邢 佳 傅 萍# 陳婷婷

1 浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

滋腎育胎丸對腎陽虛型多囊卵巢綜合征模型小鼠血清抑制素B及干細胞因子的影響*

邢 佳1傅 萍1#陳婷婷2

1 浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

滋腎育胎丸 腎陽虛型 多囊卵巢綜合征 抑制素B 干細胞因子

多囊卵巢綜合征（PCOS）是婦科常見的一種生殖功能障礙和代謝紊亂性疾病，其關(guān)鍵病理機制為卵泡發(fā)育異常和排卵障礙。近年來研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，抑制素B（INHB）、干細胞因子（SCF）與卵泡發(fā)育及排卵密切相關(guān)。本實驗以INHB、SCF為切入點，用cAMP/cGMP比值衡量小鼠模型的陰陽偏向，通過觀察滋腎育胎丸對腎陽虛型PCOS模型小鼠血清中INHB、SCF表達的影響，探討滋腎育胎丸的治療機制，為臨床運用中醫(yī)藥診治腎陽虛型PCOS提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：21日齡雌性ICR小鼠，54只，SPF級；浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。將小鼠置于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心內(nèi)飼喂。實驗期間同一室內(nèi)籠養(yǎng)，室溫18～22℃，12h光照，12h黑暗，自由飲水，飼料由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 藥物與試劑：滋腎育胎丸（60g裝），購自廣州白云山中一藥業(yè)有限公司；達英-35，由Schering GmbH& Co.Produktions KG提供，每粒含2mg醋酸環(huán)丙孕酮和0.035mg炔雌醇，使用時加蒸餾水制成0.3mg/kg混懸液；脫氫表雄酮（DHEA）粉劑，購自美國sigma公司；注射用大豆油（用于溶解DHEA），購自九三集團海爾濱眾和商貿(mào)有限公司；氫化可的松注射液，購自天津金耀藥業(yè)有限公司；所有小鼠El isa試劑盒均由杭州昊鑫生物科技股份有限公司提供。

1.3 分組與飼養(yǎng)：適應(yīng)性喂養(yǎng)2日后，將21日齡雌性ICR小鼠隨機分為6組，分別設(shè)空白組、模型組、滋腎育胎丸低劑量組、滋腎育胎丸中劑量組、滋腎育胎丸高劑量組、達英-35組，每組各9只，全程喂以普通飼料。

1.4 方法：分述如下。

1.4.1 動物模型的建立：采用脫氫表雄酮聯(lián)合氫化可的松法誘導(dǎo)腎陽虛型PCOS小鼠模型。模型組、滋腎育胎丸低劑量組、滋腎育胎丸中劑量組、滋腎育胎丸高劑量組、達英-35組每日予頸背部皮下注射9mg/100g DHEA油溶液0.1ml，26日后，加用氫化可的松25mg/kg體重后肢肌肉注射，日1次，連續(xù)14日；空白組每日予頸背部皮下注射注射用大豆油0.1ml，26日后，加用等體積生理鹽水后肢肌肉注射，日1次，連續(xù)14日。

1.4.2 預(yù)防性治療：滋腎育胎丸低、中、高劑量組全程分別予滋腎育胎丸1.13g/kg、4.50g/kg、2.25g/kg灌胃，共40天；達英-35組全程予達英-35蒸餾水混懸液0.3mg/kg灌胃，共40天；空白組、模型組予等體積生理鹽水灌胃。

1.4.3 標(biāo)本采集：末次給藥后12小時，對小鼠行頸椎脫臼法處死并采集標(biāo)本。

1.5 觀察指標(biāo)：①實驗開始后每3天觀察一次小鼠一般狀態(tài)（活動度、被毛顏色及光澤度等）；②從28日齡起小鼠陰門開放后每日行陰道涂片觀察脫落細胞改變直到實驗結(jié)束；③酶聯(lián)免疫吸附法（El isa）測定血清黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、睪酮（T）、雌二醇（E2）、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）、抑制素B（INHB）、干細胞因子（SCF）水平。④對所取卵巢進行病理切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)改變。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法：采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件對測定數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。全部計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進行方差分析或t檢驗。兩組計量資料間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，首先行方差齊性檢驗，若方差齊性，則選用LSD或SNK法，若方差不齊，則選用Tamhane’s T2或Dunnet t's T3法。雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)的變化：空白組小鼠喜動活躍，動作敏捷，大便正常，毛色光澤，肢尾溫暖，睡眠時間正常。模型組小鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，大便稀溏，群聚蜷縮，活動減少，毛色黯淡，肢尾冷，睡眠時間延長。各治療組小鼠造模成功后表現(xiàn)出與模型組相似的陽虛癥狀，隨著用藥時間的延長，部分小鼠精神狀態(tài)較前好轉(zhuǎn)，活動增加，被毛光澤恢復(fù)，大便成形。

2.2 各組小鼠陰道脫落細胞的變化：空白組小鼠以4-5天為1個正常動情周期，呈現(xiàn)動情前期、動情期、動情間期、動情后期4個時期規(guī)律出現(xiàn)。模型組小鼠脫落細胞持續(xù)角化，完全失去正常動情周期。各治療組小鼠在觀察初期脫落細胞主要表現(xiàn)為無核角化細胞和少量上皮細胞，失去正常動情周期，隨著用藥時間的延長，部分小鼠動情周期逐漸恢復(fù)正常。

2.3 各組小鼠血清性激素水平、cAMP/cGMP比值的改變：見表1、表2。

表1 各組小鼠血清性激素水平的變化（±s，n=9）

表1 各組小鼠血清性激素水平的變化（±s，n=9）

注：與空白組比較，★P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

分組空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組達英-35組LH（ng/L）1412.99± 23.19 1787.09±102.44★1656.85± 38.02 1512.19± 12.38 1467.46± 29.48▲1461.33± 27.13▲T（nmol/L）134.62±1.84 147.22±3.06★144.91±4.02 138.25±2.34 136.16±2.61▲137.64±1.78▲E2（ng/L）49.07±0.50 34.52±3.89★38.60±0.94 41.33±3.32 45.70±1.40▲44.75±1.33▲FSH(IU/L) 8.08±0.24 7.38±0.16★7.45±0.10 7.56±0.11 7.97±0.07▲7.74±0.15▲LH/FSH 5.25±0.16 7.27±0.36★6.67±0.17 6.00±0.12 5.53±0.14▲5.67±0.20▲

表2 各組小鼠血清cAMP、cGMP、cAMP/cGMP比值的變化（±s，nmol/L，n=9）

表2 各組小鼠血清cAMP、cGMP、cAMP/cGMP比值的變化（±s，nmol/L，n=9）

注：與空白組比較，★P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組達英-35組cAMP 8.41±0.37 7.06±0.58★7.43±0.29 7.58±0.43 7.92±0.24 7.77±0.23 cAMP/cGMP 1.80±0.14 1.28±0.13★1.38±0.11 1.46±0.10▲1.61±0.84▲1.54±0.77▲cGMP 4.67±0.21 5.54±0.23★5.40±0.38 5.20±0.16 4.93±0.20 5.07±0.18

2.4 滋腎育胎丸對小鼠血清INHB、SCF的影響：見表3。

表3 滋腎育胎丸對小鼠血清INHB、SCF的影響（±s）

表3 滋腎育胎丸對小鼠血清INHB、SCF的影響（±s）

注：與空白組比較，★P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

SCF（ng/L）104.89±7.68 63.95±8.20★77.48±6.05 84.87±7.72▲91.45±9.92▲89.51±7.89▲例數(shù)組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組達英-35組9 9 9 9 9 9 INHB（ng/L）16.18± 6.62 29.08± 8.41★26.00±12.59 24.93± 8.22 18.27± 8.12▲28.30± 9.98

2.5 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)的改變：空白組（A、B）卵巢內(nèi)存在各級卵泡，顆粒細胞層致密、排列整齊，膜細胞層薄，間質(zhì)細胞致密、排列整齊，白膜薄，表面光整。模型組（C、D）小鼠卵巢內(nèi)囊性擴張的卵泡增多，卵泡腔顯著擴張，卵泡內(nèi)卵母細胞及放射冠消失，顆粒細胞層變薄且排列疏松，膜細胞不規(guī)則增生、排列欠整齊，卵巢間質(zhì)細胞排列紊亂，白膜增厚、表面欠光整。滋腎育胎丸低劑量組（E、F）、滋腎育胎丸中劑量組（G、H）部分小鼠卵巢病理切片顯示顆粒細胞層數(shù)較模型組略增多，卵泡膜細胞層較模型組略變薄。滋腎育胎丸高劑量組（I、J）和達英-35組（K、L）顆粒細胞層數(shù)較模型組明顯增多，形態(tài)規(guī)則，排列整齊，白膜和卵泡膜細胞層較模型組變薄。具體見圖1、圖2。

圖1 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)

圖2 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)

3 討論

多囊卵巢綜合征（PCOS）病理環(huán)節(jié)的根本在于卵泡發(fā)育異常和排卵障礙。陰陽學(xué)說[3]認為，cAMP/cGMP比值能全面衡量機體的陰陽偏向。本實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠卵巢病理切片符合小鼠PCO樣改變，結(jié)合小鼠血清性激素變化、cAMP/cGMP比值改變及腎陽虛癥狀，說明腎陽虛型PCOS小鼠模型建立成功。

現(xiàn)代學(xué)者研究[1，2]發(fā)現(xiàn)，INHB、SCF為卵巢局部因子，與卵泡的發(fā)育及排卵有著密切的關(guān)系。INHB是一種糖蛋白，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[1]血清INHB水平在PCOS患者中表達升高，推測INHB與PCOS的發(fā)病有關(guān)。Hendrix等研究發(fā)現(xiàn)[4]，過量的INHB抑制了垂體FSH的合成與分泌，使卵泡生長受阻并過早閉鎖，形成多囊卵巢。本實驗中，模型組小鼠血清INHB水平高于空白組、FSH水平低于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與以上結(jié)論相符。

SCF為多肽類物質(zhì)，是卵巢局部生長因子之一[5]。有關(guān)研究顯示[6]，較高水平的SCF有利于卵細胞的受精和優(yōu)質(zhì)胚胎的形成。SCF為酪氨酸激酶受體(c-kit)的配體，它與靶細胞上的c-kit受體結(jié)合，激活下游信號通路，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，抑制SCF/c-kit信號通路會影響原始卵泡發(fā)育、初級卵泡生長及體內(nèi)成熟卵泡的排出[7]。本實驗結(jié)果顯示，腎陽虛型PCOS小鼠血清SCF水平明顯低于空白組（P＜0.05），由此，我們推測SCF的表達水平下降可使SCF/c-kit信號通路的活性下調(diào)，進而抑制卵泡發(fā)育及成熟卵泡的排出。

滋腎育胎丸是全國著名中醫(yī)婦科專家、廣州中醫(yī)藥大學(xué)羅元愷教授的經(jīng)驗方，臨床上可用于多囊卵巢綜合征的治療。滋腎育胎丸由菟絲子、熟地黃、人參、杜仲、首烏、枸杞子、阿膠、鹿角霜、巴戟天、桑寄生、續(xù)斷、黨參、白術(shù)、艾葉、砂仁組成，以溫補腎陽為主，佐以益氣養(yǎng)血。方中菟絲子為君藥，能補腎益精固胎；人參、黨參、白術(shù)大補元氣；鹿角霜補元陽、生精髓；配以巴戟天、杜仲、續(xù)斷、桑寄生益腎固沖；首烏、枸杞子、熟地黃、阿膠填補肝腎，滋陰養(yǎng)血；艾葉溫經(jīng)散寒，調(diào)經(jīng)止血；砂仁理氣和中。全方腎、肝、脾同治，能良好地促進卵泡發(fā)育、誘發(fā)排卵。本實驗結(jié)果表明滋腎育胎丸高劑量組小鼠的卵巢組織形態(tài)與空白組基本一致，且高劑量滋腎育胎丸能顯著降低腎陽虛型PCOS小鼠血清T、LH/FSH、INHB，升高血清E2、cAMP/cGMP、SCF，并能改善其腎陽虛癥狀，證明滋腎育胎丸對腎陽虛型PCOS有良好的治療作用。我們猜測其治療機制可能是通過降低INHB來解除INHB對FSH的過度抑制，同時增加SCF的表達，上調(diào)SCF/c-kit信號通路的活性，從而促進卵泡發(fā)育及排卵，糾正其內(nèi)分泌紊亂狀態(tài)，最終達到治療腎陽虛型PCOS的目的。

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2017-03-31

廣東省羅元愷滋腎育胎丸中青年科研基金項目滋腎育胎丸對腎虛型PCOS模型小鼠cAMP/cGMP、AMH、INHB、SCF影響的研究，編號：HX201502-140203；國家中醫(yī)藥管理局傅萍全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項目，編號：國中醫(yī)藥人教發(fā)〔2014〕20號；浙江省傅萍名老中醫(yī)專家傳承工作室研究項目，編號：GZS2012023

# 通訊作者：傅 萍，E-mai l：fupingss@163.com