盤組織羊膜，分離出靠近胎兒側胎盤小葉組織并剪碎至4～5 mm3，用磷酸緩沖液沖洗組織至發(fā)白，向組織中加入1%的IV型膠原酶于37℃消化4 h，1 500 rpm離心10 min，磷酸緩沖液重懸沉淀，再次于1 500 rpm離心5 min，收集沉淀；采用兩種培養(yǎng)液重懸沉淀并計數，將細胞接種至培養(yǎng)瓶中于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3 d后第1次換液，以后每3天換液1次。待細胞長至80%培養(yǎng)瓶面積時傳代。

1.2.2 細胞增殖能力 取P3代上述三種MSCs，并以2×103個/孔接種至96孔板，采用CCK8法連續(xù)7 d測定其吸光值。

1.2.3 細胞表型的鑒定 三種間充質干細胞表型鑒定：取P3代間充質干細胞，通過流式細胞儀檢測三種細胞表面標志物CD14、CD34、CD44、CD45、CD90和CD105的表達。

1.2.4 分子水平比較 采用Trizol法提取兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的P3代三種MSCs的RNA，按照反轉錄試劑盒合成cDNA，然后進行RT-qPCR。

表1 3種細胞骨再生相關基因PCR引物Table 1 The PCR primer of osteogenesis-related genes

RT-qPCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s；55退火30 s；72延伸45 s；39個循環(huán)。

2 結果

2.1 顯微鏡下觀察兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的三種MSCs形態(tài)P3代細胞通過倒置顯微鏡觀察到三種MSCs在兩種培養(yǎng)體系下均呈長梭狀，呈旋渦式生長。見圖1。

圖1 三種MSCs倒置顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)Figure 1 Three MSCs cell morphology

2.2 三種MSCs增殖能力比較 兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的三種P3代MSCs傳代后1～3 d處于潛伏期，此時細胞沒有明顯的增殖；3～5 d進入對數生長期；5 d之后細胞進入平臺期。見圖2。

圖2 兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的三種MSCs增殖曲線Figure 2 Three MSCs Cell growth curve

2.3 流式細胞儀檢測兩種培養(yǎng)體系下培養(yǎng)的三種MSCs兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的三種MSCs表面標志物陽性率均高于98%，陰性率均低于2%。見圖3。

PL培養(yǎng)的BMSCs、UC-MSCs和P-MSCs流式檢測結果）Figure 3 The Passage three MSCs flow cytometry analysis

2.4 RT-qPCR檢測兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的三種MSCs成骨再生相關因子的基因表達 a-MEM+血小板裂解物培養(yǎng)的三種MSCs成骨再生分化蛋白OPN基因均顯著性高表達，骨成熟的調控基因RUNX2和Osterix基因亦均顯著性高表達。見圖4。

*P＜0.01 PL compared with FBS圖4 Q-PCR檢測兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的三種MSCs OPN、RUNX2和Osterix基因的表達Figure 4 The OPN,RUNX2 and osterix gene expression from the three MSCs cultured by different medium

3 討論

目前，骨組織工程被認為是最有希望治愈大面積的骨缺損。骨組織工程是由支架材料和種子細胞構成。種子細胞的選擇十分重要，而MSCs具有低免疫原性、多向分化的潛能且具有良好的成骨分化性能，被認為是潛在的一類種子細胞。經研究骨組織修復需要幾個關鍵的因子的參與。骨橋蛋白（OPN）是骨再生早期的代表性因子；RUNX2和Osterix是骨再生過程中極為重要的兩個轉錄因子，是調控成骨細胞分化和成熟的調控基因[10-12]。

有報道稱脂肪來源的MSCs經成骨誘導后在不同動物模型大面積骨缺損的修復中均顯示出良好的成骨效果[14-15]。但是MSCs經過成骨誘導后，其細胞增殖能力、活力等都明顯降低[3，8]。如果將MSCs應用于骨組織工程，其細胞內決定成骨再生的基因處于低表達狀態(tài)，不能及時發(fā)揮其成骨能力。

因此，本研究采用血小板裂解物替代傳統(tǒng)的胎牛血清來培養(yǎng)BMSCs、UC-MSCs和P-MSCs，應用含血小板裂解物的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的MSCs依然保持著長梭形，局部呈漩渦式生長。由此可以看出采用血小板裂解物培養(yǎng)的MSCs與傳統(tǒng)的胎牛血清培養(yǎng)的MSCs從形態(tài)上沒有顯著性差異。通過流式鑒定比較兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的MSCs，在表型方面無顯著性差異，說明采用血小板裂解物培養(yǎng)的三種MSCs依然保持著細胞的干性。RT-qPCR的方法檢驗兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)出的三種MSCs成骨再生相關基因RUNX2、Osterix和OPN的表達，可以看出含血小板裂解物的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的細胞，其調控成骨再生的調控基因（RUNX2、Osterix）和骨再生的早期因子基因（OPN）的表達均顯著性高于胎牛血清培養(yǎng)的MSCs。由此說明含血小板裂解物的培養(yǎng)體系可促進MSCs成骨再生關鍵因子的高表達。

綜上所述，本研究比較兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的MSCs，發(fā)現含有血小板裂解物的培養(yǎng)體系培養(yǎng)出的MSCs不僅維持了細胞的干性，而且還促進了MSCs內成骨再生關鍵因子基因的高表達。

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Comparison on the osteogenesis regeneration genes of different mesenchymal stem cells cultured by different culture medium

Zhao Gang,Liu Wei-wei,Gao Wei-wei,Ma Jie
（Tianjin Kangting Biotechnology Company Limited,Tianjin,Tianjin,00385,China）

Objective The purpose of this study was to find the difference of the osteogenesis genetypes that Bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs),human umbilical cord mesenchymal stem cells(UC-MSCs)and human placental mesenchymal stem cells were cultured by Platelet lysate and fetal bovine serum.Methods The three MSCs was cultured in a-MEM medium containing 10%fetal bovine serum and containin 5%platelet lysate.Cell growth curve was drawn by CCK8 detected,and the cell surface antigens were measured using flow cytometry.To further explore the difference in osteogenesis genetypes,including RUNX2,Osterix and osteopontin(OPN),were analyzed by RT-qPCR.Results Cell growth curve analysis indicated that three MSCs were in the exponential stage at 3 days following incubation through two curture medium.Flow cytometry analysis showed that more than 98%cells were positive for CD44,CD90 and CD105.RT-qPCR showed that the three MSCs in the different medium PL group higher expression levels of osteogenic markers including RUNX2,Osterix and OPN when compared with FBS.Conclusion The MSCs could be as bone tissue regeneration seed cells which cultured by PL medium for the treatment of bone defects.

Mesenchymal stem cells;Multiple differentiation;Bone defects

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.27.007

天津市自然科學基金（14JCYBJC43900）通訊作者：馬潔，E-mail：biocare@ktibs.com