趙會(huì)會(huì)， 方志剛,2， 馬 睿， 婁來(lái)清， 蔡慶生*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 江蘇 南京210095；2. 喀什大學(xué)， 新疆 喀什 844000；3. 江蘇省泰興市國(guó)土資源局， 江蘇 泰興 225400)

過(guò)去數(shù)十年以來(lái)，由于工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，如礦產(chǎn)開(kāi)發(fā)、污水灌溉、殺蟲(chóng)劑濫用及化肥過(guò)度施用，導(dǎo)致農(nóng)田土壤及水源受到污染，其中重金屬污染成為全球面臨的環(huán)境問(wèn)題之一[1]。2014年國(guó)家環(huán)境保護(hù)部和國(guó)土資源部的全國(guó)土壤污染調(diào)查報(bào)告顯示：全國(guó)土壤無(wú)機(jī)污染物超標(biāo)點(diǎn)位數(shù)占全部超標(biāo)點(diǎn)位的82.8%，其中鎘(Cd)被鑒定為一種主要的無(wú)機(jī)污染物，其位點(diǎn)超標(biāo)率達(dá)7.0%[2]。鎘在土壤中具有較強(qiáng)的移動(dòng)性，易被作物吸收并在可食部位積累，這不僅影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)，還可通過(guò)食物鏈給人類(lèi)健康帶來(lái)潛在威脅[3]。因此，農(nóng)田土壤鎘污染修復(fù)刻不容緩。目前，因治理重金屬污染土壤的物理、化學(xué)方法成本高且容易給環(huán)境帶來(lái)二次污染，不易大面積推廣，而成本低廉、環(huán)境友好植物修復(fù)技術(shù)受到廣泛關(guān)注[4-5]。然而，用于修復(fù)重金屬污染土壤的超積累植物因生長(zhǎng)緩慢、生物量低，植物體難以回收利用等問(wèn)題限制了其在實(shí)際中的應(yīng)用[5-6]。

植物根際促生細(xì)菌(PGPR)是生活在植物根際的一類(lèi)能促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治植物病害、提高農(nóng)作物產(chǎn)量的有益細(xì)菌[7]。目前已經(jīng)報(bào)道的根際促生菌主要包括芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、假單胞桿菌屬等[8]。植物根際促生菌可通過(guò)分泌生長(zhǎng)素、1-氨基-1-羧基環(huán)丙烷脫氨酶(ACCD)以及溶磷作用等促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[9-10]，增加其生物量；還可以通過(guò)分泌有機(jī)酸、生物表面活性劑等提高土壤中重金屬的生物有效性來(lái)增加植物對(duì)重金屬的吸收量，從而提高植物修復(fù)效率[11-12]。近年來(lái)，應(yīng)用植物聯(lián)合微生物修復(fù)重金屬污染土壤取得重要理論成果，已經(jīng)證明對(duì)油菜(BrassicanapusL.)、玉米(ZeamaysL.)等接種PGPR均可提高其對(duì)重金屬脅迫的耐受性[13-15]，但田間應(yīng)用仍相對(duì)匱乏。

一年生黑麥草(LoliummultiflorumLam.) 是一種重要的牧草，具有適應(yīng)性廣、生長(zhǎng)快和生物量大等特點(diǎn)[16]；有研究表明一年生黑麥草具有較高的生物乙醇轉(zhuǎn)化率，已經(jīng)被應(yīng)用到發(fā)酵等工業(yè)領(lǐng)域[17-18]。另有研究指出一年生黑麥草能富集鎘、銅等重金屬，可作為修復(fù)重金屬污染土壤的候選植物[19-20]。本研究試圖利用PGPR增強(qiáng)一年生黑麥草的耐鎘性和吸收積累鎘的能力，旨在為利用和修復(fù)重金屬污染土壤、避免與糧飼爭(zhēng)地、在重金屬污染土壤上開(kāi)發(fā)能源植物提供可行的調(diào)控途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

植物樣品采自云南個(gè)舊市雞街鎮(zhèn)(E 103°12′～103°16′、N 23°29′～23°33′)重金屬污染區(qū)。一年生黑麥草品種為'‘牧瑤’(IdyII)，由北京正道生態(tài)科技有限公司提供。

1.2 供試土壤

盆栽試驗(yàn)土壤取自江蘇省南京市玄武區(qū)某公園土，室內(nèi)風(fēng)干過(guò)2 mm篩。土壤理化性質(zhì)為：pH 7.35±0.07，速效磷39.95±0.28 mg·kg-1，速效鉀13.84±18.87 mg·kg-1，總鎘0.76±0.01 mg·kg-1，總銅30.72±0.66 mg·kg-1，總鉻56.10±0.75 mg·kg-1。

1.3 耐鎘植物根際促生細(xì)菌的分離篩選與鑒定

1.3.1菌株分離 用小刷子將植物樣品根際土刷下來(lái)，稱(chēng)取0.1 g土樣加到含有1 mL無(wú)菌水的滅菌離心管中。利用10倍稀釋法稀釋土壤菌懸液，分別從稀釋度為10-4，10-5，10-6的稀釋液中取0.1 mL菌懸液涂布在LB(Luria-Bertani)平板上，28℃培養(yǎng)72 h后，記錄細(xì)菌數(shù)量。從平板上隨機(jī)挑取不同表型的單菌落按常規(guī)方法純化后用滅菌牙簽依次挑至鎘濃度為0.1，1.0 和2.0 mM的LB平板上。選擇耐鎘能力較強(qiáng)、生長(zhǎng)穩(wěn)定的菌株轉(zhuǎn)至斜面4℃條件下保藏。

1.3.2耐鎘菌株促生特性鑒定 菌株發(fā)酵液中吲哚乙酸(IAA)的測(cè)定參考Gordon[21]的方法，ACC脫氨酶能力測(cè)定參考夏娟娟[22]的方法，溶磷能力的定性測(cè)定參考黃靜[23]的方法。

1.3.3復(fù)篩 菌懸液的制備：將具有促生特性的耐鎘根際菌活化后接入液體LB培養(yǎng)基中，30℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。3 000 r·min-1離心10 min后收集菌體，用無(wú)菌水洗滌后稀釋至OD600=1備用。

平皿促生試驗(yàn)：用10% H2O2對(duì)黑麥草種子進(jìn)行表面滅菌，浸泡15 min后用水洗凈。平皿中Cd2+濃度為100 uM，每個(gè)平皿隨機(jī)播入植物種子30顆，接種己制備好的菌懸液5 mL，對(duì)照用無(wú)菌水處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8天后測(cè)量根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.4菌株分類(lèi)地位鑒定 菌株總DNA的提取方法參考楊清[24]，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物(5′端引物序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；3′端引物序5'-TACCTTGTTACGACTT-3′) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行TA克隆，將含有目的基因的質(zhì)粒載體導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后再涂布于含有氨芐青霉素的選擇性平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，得到轉(zhuǎn)化菌落。挑選白色菌落(含重組質(zhì)粒)在無(wú)選擇抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并通過(guò)擴(kuò)增進(jìn)行重組子鑒定，選取電泳結(jié)果含有目的基因的大腸桿菌菌液，由南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中與相關(guān)序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.4 盆栽試驗(yàn)

1.4.1試驗(yàn)設(shè)計(jì) 盆栽試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓實(shí)驗(yàn)基地日光溫室內(nèi)進(jìn)行，土樣風(fēng)干后過(guò)1 cm篩。重金屬鎘以CdCl2·2.5H2O水溶液加入土中混合均勻，土壤鎘濃度參考Guo[25]關(guān)于黑麥草盆栽鎘處理的試驗(yàn)條件，并結(jié)合本課題組前期的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，使盆缽中土壤鎘終濃度為20±0.33 mg·kg-1，采用大小為19 cm×20 cm的塑料盆，每盆裝土約4 kg，自然平衡2周。以無(wú)菌水浸種為對(duì)照，以篩選后的菌株(A02、Oj06和Ps08)菌懸液為處理，浸種約2 h。設(shè)置3次重復(fù)。每盆播種30粒種子，萌發(fā)10天后間苗，每盆留生長(zhǎng)一致的苗10株。分別在播種10天、30天后在植物根系周?chē)尤胂鄳?yīng)的供試菌株的菌懸液(菌懸液制備同上)，每盆15 mL，對(duì)照接入等體積的無(wú)菌水。

1.4.2樣品的預(yù)處理及測(cè)定 60天后，記錄各處理黑麥草分蘗數(shù)、株高。將黑麥草沿土壤表面剪下分成地下和地上兩部分，用水沖洗干凈，測(cè)定各處理地上、根部的鮮重；后將黑麥草置于105℃烘箱內(nèi)殺青30 min，60℃下烘干至恒重，用于測(cè)定植物干重。同時(shí)收集各盆中根際土壤，風(fēng)干后按李強(qiáng)和劉銘[26-27]的方法測(cè)定土壤pH和有效態(tài)鎘含量。植物經(jīng)微波消解后用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀測(cè)鎘離子濃度。葉片丙二醛(MDA)含量測(cè)定參考李合生[28]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007整理數(shù)據(jù)，SPSS 20.0進(jìn)行方差分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鎘菌株的篩選及促生特性的鑒定

從不同植物根際土中共分離出136株細(xì)菌。在鎘濃度為2.0 mM的初篩培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的菌株共32株，其中具有產(chǎn)IAA能力的菌株共6株，產(chǎn)ACC 脫氨酶能力的菌株共7株，具有溶磷能力的菌株共8株。經(jīng)過(guò)平皿促生試驗(yàn)的復(fù)篩，選取A02，Oj06，Ps08做進(jìn)一步研究。3種菌株均具有溶磷能力，此外A02和Ps08還具有分泌生長(zhǎng)素的能力，Oj06具有產(chǎn)ACC 脫氨酶的能力(表1)。

表1 耐鎘菌株促生特性Table 1 Characteristics of cadmium-tolerant strains

2.2 根際菌A02，Oj06，Ps08的形態(tài)學(xué)特征及16SrDNA序列分析

測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST軟件與GenBank中其他菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合菌株的菌落和菌體特征將菌株鑒定到屬。 A02為熒光假單胞桿菌屬(Pseudomonassp.)，Oj06和Ps08為腸桿菌屬(Enterobactersp.)(表2)。

表2 菌株16S rRNA基因序列分析結(jié)果Table 2 The identification of the tested strains based on 16S rRNA gene analysis

2.3 耐鎘根際促生菌對(duì)一年生黑麥草植株生長(zhǎng)以及葉片中MDA含量的影響

不接菌(對(duì)照)植株的生長(zhǎng)受到明顯抑制，接種耐鎘促生菌株處理的植株分蘗數(shù)和株高均顯著(P<0.05)增加。 接菌A02，Oj06，Ps08的植株平均分蘗數(shù)分別比對(duì)照高31.67%，28.33%，26.65%，平均株高分別比對(duì)照高出18.44%，19.20%，18.62%(圖1)。表明耐鎘促生菌A02，Oj06，Ps08能夠有效促進(jìn)一年生黑麥草在鎘污染土地中的生長(zhǎng)。

圖1 鎘脅迫下不同菌株處理對(duì)一年生黑麥草分蘗數(shù)和株高的影響
Fig.1 Effects of strains on tiller number and shoot height of Lolium multiflorum Lam. under Cd stress
注：不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同
Note: Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level. The same below

與對(duì)照相比，不同菌株處理下一年生黑麥草地上部以及根干重均有所提高。接菌A02，Oj06，Ps08處理的黑麥草地上部干重與對(duì)照相比，分別增加了45.32%，38.63%，49.42%，差異均達(dá)顯著(P<0.05)水平(圖2)。結(jié)果表明：耐鎘促生菌株適度鎘污染條件下對(duì)一年生黑麥草有一定的促生作用，能夠在一定程度上緩解鎘脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制。

圖2 鎘脅迫下不同菌株處理對(duì)一年生黑麥草干重的影響
Fig.2 Effects of strains on dry weight of Lolium multiflorum Lam. under Cd stress

鎘脅迫下及接種耐鎘根際促生菌后，一年生黑麥草葉片中丙二醛含量變化如圖3所示。接種A02，Oj06，Ps08后，一年生黑麥草葉片中MDA含量分別比對(duì)照降低44.43%，41.28%，38.61%，差異達(dá)到顯著水平 (P<0.05)。由此可見(jiàn)，3株菌均能降低鎘脅迫下黑麥草葉片中的膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，從而可能緩解鎘對(duì)一年生黑麥草產(chǎn)生的毒害。

2.4 耐鎘根際促生菌對(duì)一年生黑麥草鎘吸收積累的影響

如表3所示，接種A02，Oj06和Ps08后，一年生黑麥草地上部和根系內(nèi)鎘濃度與對(duì)照相比無(wú)顯著變化。然而，接種不同耐鎘根際促生菌后，一年生黑麥草鎘吸收總量變化較為明顯。接種A02，Oj06，Ps08后，黑麥草地上部鎘吸收總量分別比對(duì)照增加了48.78%，33.98%和50.01%，差異達(dá)顯著水平 (P<0.05)；與對(duì)照相比，接種不同根際菌，黑麥草根系鎘積累總量亦有所增加，其中接種Oj06的處理增加了57.64%，差異顯著(P<0.05)。接種3株菌后，根際土壤中有效態(tài)鎘含量分別增加了19.14%，13.39%，7.48%，其中接種A02的處理達(dá)到顯著差異(P<0.05)。與對(duì)照相比，接種A02，Oj06，Ps08后，根際土壤pH分別下降3.52%，2.80%，1.76%，其中接種A02，Oj06的處理達(dá)到顯著差異(P<0.05)。

圖3 鎘脅迫下不同菌株處理對(duì)一年生黑麥草葉片MDA含量影響
Fig.3 Effects of strains on MDA content of Lolium multiflorum Lam. under Cd stress

表3一年生黑麥草鎘的吸收積累情況以及根際土壤有效態(tài)鎘含量與pH
Table 3 Influence of strains on Cd concentration and total Cd accumulation ofLoliummultiflorumLam. ,pH and extractable Cd concentration in the rhizosphere

不同處理Treatments鎘含量Cd concentration/μg·g-1單株鎘吸收總量Cd accumulation/μg·株-1地部 Shoot根系 Root地上部 Shoot根系 Root土壤有效態(tài)鎘含量Extractable Cd concentration/mg·kg-1土壤pHSoil pHCK17.58±1.04a176.34±20.56a4.27±0.29b21.26±3.67b12.58±0.56b7.39±0.06aA0218.63±3.26a193.37±5.27a6.36±0.47a31.96±3.54ab14.98±0.89a7.13±0.02bOj0617.04±0.95a192.28±5.59a5.73±0.13a33.51±2.40a14.26±0.32ab7.18±0.06bPs0817.80±1.25a171.03±3.86a6.41±0.31a29.16±2.96ab13.51±0.31ab7.26±0.02ab

注：同列不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)

Note:Different lowercase letters indicate significant difference between treatments at the 0.05 level

3 討論

近年來(lái)，有關(guān)土壤重金屬污染修復(fù)的研究不斷深入，利用微生物-植物聯(lián)合修復(fù)鎘污染土壤成為一種新的技術(shù)途徑。大量研究表明，PGPR可顯著促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物對(duì)重金屬的抗性，從重金屬污染土壤中分離到的PGPR常表現(xiàn)出較強(qiáng)的重金屬耐性[29-30]。

本研究鑒定了耐鎘根際促生菌，發(fā)現(xiàn)A02和Ps08具有較強(qiáng)的IAA分泌能力；Oj06能在以ACC為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明其具有ACC脫氨酶活性；3株菌均具有溶磷能力，這表明他們均具備潛在的促生能力。

Asghar等[31]將產(chǎn)IAA的促生菌接種到油菜(BrassicanapusL.)后，植株分枝數(shù)量和株高能夠顯著增加，這與本研究中一年生黑麥草分蘗數(shù)、株高顯著增加(圖1)的結(jié)果相似，其原因可能是PGPR能夠產(chǎn)生IAA，促進(jìn)植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育，可能增加土壤中的水分和養(yǎng)分的吸收，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)以提高植物的抗逆性[32]。從圖2可以看出，3株促生菌能顯著提高黑麥草地上部干重，這一結(jié)論與Jiang等[33]研究根瘤菌對(duì)番茄(SolanumlycopersicumL.)和玉米的結(jié)果較為相似。在逆境條件下，作為乙烯合成的前體會(huì)產(chǎn)生大量ACC，植物根際促生菌能通過(guò)合成ACCD將ACC分解成氨和α-丁酮酸，抑制植物體內(nèi)乙烯的大量生成，同時(shí)為植物提供氮源從而增加植物的生物量[9]。一年生黑麥草生物量的增加還可能與3株促生菌分泌IAA，ACC脫氨酶以及溶磷能力有關(guān)[32,34]。此外，一些植物促生菌能分泌有機(jī)酸，降低植物根圍土壤的pH值，將不溶性的磷轉(zhuǎn)變成可溶性的磷，使磷有效地溶解與吸收從而促進(jìn)植物生物量的增加[35]。

植物在逆境條件下，細(xì)胞質(zhì)膜中不飽和脂肪酸會(huì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)而產(chǎn)生丙二醛，是反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[36]。本研究中，促生菌處理下一年生黑麥草葉片中MDA含量顯著下降，表明接菌后降低了鎘對(duì)葉片細(xì)胞膜的損傷程度，從而減輕了黑麥草葉片中膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，這一結(jié)論與田野等[37]研究鎘污染土壤接種叢枝菌根真菌對(duì)黑麥草葉片中MDA含量影響的結(jié)果一致。

分析一年生黑麥草植株內(nèi)鎘含量，無(wú)論是地上部分還是根系，接菌后鎘含量有所提升但差異不顯著，這與劉莉華[38]等的報(bào)道相同，可能是由于接種促生菌后能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，提高植株的生物量，體內(nèi)吸收的鎘由此表現(xiàn)出一定的“稀釋”作用。本研究中，接種促生菌對(duì)一年生黑麥草鎘吸收的影響更多的體現(xiàn)在鎘積累方面。各接菌處理相比于對(duì)照鎘積累總量均顯著增加，這是由于植物根際促生菌增加了一年生黑麥草的生物量，從而也使其鎘積累總量增加。這一結(jié)論與Guo等[25]的結(jié)果一致。接菌處理后土壤中有效態(tài)鎘含量有所增加，而土壤pH則顯著下降，可能是3株菌均具有溶磷作用，能夠通過(guò)分泌有機(jī)酸溶解土壤中的磷酸鹽使之成為植物可吸收利用的形態(tài)，這為土壤中重金屬的活化提供了有利條件，從而促進(jìn)植物對(duì)重金屬的吸收[11]。

4 結(jié)論

從不同植物根際土壤中篩選出3株具有較強(qiáng)耐鎘性的根際促生菌，接菌后一年生黑麥草的分蘗數(shù)、株高、生物量均顯著高于對(duì)照，葉片中丙二醛含量顯著降低。就植株體內(nèi)鎘含量而言，接種菌株后地上部和根系的鎘含量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異， 但其總的吸收量卻顯著增加，這預(yù)示在鎘污染土地上種植一年生黑麥草若接種A02，Oj06，Ps08，通過(guò)多次收獲黑麥草地上部分，可有效減少土壤中鎘含量，說(shuō)明PGPR具有比較理想的應(yīng)用前景。此外, 本試驗(yàn)采用的是溫室盆栽，田間根際微生物受環(huán)境因素(如溫度、肥料、水分、土壤理化性質(zhì)等)的影響較大，耐鎘根際促生菌在田間鎘污染環(huán)境下對(duì)一年生黑麥草的促生及積累效果還有待進(jìn)一步研究。