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(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083;3.大連東霖食品股份有限公司,遼寧大連 116101)

響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合乳酸菌抑制熒光假單胞菌作用

孫夢(mèng)桐1,馬歡歡1,呂欣然2,林洋1,白鳳翎1,*,勵(lì)建榮1,宋強(qiáng)3

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083;3.大連東霖食品股份有限公司,遼寧大連 116101)

目的:優(yōu)化抑制熒光假單胞菌的復(fù)合乳酸菌組合。方法:應(yīng)用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法篩選對(duì)熒光假單胞菌具有協(xié)同抑制作用的復(fù)合乳酸菌,通過響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果:從11組復(fù)合乳酸菌中篩選獲得LactobacillusplantarumDY4-2、Lb.sakeiYP4-5和Lb.sakeiLY1-6組合的抑菌作用最強(qiáng),對(duì)熒光假單胞菌的抑菌直徑為25.29 mm,比DY4-2、YP4-5和LY1-6單菌株分別高出2.93、4.80和5.35 mm。利用Box-Behnken進(jìn)行三因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以抑菌直徑為響應(yīng)值進(jìn)行分析,優(yōu)化最佳條件為:菌株DY4-2、YP4-5和LY1-6復(fù)合比 2∶3∶1、培養(yǎng)溫度25 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為48 h,優(yōu)化的抑菌直徑為25.84 mm。結(jié)論:乳酸菌復(fù)合可有效增加菌株間的協(xié)同作用,增加對(duì)熒光假單胞菌的抑菌活性,為研發(fā)高效控制水產(chǎn)品腐敗菌乳酸菌生物制劑提供理論依據(jù)。

復(fù)合乳酸菌,熒光假單胞菌,抑菌作用,響應(yīng)面,優(yōu)化

熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)可引起低溫條件下魚類、蝦和蟹等水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)[1-2]。崔方超等[2]從冷藏大菱鲆體表分離獲得導(dǎo)致魚體腐敗的特定腐敗菌菌株P(guān)001,經(jīng)鑒定為Pseudomonasfluorescens。同時(shí),天然魚類腸道也是拮抗性乳酸菌的主要來源,Zhang等[3]從黑鯛魚腸道中分離獲得1株乳酸菌Leuconostoclactis對(duì)Proteusvulgaris、EscherichiacoliO157和Salmonellatyphimurium抑菌直徑分別為13.30、13.70、12.70 mm。繆璐歡等[4]研究從鯉魚腸道中分離出對(duì)EscherichiacoliO157∶H7具有較強(qiáng)拮抗活性的菌株LactobacillussakeiLY-19和LactobacillusplantarumLY-21,其抑菌直徑分別為15.98 mm和16.32 mm。Kaynar等[5]從紅鯛魚腸道中分離獲得菌株LactobacillusxylosusHC9對(duì)目標(biāo)菌BacillusmegateriumP4具有較強(qiáng)的抑制作用。本研究前期應(yīng)用從鱸魚腸道獲得LactobacillussakeiLY1-6對(duì)P.fluorescens進(jìn)行抑制作用研究,并已取得良好效果[6]。但尚未應(yīng)用復(fù)合乳酸菌對(duì)大菱鲆中優(yōu)勢(shì)腐敗菌P.fluorescens進(jìn)行抑菌作用研究。

表1 海魚源性乳酸菌的11種不同組合Table 1 The 11 different composition of LAB derived marine fish

復(fù)合乳酸菌是將兩種或兩種以上的乳酸菌菌株混合后共培養(yǎng),其發(fā)酵能力和抑菌效果均強(qiáng)于單株乳酸菌[7]。復(fù)合乳酸菌在食品生產(chǎn)和保鮮中的應(yīng)用已有相關(guān)報(bào)道[8]。徐安書等[9]研制莖瘤芥葉胡蘿卜混合汁復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飲料,發(fā)現(xiàn)用嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌按1∶1∶1比例接種量2%研制的活菌型蔬菜汁復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飲料,在4 ℃低溫條件下可保存1個(gè)月。唐文靜等[10]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合乳酸菌(LactobacilluscaseiLC1、LactobacillusplantarumLP1和乳酸菌L3)對(duì)Pseudomonasfragi和Shewanellaputrefacens抑菌效果強(qiáng)于單株乳酸菌,且4 ℃冷藏條件下與單株乳酸菌相比,復(fù)合乳酸菌有效延長(zhǎng)了冷藏海鱸魚塊貯藏期。

響應(yīng)面法(response surface methodology,RSM)基于數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)合,以體系的響應(yīng)作為一個(gè)或多個(gè)因素的函數(shù),擬合獲得二次多項(xiàng)回歸方程,并運(yùn)用圖形將函數(shù)關(guān)系表示出,后選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)化條件[11]。可有效、快速地確定多因子系統(tǒng)的最優(yōu)條件,已廣泛應(yīng)用于各類發(fā)酵條件和工藝參數(shù)等條件的優(yōu)化[12-14]。

本文利用來源于海魚腸道中無交叉拮抗作用的乳酸菌為出發(fā)菌株,篩選對(duì)熒光假單胞菌具有協(xié)同抑制作用的乳酸菌組合。采用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合乳酸菌的菌量比、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等因素,以增強(qiáng)復(fù)合乳酸菌的抑菌效果,旨在為應(yīng)用乳酸菌生物防腐劑控制水產(chǎn)品中熒光假單胞菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

乳酸菌菌株及來源 本實(shí)驗(yàn)室前期從海水魚類腸道中分離獲得的乳酸菌,S1(LactobacillusplantarumLP1-4)分離于大菱鲆腸道,S2(LactobacillusplantarumDY4-2)分離于刀魚腸道,S3(LactobacillussakeiYP4-5)分離于牙鲆腸道,S4(LactobacillussakeiLY1-6)分離于鱸魚腸道;指示菌PseudomonasfluorescensP001,分離于大菱鲆體表;MRS培養(yǎng)基、MRS營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB肉湯、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;脫脂乳 上海鈺博生物科技有限公司。

PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;DL-CJ-2N型超級(jí)潔凈工作臺(tái) 東聯(lián)哈爾(北京)儀器制造有限公司;LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;賽福智能生化培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠;GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;IKA旋渦振蕩器 北京卓信偉業(yè)科技有限公司;IKA磁力攪拌器 北京悠揚(yáng)機(jī)電設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗性乳酸菌測(cè)定 將保藏于-80 ℃ 4株乳酸菌分別接種于10%脫脂乳37 ℃活化12 h,后接種于MRS平板上連續(xù)培養(yǎng)2代至正常代謝水平。挑取活化后乳酸菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,以熒光假單胞菌為指示菌,參照alomskiené等[15]利用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法用制備好的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。4株乳酸菌經(jīng)無菌生理鹽水10倍梯度稀釋,制成約106CFU/mL菌懸液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑制熒光假單胞菌乳酸菌的交叉拮抗實(shí)驗(yàn) 參照李曼等[16]方法并稍作修改,采用交叉拮抗法篩選4株乳酸菌分別選用其中一株乳酸菌為供試菌株,其余3株乳酸菌菌株為目標(biāo)菌。按照1.2.1進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 抑制熒光假單胞菌復(fù)合乳酸菌抑菌實(shí)驗(yàn) 4株乳酸菌按排列組合C(n,m)得到11種混合乳酸菌組合(見表1),組內(nèi)按1∶1、1∶1∶1和1∶1∶1∶1的比例將制備好的乳酸菌菌懸液混合,后分別以2%接種量置于10 mL MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h。按照1.2.1進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 單因素及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 菌量比對(duì)熒光假單胞菌抑制作用的影響 將上述1.2.3實(shí)驗(yàn)得到對(duì)熒光假單胞菌具有最佳抑菌效果的組合進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)三因素三水平見表2。獲得不同配比的乳酸菌組合,按照表中不同乳酸菌菌量的配比將制備好的乳酸菌菌懸液進(jìn)行混合,后分別以2%的接種量置于10 mL MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h,按照1.2.1進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

表2 三因素三水平正交表Table 2 The orthogonal table of three factors and three levels

表4 乳酸菌對(duì)熒光假單胞菌抑制作用Table 4 The inhibitory activity of LAB against P. fluorescens

1.2.4.2 培養(yǎng)溫度對(duì)熒光假單胞菌抑制作用的影響 選擇培養(yǎng)溫度20、25、28、30、35、37 ℃,取200 μL復(fù)合乳酸菌懸液(菌量比為2∶3∶1)于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中,分別在不同的培養(yǎng)溫度條件下培養(yǎng)48 h,取發(fā)酵液按照1.2.1進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)熒光假單胞菌抑制作用的影響 選擇培養(yǎng)時(shí)間為12、24、32、48、60、72 h,取200 μL復(fù)合乳酸菌菌液(復(fù)配比例2∶3∶1)接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中,25 ℃靜置培養(yǎng),取不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液按照1.2.1進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化抑菌條件 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取菌株DY4-2、YP4-5 和LY1-6菌量比、溫度和時(shí)間這3個(gè)因素作為多因素交叉組合實(shí)驗(yàn)的考察因素,以抑菌直徑作為響應(yīng)值,利用響應(yīng)面方法中的Box-Behnken Design方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)模型,最終確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。每一個(gè)自變量的低、中、高水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼。實(shí)驗(yàn)因素水平編碼見表3。

表3 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table 3 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3次,數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 18.0和Design Expert 8.06軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1拮抗性乳酸菌測(cè)定

4株乳酸菌發(fā)酵液對(duì)熒光假單胞菌的抑菌結(jié)果如表4所示,從中可看出,4株乳酸菌對(duì)熒光假單胞菌均具有較好的抑制作用,其中菌株DY4-2 抑菌效果最強(qiáng),抑菌圈直徑為20.36 mm;LP1-4次之,抑菌圈直徑為19.61 mm;菌株LY1-6和YP4-5相對(duì)較弱。

2.2乳酸菌菌株間的交叉抑制作用

圖1是乳酸菌菌株間交叉抑制測(cè)定結(jié)果(指示菌:LP1-4;供試菌:DY4-2、YP4-5和LY1-6),從中可看出,菌株DY4-2、YP4-5和LY1-6均無抑菌圈出現(xiàn),表明菌株LP1-4與其余3株菌間無抑制作用。后分別以菌株DY4-2、LY1-6和DY4-2作為指示菌,也均無抑制作用(圖均未列出)。結(jié)果表明,4株乳酸菌均無交叉抑制作用。因此,可作為復(fù)合乳酸菌實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)菌株。

圖1 乳酸菌菌株間交叉拮抗結(jié)果Fig.1 Cross antagonistic results of strain of lactic acid bacteria

2.3抑制熒光假單胞菌復(fù)合乳酸菌抑菌實(shí)驗(yàn)

4株乳酸菌按排列組合C(n,m)得到11種混合乳酸菌組合抑菌結(jié)果圖2所示,A圖是第1組、第8組和第11組抑菌效果圖,從中可看出,第8組復(fù)合乳酸菌抑菌直徑明顯大于其余2組,對(duì)熒光假單胞菌抑制作用最強(qiáng),抑菌直徑為25.29 mm。B圖為11組的復(fù)合乳酸菌抑菌結(jié)果,復(fù)合乳酸菌的第1～5組和10～11組對(duì)熒光假單胞菌抑菌效果較差,抑菌圈直徑均處于20.00 mm左右,而第6～9組的復(fù)合乳酸菌抑菌效果較強(qiáng),抑菌圈直徑均高于22.00 mm。第8組抑菌作用最強(qiáng),其次是第6、7和9組,抑菌直徑分別為22.45、22.11、23.05 mm。因此,選用第8組(S2:菌株DY4-2、S3:菌株YP4-5 和S4:菌株LY1-6)作為最佳復(fù)合乳酸菌組合進(jìn)行下一步研究。

圖2 乳酸菌不同組合對(duì)熒光抑菌抑菌結(jié)果Fig.2 The results of the different composes of LAB on P. fluorescent 注:第1組:S1、S2;第8組:S2、S3、S4;第11組:S1、S2、S3、S4。

2.4單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.4.1 復(fù)合乳酸菌不同菌量比的抑菌實(shí)驗(yàn) 采用三因素三水平設(shè)計(jì)最佳抑菌效果的乳酸菌組合(A:菌株DY4-2,B:菌株YP4-5,C:菌株LY1-6),如表5所示,為不同菌量比對(duì)熒光假單胞菌抑制結(jié)果。從中可以看出,第6組A2B3C1(2∶3∶1)抑菌作用最強(qiáng),抑菌直徑為24.25 mm。因此,確定復(fù)合乳酸菌第6組為最適菌量比。

表5 不同配比的乳酸菌組合對(duì)熒光假單胞菌抑制影響Table 5 Antibacterial effect of the different proportions of LAB on P. fluorescent

2.4.2 培養(yǎng)溫度對(duì)抑制熒光假單胞菌的影響 將菌株DY4-2、YP4-5和LY1-6按菌量比2∶3∶1混合后接種于MRS培養(yǎng)基中,不同溫度下培養(yǎng)48 h后乳酸菌發(fā)酵液的抑菌結(jié)果如圖3所示。從中可看出,隨著培養(yǎng)溫度的升高,復(fù)合乳酸菌抑菌效果呈先上升再下降、再上升又下降的趨勢(shì),當(dāng)溫度小于35 ℃時(shí),對(duì)熒光假單胞菌的抑菌效果較強(qiáng),抑菌圈直徑均高于23.00 mm,溫度37 ℃時(shí),抑菌圈直徑維持在20.00 mm左右。表明復(fù)合乳酸菌在較低的溫度下培養(yǎng)產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)對(duì)熒光假單胞菌具有較強(qiáng)抑制作用。培養(yǎng)溫度25 ℃抑菌效果最好,抑菌直徑為24.26 mm。因此,確定復(fù)合乳酸菌培養(yǎng)溫度為25 ℃為抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的最適培養(yǎng)溫度。

圖3 不同溫度的復(fù)合乳酸菌對(duì)熒光假單胞菌抑菌結(jié)果Fig.3 The bacteriostatic results of different temperatures of LAB on P. fluorescent

2.4.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑制熒光假單胞菌的影響 復(fù)合乳酸菌(菌量比2∶3∶1)接種于MRS培養(yǎng)基后置于25 ℃培養(yǎng)不同時(shí)間,乳酸菌發(fā)酵液的抑菌結(jié)果如圖4所示。從中可看出,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸菌發(fā)酵液對(duì)熒光假單胞菌抑菌效果逐漸上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)培養(yǎng)48 h時(shí),抑菌圈直徑為24.39 mm,培養(yǎng)時(shí)間60～72 h時(shí),抑菌圈直徑維持在23.70 mm左右。表明復(fù)合乳酸菌培養(yǎng)48 h時(shí),抑菌活性物質(zhì)已完全形成。因此,確定復(fù)合乳酸菌抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的最適培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

圖4 不同時(shí)間的復(fù)合乳酸菌對(duì)熒光假單胞菌抑菌結(jié)果Fig.4 The bacteriostatic results of different time of LAB on P. fluorescent

2.5響應(yīng)面對(duì)復(fù)合乳酸菌抑制熒光假單胞菌抑菌條件的優(yōu)化

2.5.1 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件 通過Design Expert 8.0.6中的Box-Behnken 對(duì)菌量比(A)、溫度(B)和時(shí)間(C)進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn),所得的中心組合方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

表6 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression mode

注:**極顯著(p<0.01),*顯著(p<0.05)。

以抑菌直徑(Y)為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken Design(BBD)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表6數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到抑菌圈直徑與菌量比(A)、溫度(B)和時(shí)間(C)二次多項(xiàng)回歸方程:Y=20.94-0.21A-0.44B-1.26C+0.39AB+0.10AC-0.007BC+0.62A2+1.03B2+1.14C2。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表7所示。

從表7可看出,模型F=8.94,p<0.01,說明該回歸方程極顯著。失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05),說明模型所擬合的二次回歸方程與實(shí)際相符合。能正確反映抑菌圈直徑Y(jié)與A、B和C之間的關(guān)系?；貧w模型可以較好地對(duì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中的各種實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明,一次項(xiàng)的培養(yǎng)時(shí)間和二次項(xiàng)的溫度和時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑有極顯著影響(p<0.01)。決定系數(shù)R2=0.9200,說明模型的擬合度好,抑菌圈直徑的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合相關(guān)性。方差分析結(jié)果表明,各因素對(duì)抑菌圈直徑的影響順序依次為時(shí)間、溫度和菌量比。

圖5為菌量比A、培養(yǎng)溫度B和培養(yǎng)時(shí)間C三因素的兩兩交互作用分析所得到的交互因子響應(yīng)曲面圖。a圖中在等高線區(qū)域中心,抑菌直徑最小,由中心向邊緣逐漸增大。若底部投影為橢圓形,則兩因素交互作用顯著,由此可知溫度與菌量比之間的交互作用顯著,菌量比與培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間之間的交互作用不顯著。b和c圖顯示了C由高水平到低水平變化過程中等高線的數(shù)目明顯多于A和B,說明培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌直徑的影響顯著。對(duì)多元二次回歸方程進(jìn)行求偏導(dǎo),可以得到:Y=-0.21+0.39B+0.10C+1.24A;Y=-0.44+0.39A-0.007C+2.06B;Y=-1.26C+0.10A-0.007B+2.28C;聯(lián)立方程組,解得復(fù)合乳酸菌對(duì)熒光假單胞菌抑菌活性最優(yōu)條件的編碼值為:A=-1,B=-1,C=-1。即在菌株DY4-2、YP4-5和LY1-6菌量比為2∶3∶1,培養(yǎng)溫度為25 ℃,培養(yǎng)時(shí)間48 h時(shí),模型預(yù)測(cè)復(fù)合乳酸菌對(duì)熒光假單胞菌抑菌直徑最大值為26.13 mm。

圖5 交互因子的響應(yīng)面曲面圖Fig.5 Response surface graph of interaction factors

2.5.2 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)值(Y)最大值時(shí)各因子水平為A=-1,B=-1,C=-1。對(duì)應(yīng)的最佳培養(yǎng)條件為菌株DY4-2、YP4-5和LY1-6菌量比為2∶3∶1,培養(yǎng)溫度為25 ℃,培養(yǎng)時(shí)間48 h時(shí),在此條件下預(yù)測(cè)的最大值為26.13 mm。為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,依據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),得到復(fù)合乳酸菌對(duì)熒光假單胞菌抑菌圈直徑為25.84 mm,與模型預(yù)測(cè)值相差1%,與理論值基本相符。

3 結(jié)論

通過Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法,利用Design-Expert統(tǒng)計(jì)軟件能夠可靠地進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)以及數(shù)據(jù)處理。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用這一方法對(duì)復(fù)合乳酸菌對(duì)熒光假單胞菌的抑菌活性進(jìn)行優(yōu)化,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平的實(shí)驗(yàn),確定復(fù)合乳酸菌抑制熒光假單胞菌的培養(yǎng)條件為:乳酸菌組合(S2:菌株DY4-2、S3:菌株YP4-5 和S4:菌株LY1-6)以2∶3∶1菌量比,在25 ℃條件下培養(yǎng)48 h 時(shí),抑菌直徑為25.84 mm,與模型預(yù)測(cè)值相差1%,該模型可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)際情況。因此,菌株DY4-2、YP4-5 和LY1-6復(fù)合后可有效增加抑制熒光假單胞菌能力,旨在為應(yīng)用乳酸菌生物防腐劑控制水產(chǎn)品中熒光假單胞菌提供理論依據(jù)。

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OptimizationofantibacterialeffectofcomplexlacticacidbacteriaonPseudomonasfluorescensbyresponsesurfacemethodology

SUNMeng-tong1,MAHuan-huan1,LVXin-ran2,LINYang1,BAIFeng-ling1,*,LIJian-rong1,SONGQiang3

(1.College of Food Science and Technology,Bohai University;Food Safety Key Lab of Liaoning Province,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China;2.College of Biology Science and Technology,Beijing Forest University,Beijing 100083,China;3.Dalian Donglin Food Co.,Ltd.,Dalian 116101,China)

Objective:To optimize an efficient complex lactic acid bacteria(LAB)with strong antagonistic activity againstPseudomonasfluorescens. Methods:The complex LAB strains with synergic and antagonistic effects againstP.fluorescenswere screened using the method of Oxford cup agar diffusion. The complex LAB were optimized by response surface methodology. Results:The best inhibitory complex ofLactobacillusplantarumDY4-2,Lb.sakeiYP4-5 andLb.sakeiLY1-6 were screened from 11 groups of complex LAB againstP.fluorescens,and the inhibitory zone diameter reached 25.29 mm,which was higher 2.93,4.80 and 5.35 mm than strain DY4-2,YP4-5 and YP1-6 respectively.Three-factor-three-level experiments designs were developed by Box-Behnken,and the inhibitory zone diameter was used as the responsive values. The bacterial suspension of strain DY4-2,YP4-5 and YP1-6 combined with the ratio of 2∶3∶1,culture temperature 25 ℃ and culture time 48 h,which the inhibitory zone diameter againstP.fluorescenswas 25.84 mm in the optimum conditions. Conclusion:The complex LAB can largely increase the synergy between the strain and the inhibitory activity againstP.fluorescens,which can provide theoretical basis for the research and development efficient LAB biopreservation control ofP.fluorescensin aquatic products spoilage.

complex lactic acid bacteria;Pseudomonasfluorescens;antibacterial activity;response surface method;optimization

2017-02-14

孫夢(mèng)桐(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制，E-mail：daysunmengtong@163.com。

*通訊作者:白鳳翎(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制和食品微生物學(xué)，E-mail：baifling@163.com。

遼寧省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目(2015103020)；泰山學(xué)者藍(lán)色產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才團(tuán)隊(duì)支撐計(jì)劃項(xiàng)目 ( 魯政辦字(2015)19號(hào))。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)17-0119-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.023