鄧怡林，于合國，施敏，石翠翠，范建高，李光明

·實(shí)驗(yàn)性肝炎·

Oridonin對(duì)急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究*

鄧怡林，于合國，施敏，石翠翠，范建高，李光明

目的 探討冬凌草甲素（oridonin）對(duì)脂多糖/D-氨基半乳糖氨（LPS/D-Gal）聯(lián)合誘導(dǎo)的急性肝衰竭（ALF）小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的機(jī)制。方法 取25只小鼠，隨機(jī)分成5組，每組5只。采用LPS/D-Gal腹腔注射建立小鼠ALF模型，設(shè)生理鹽水對(duì)照組、LPS/D-Gal誘導(dǎo)模型組、LPS/D-Gal誘導(dǎo)和不同劑量oridonin干預(yù)組及oridonin處理組。采用末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡，采用real-time PCR法檢測(cè)肝組織TNF-α mRNA水平，采用Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果 模型組小鼠肝細(xì)胞凋亡率為（36.4±1.8）%，顯著高于兩個(gè)oridonin干預(yù)組的［（19.4±3.3）%和（11.4±0.3）%，P＜0.01］；模型組小鼠肝組織TNF-α mRNA水平顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），而兩個(gè)oridonin干預(yù)組肝組織TNF-α mRNA水平顯著低于模型組（P＜0.01）；模型組小鼠線粒體凋亡通路相關(guān)的促凋亡蛋白c-Jun氨基末端激酶（JNK）、bax、細(xì)胞色素C、cleaved caspase9/3活化水平顯著高于兩個(gè)oridonin干預(yù)組（P＜0.01），模型組小鼠抗凋亡蛋白bcl-xl水平顯著低于兩個(gè)oridonin干預(yù)組（P＜0.01），模型組小鼠死亡受體凋亡通路相關(guān)的促凋亡蛋白caspase8活化水平與兩個(gè)oridonin干預(yù)組并無明顯差異（P＞0.01）。結(jié)論 Oridonin可抑制LPS/D-Gal誘導(dǎo)的ALF小鼠肝細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)促凋亡細(xì)胞因子TNF-α水平和抑制JNK介導(dǎo)的線粒體凋亡信號(hào)通路有關(guān)。

急性肝衰竭；D-氨基半乳糖氨；冬凌草甲素；凋亡；小鼠

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速[1]，目前尚無有效治療手段[2，3]。肝細(xì)胞凋亡是ALF早期一種重要的病理學(xué)表現(xiàn)[4]，如能阻抑肝細(xì)胞凋亡，則有望延緩甚至阻斷ALF的病情進(jìn)展[5]。冬凌草甲素（oridonin）是從中藥冬凌草中分離出來的活性雙萜類化合物，具有廣泛的抗腫瘤[6，7]、抗炎[8，9]等生物學(xué)活性。我們之前的研究已經(jīng)表明oridonin對(duì)ALF小鼠具有保護(hù)作用，然而這種保護(hù)作用是否與其對(duì)肝細(xì)胞凋亡的阻抑作用有關(guān)尚不清楚。因此，本研究以LPS/D-Gal誘導(dǎo)的ALF小鼠作為模型，進(jìn)一步探討oridonin對(duì)ALF小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與藥物 6～8周齡，雌性SPF級(jí)，體質(zhì)量為20～22 g的C57/BL6小鼠購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，在清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心喂養(yǎng)（標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料及飲水，環(huán)境溫度為21±2℃，12 h明暗交替光照時(shí)間）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合本校動(dòng)物倫理委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定。D-Gal和LPS（E.Coli,菌株O111:B4）購自美國Sigma公司。Oridonin購自美國Selleck公司。RIPA裂解液（強(qiáng)）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。蛋白酶抑制劑cocktail及末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色試劑盒購自美國Roche公司。BCA試劑盒購自北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司。ReverTra Ace qPCR RT Kit購自日本Toyobo公司，SYBR@Green Real-time PCR Master Mix購自上海ExCell Bio公司?？筩-Jun氨基末端激酶（JNK）、抗磷酸化c-Jun氨基末端激酶（P-JNK）、抗細(xì)胞色素c（cytochrome c）、抗含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶8（caspase8）、caspase9、caspase3、抗 bax、抗 bcl-xl 抗體及抗GAPDH抗體均為美國CST公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購自上海Beyotime公司。

1.2 急性肝衰竭模型的建立及藥物干預(yù) 取25只小鼠，隨機(jī)分成5組，每組5只。a組（正常對(duì)照組）：NaCl+NaCl，腹腔注射0.5 ml生理鹽水，1 h后注射同等體積的生理鹽水；b組（模型組）：NaCl+LPS（40 μg/只）/D-Gal（5 mg/只），腹腔注射0.5 ml生理鹽水，1 h后注射同等體積LPS/D-Gal的混合溶液；c組和 d組（藥物干預(yù)組）：oridonin（0.2 mg/只）+LPS（40μg/只）/D-Gal（5 mg/只），其中c組：腹腔注射0.5 m l oridonin（0.2 mg/只），1 h后腹腔注射同等體積的LPS/D-Gal混合溶液；d組：每4天腹腔注射一次0.5 ml oridonin，共 3次，最后一次給藥后1 h腹腔注射同等體積的LPS/D-Gal混合溶液；e組

（藥物對(duì)照組）：oridonin+NaCl，腹腔注射 0.5 ml oridonin（0.2 mg/只，oridonin溶于生理鹽水中），1 h后注射同等體積的生理鹽水。LPS/D-Gal誘導(dǎo)6 h后，取部分肝組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中。另取肝組織經(jīng)液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存，備檢。1.3肝組織細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL染色法，取固定于多聚甲醛中的肝組織，經(jīng)過常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制成5μM切片，按照試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL染色。

1.4 肝組織TNF-α mRNA水平檢測(cè) 采用RT-PCR法，以Trizol法提取肝組織RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度，取吸光度A260/A280為1.8～2.0的RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，采用Real-time PCR試劑盒行PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)體系共20μl，包括DNA 模板（10 ng/μl） 1.4μl，SYBR 10 μl，引物1.6μl（10μM）和ddH2O 7 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 10 min，95℃變性 20s，58℃退火 30 s，72℃延伸25 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，運(yùn)用2-△△CT法分析結(jié)果。所有引物均由美國Thermo Fisher Scientific公司合成，其序列分別為：TNF-α：正 義 鏈 ，5’-CTC CCA GGT ATA TGG GCT CA-3’， 反 義 鏈 ：5’-CCA GGT TCT CTT CAA GGG AC-3’；GAPDH：正義鏈，5’-TCC AAG GAG TAA GAA ACC CTG GAC-3’，反義鏈，5’-GTT ATT ATG GGG GTC TGG GAT GG-3’。

1.5 肝組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，以含有蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA裂解液（強(qiáng)）提取肝組織蛋白，在超聲儀上充分裂解后，冰浴30 min。于4℃ 12000 g離心15 min。吸取上清，以BCA法進(jìn)行蛋白定量，沸水煮沸5 min，使蛋白充分變性，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），檢測(cè)促凋亡蛋白JNK/P-JNK、cytochrome C、caspase8/9/3、bax和抗凋亡蛋白 bcl-xl表達(dá)的變化。應(yīng)用Image J系統(tǒng)分析電泳條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采取獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05和P＜0.01表示差異具有顯著和非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALF小鼠肝組織細(xì)胞凋亡的變化 經(jīng)TUNEL染色，結(jié)果顯示模型組小鼠肝細(xì)胞凋亡率為（36.4±1.8）%，顯著高于正常對(duì)照組的［（1.4±0.5）%，P＜0.01］；oridonin干預(yù)的 c組和 d 組肝細(xì)胞凋亡率分別為（19.4±3.3）%和（11.4±0.3）%，顯著低于模型組（P＜0.01，圖1）。

圖1 肝組織細(xì)胞凋亡情況（TUNEL染色，200×）

2.2 ALF小鼠肝組織TNF-α mRNA水平變化 經(jīng)Real-time PCR檢測(cè)顯示，模型組小鼠肝組織TNF-αmRNA水平顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；oridonin干預(yù)的c組和d組肝組織TNF-α mRNA水平明顯低于模型組（P＜0.01，圖 2），提示 oridonin可明顯抑制LPS/D-Gal誘導(dǎo)的促凋亡細(xì)胞因子TNF-α mRNA水平的上調(diào)。

圖2 ALF小鼠肝組織TNF-α mRNA水平的變化

2.3 ALF小鼠肝組織促凋亡蛋白JNK的變化 模型組小鼠肝組織P-JNK表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；oridonin干預(yù)的 c組和 d組 P-JNK 表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.01，圖 3），提示 oridonin可明顯抑制LPS/D-Gal誘導(dǎo)的促凋亡信號(hào)JNK的激活。

圖3 肝組織促凋亡信號(hào)JNK的變化

2.4 ALF小鼠凋亡相關(guān)蛋白的變化 caspase8是死亡受體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白，細(xì)胞色素C、caspase 9和bax是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白[12]，bcl-xl是bcl-2家族中的抗凋亡蛋白[13]，caspase3是一種凋亡效應(yīng)蛋白，cleaved caspase8/9/3/為caspase8/9/3的活化形式。經(jīng)Western blot檢測(cè)顯示，模型組促凋亡蛋白caspase8、細(xì)胞色素 C、bax、caspase9 和 caspase3 活化水平明顯增加，顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05，圖4）。Oridonin預(yù)處理的c組和d組線粒體凋亡相關(guān)的促凋亡蛋白細(xì)胞色素C、bax、caspase9和caspase3活化水平明顯下降，顯著低于模型組（P＜0.05，圖4）；同時(shí)，抗凋亡蛋白bcl-xl表達(dá)上調(diào)，顯著高于模型組（P＜0.05，圖 4）。然而，oridonin預(yù)處理的 c組和 d組凋亡啟動(dòng)蛋白caspase8活化水平與模型組無明顯差異。oridonin可抑制LPS/D-Gal的 ALF小鼠肝細(xì)胞凋亡，至少部分與抑制線粒體凋亡途徑有關(guān)。

圖4 ALF小鼠凋亡相關(guān)蛋白的變化

3 討論

我們前期研究結(jié)果表明，oridonin對(duì)LPS/D-Gal誘導(dǎo)的ALF小鼠具有明顯的保護(hù)作用，表現(xiàn)為ALF小鼠生存率的顯著提高，肝組織病理學(xué)損傷的減輕及血清肝臟酶學(xué)指標(biāo)的下調(diào)。肝細(xì)胞凋亡是一種短時(shí)相病理改變，是ALF早期的一種重要病理學(xué)表現(xiàn)，也是藥物治療的重要靶點(diǎn)[5，10]。我們的研究結(jié)果證實(shí)在LPS/D-Gal誘導(dǎo)小鼠ALF早期，存在廣泛的肝細(xì)胞凋亡，oridonin干預(yù)可顯著減輕LPS/D-Gal誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，提示oridonin對(duì)ALF的保護(hù)作用可能部分與抑制肝細(xì)胞凋亡相關(guān)。

誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的刺激因素很多，包括炎癥因子（如TNF-α）、線粒體損傷、缺氧等，在ALF發(fā)病進(jìn)程中，它們常相互疊加，促進(jìn)疾病進(jìn)展[14，15]。死亡受體途徑（由TNF-α及FasL啟動(dòng)）和線粒體凋亡途徑（由Bcl-2家族蛋白調(diào)控）是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的兩條經(jīng)典途徑[16]。TNF-α是LPS/D-Gal誘導(dǎo)ALF中主要的促凋亡因子[10]。TNF-α與TNFR1結(jié)合后招募一系列胞內(nèi)蛋白而后激活凋亡起始蛋白caspase8，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17]。我們研究發(fā)現(xiàn)oridonin可明顯抑制模型組小鼠肝組織TNF-α表達(dá)，而凋亡起始蛋白caspase8卻無明顯變化，提示oridonin對(duì)ALF的保護(hù)作用可能與抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，但似乎并不是通過抑制TNF-α介導(dǎo)的死亡受體通路來發(fā)揮作用的。

JNK是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員[12]，可由細(xì)胞應(yīng)激、炎癥因子（TNF-α）等因素誘導(dǎo)激活，其中研究最為廣泛的是，TNF-α通過與TNFR1結(jié)合，介導(dǎo)JNK的激活[18]。TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與持續(xù)激活的JNK信號(hào)通路有關(guān)[19]?；贘NK2基因敲除小鼠及JNK激酶抑制劑SP600125的研究表明，JNK可通過誘導(dǎo)線粒體膜通透性改變、細(xì)胞色素C釋放和bid轉(zhuǎn)位，介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[4，11，20]。因此，在 ALF 動(dòng)物，TNF-α 不僅可直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，還可通過激活JNK介導(dǎo)的線粒體凋亡通路，從而顯著放大TNF-α的促凋亡效應(yīng)。為了進(jìn)一步闡明oridonin的抗凋亡機(jī)制，我們檢測(cè)了JNK及線粒體通路相關(guān)促凋亡和抗凋亡蛋白表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在LPS/D-Gal誘導(dǎo)的ALF小鼠，TNF-α上調(diào)可能是肝細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因素，而JNK激活介導(dǎo)的線粒體途徑才是ALF早期肝細(xì)胞大量凋亡的關(guān)鍵。oridonin干預(yù)可顯著逆轉(zhuǎn)JNK激活，下調(diào)線粒體相關(guān)促凋亡蛋白表達(dá)，并上調(diào)抗凋亡蛋白bcl-xl表達(dá)，同時(shí)伴隨肝細(xì)胞凋亡的顯著減輕，表明oridonin的抗凋亡效應(yīng)主要與JNK介導(dǎo)線粒體凋亡通路有關(guān)。

綜上所述，我們研究證實(shí)oridonin對(duì)ALF小鼠的保護(hù)作用至少部分與抑制TNF-α表達(dá)及JNK介導(dǎo)線粒體凋亡通路有關(guān)，提示oridonin在干預(yù)ALF方面具有潛在的應(yīng)用前景。

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（收稿：2016-11-17）

（本文編輯：陳從新）

Suppression of TNF-αand JNK-related pro-apoptotic signaling expression of oridonin in m ice w ith LPS/D-Gal-induced acute liver failure

Deng Yilin，Yu Heguo，Shi Min，et al.Department of Gastroenterology， Xinhua Hospital Affiliated to Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

Objective To investigate the anti-apoptosis effect of oridonin in mice with lipopolysaccharide（LPS）/D-galactosamine（D-Gal）-induced acute liver failure（ALF）.Methods 25 mice were randomly divided into five groups （5 in each），e.g.，normal，model，oridonin-intervened and oridonin-intervened at different doses，and oridonin for 12 days.ALF model was established in C57BL/6 mice by intraperitoneal injection of LPS/D-Gal.TUNEL，real-time PCR and Western blot were applied to related detection.Results Hepatocyte apoptosis rate in mice in model group was（36.4±1.8）%，significantly higher than that in oridonin-intervened groups[（19.4±3.3）%and （11.4±0.3）%，respectively，P<0.01]；administration of oridonin significantly decreased hepatic TNF-α mRNA level in model group （P<0.01）；the expressions of mitochondrial-dependent pro-apoptotic protein such as JNK，bax，cytochrome C，cleaved caspase8/9/3 were upregulated in the model group as compared to in the control group;Pretreatment with oridonin significantly reversed the changes of apoptosis signal pathway induced by LPS/D-Gal，the expression of caspase 8 was not significantly changed and the expression of anti-apoptotic protein bcl-xl increased.Conclusion Oridonin has an anti-apoptosis effect on LPS/D-Gal-induced ALF in mice，and its mechanism may be related to the suppression of pro-apoptotic cytokine TNF-αand JNK-related pro-apoptotic signaling.

Acute liver failure；D-galactosamine；Oridonin；Apoptosis；Mice

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81400631/81570549）

200092上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科（鄧怡林，石翠翠，范建高，李光明）；附屬同仁醫(yī)院消化內(nèi)科（施敏）；上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所（于合國，刁華）

鄧怡林，女，25，碩士研究生。主要從事肝損傷及肝纖維化的防治研究

李光明，E-mail:ligm68@126.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.04.005