薩喆燕 潘曉華 黃倩茹 萬隆 朱小香 董亞琴 許金森*

（福建省中醫(yī)藥研究院·福建省經(jīng)絡(luò)感傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350003）

電針對(duì)大鼠心肌缺血相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA及mRNA表達(dá)譜的影響※

薩喆燕 潘曉華 黃倩茹 萬隆 朱小香 董亞琴 許金森*

（福建省中醫(yī)藥研究院·福建省經(jīng)絡(luò)感傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350003）

目的探討電針對(duì)心肌缺血大鼠心肌組織長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）表達(dá)的影響。方法18只SD大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組、生理鹽水對(duì)照組，每組6只。模型組、電針組大鼠經(jīng)皮下多點(diǎn)位注射鹽酸異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）制備心肌缺血模型，電針組電針內(nèi)關(guān)穴5 d，比較各組心電圖ECG偏移幅度；采用lncRNA芯片檢測(cè)電針組和模型組大鼠心肌組織lncRNA和mRNA的表達(dá)差異，篩選出電針治療心肌缺血相關(guān)的lncRNA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證3個(gè)隨機(jī)挑選的lncRNA。結(jié)果相較于模型組，電針組ECG偏移較小，差異表達(dá)的lncRNA共547個(gè)，mRNA738個(gè)，PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致。結(jié)論與模型組比較，電針組大鼠lncRNA表達(dá)譜變化顯著，lncRNA可能在電針治療心肌缺血過程中發(fā)揮一定作用。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA；心肌缺血；電針；心肌缺血

冠狀動(dòng)脈性心臟病，又稱缺血性心臟病，占我國城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，并呈逐年增加趨勢(shì)[1]。盡管人們對(duì)缺血性心臟病的認(rèn)識(shí)不斷提高，醫(yī)療手段也在不斷進(jìn)步，但該病仍嚴(yán)重影響人們的健康。國內(nèi)外大量臨床證實(shí)，針刺治療心肌缺血的效應(yīng)主要體現(xiàn)在緩解臨床疼痛癥狀、抗心率失常、提高患者生活質(zhì)量以及改善預(yù)后等方面[2-4]，但機(jī)制仍未完全闡明。

長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸單位，不編碼蛋白質(zhì)，但往往具有mRNA結(jié)構(gòu)特征的小分子RNA。本研究采用鹽酸異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）造成心肌缺血大鼠模型，通過電針治療，對(duì)大鼠缺血心肌組織標(biāo)本進(jìn)行l(wèi)ncRNA/mRNA芯片分析，以期了解電針對(duì)缺血心肌組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)的影響，為針刺治療心肌缺血的機(jī)制研究提供新的思路和線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量230～250 g，清潔級(jí)，由福建省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(閩)2012-0001。飼養(yǎng)條件：溫度25℃，12 h明暗交替，自由攝食飲水。按隨機(jī)數(shù)字表法分為生理鹽水對(duì)照組、模型組、電針組，每組6只。

1.2 藥品與試劑ISO（美國Sigma公司）；RNA酶抑制劑（美國Epicentre公司）；RT緩沖液（美國Invitrogen公司）；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司）；引物由上?？党缮锕こ逃邢薰驹O(shè)計(jì)并合成。

1.3 儀器Powerlab多導(dǎo)數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)（澳大利亞埃德公司）；小動(dòng)物麻醉呼吸系統(tǒng)（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；7500 Fast Real-Time PCR System（美國Applied Biosystems公司）；梯度熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；NanoDrop 2000分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific公司）。SDZ-II型華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。lncRNA及mRNA基因芯片服務(wù)由上海康成生物公司提供。

1.4 研究方法

1.4.1 動(dòng)物造模大鼠連接小動(dòng)物麻醉呼吸機(jī)，吸入異氟烷麻醉，通過多導(dǎo)生理記錄儀記錄正常狀態(tài)下大鼠心電圖ECG。按每日85 mg/kg劑量在大鼠四肢內(nèi)側(cè)根部和背部注射ISO，連續(xù)注射2日。根據(jù)ECG出現(xiàn)T波由正向變?yōu)樨?fù)向或呈雙相，S-T段抬高確認(rèn)造模成功。

1.4.2 干預(yù)措施電針組以0.25 mm×13 mm華佗牌無菌毫針直刺左側(cè)內(nèi)關(guān)穴，連接SDZ-II電針儀，電壓5～10 V，以針體輕微抖動(dòng)為度，疏密波，頻率2/10 Hz，每次20 min，每日1次。第2次注射ISO后24 h開始治療，連續(xù)5 d。生理鹽水對(duì)照組和模型組給予同等條件抓取，不做任何治療。

1.4.3 樣本采集干預(yù)結(jié)束后，大鼠腹腔注射過量10%水合氯醛處死，立即取新鮮左心室心肌組織-80℃保存用于lncRNA檢測(cè)。

1.4.4 ECG分析干預(yù)結(jié)束后分別記錄對(duì)照組、模型組、電針組大鼠的ECG，各取5個(gè)心動(dòng)周期，以TP連線為基線，測(cè)量J點(diǎn)電位偏移和T波振幅變化，作為評(píng)價(jià)心肌缺血程度的指標(biāo)。

1.4.5 芯片選擇采用美國Arraystar公司大鼠lncRNA微陣列芯片v2.0，能夠檢測(cè)13，611個(gè)lncRNAs和24，626個(gè)蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本。lncRNAs是從權(quán)威數(shù)據(jù)庫（包括NCBI RefSeq、Ensembl、LncRNAdb等）和高影響因子論文中收集的。

1.4.6 RNA提取取出新鮮凍存的心肌組織，剪成所需大小組織塊，Trizol一步法提取細(xì)胞中的總RNA。用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性；NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA在260 nm和280 nm波長(zhǎng)的吸光度值，評(píng)估RNA量和質(zhì)量。

1.4.7 微陣列分析從總RNA中移除rRNA后，得到mRNA。使用隨機(jī)引物法將每個(gè)樣品放大并轉(zhuǎn)錄成帶熒光的cRNA，標(biāo)記好的cRNA在芯片上進(jìn)行芯片雜交。清洗載片后，用AgilentDNAMicroarryScanner（G2505C）進(jìn)行掃描。采用Agilent Feature Extraction軟件采集芯片探針信號(hào)值，在Agilent GeneSpring GX軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理和分析，得出電針組與模型組標(biāo)記的信號(hào)比值（fold change），即為該基因組在電針組與模型組中的變化情況。最后經(jīng)過t檢驗(yàn)，按照fold change≥1.5，P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到差異表達(dá)的lncRNA和mRNA列表。對(duì)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行基因本體GO分析，尋找表達(dá)異常的mRNA相關(guān)的生物學(xué)過程、細(xì)胞分子和疾病通路。隨機(jī)選取3個(gè)lncRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，以管家基因大鼠GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參照，基因名稱和上、下游引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用（x±s）表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，組間比較符合正態(tài)分布進(jìn)行方差分析、LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 ECG變化注射ISO后Ⅱ?qū)?lián)ECG上可以觀察到ST段抬高，有時(shí)可見M波，并時(shí)常伴有一定程度的心律失常。干預(yù)處理后，模型組大鼠J點(diǎn)位移和T波振幅變化均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），而電針組J點(diǎn)位移和T波振幅變化則明顯低于模型組（P＜0.01），可見電針可以減輕大鼠心肌缺血程度，見表2。

表2 各組大鼠ECG比較（x±s）

2.2 lncRNA和mRNA的表達(dá)譜分析經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，電針組與模型組比較，差異表達(dá)的lncRNA共547個(gè)，其中1.5倍以上上調(diào)的有203個(gè)，下調(diào)的有344個(gè)；差異表達(dá)的mRNA共738個(gè)，其中1.5倍以上上調(diào)的有288個(gè)，下調(diào)的有450個(gè)，見表3。部分表達(dá)異常的lncRNA和mRNA基因代碼及差異倍數(shù)見表4。

表3 電針組和模型組心肌組織中差異表達(dá)lncRNA和mRNA數(shù)（個(gè)）

表4 心肌組織中部分差異表達(dá)的lncRNA和mRNA

2.3 GO分析GO分析顯示差異表達(dá)的mRNA參與的生物過程，經(jīng)過篩選，與心肌組織相關(guān)的生物過程主要有心肌組織發(fā)育調(diào)控、心肌細(xì)胞增值調(diào)控、心室肌細(xì)胞發(fā)育、心肌組織生長(zhǎng)、心肌細(xì)胞增值等，富集分?jǐn)?shù)最高的前10條見圖1。

圖1 心肌相關(guān)生物過程GO條目

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證與模型組比較，電針組心肌組織lncRNAs差異表達(dá)與芯片結(jié)果一致。其中，lncRNA XR_596822表達(dá)水平升高，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；lncRNAXR_591485、lncRNA XR_597102表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

缺血性心臟病的主要癥狀為胸悶、心悸、心絞痛等，均包涵在中醫(yī)的“胸痹”“心痛”“真心痛”等病證范疇中，因此古代中醫(yī)多按“胸痹心痛”辨證施治?！夺樉拇蟪伞ぞ碇胖伟Y總要》早有記載：“心胸疼痛，大陵、內(nèi)關(guān)、曲澤?！?002年，世界衛(wèi)生組織在《針灸臨床研究報(bào)告的回顧與分析》中也肯定了冠心病是推薦針灸治療病種之一。目前，針刺治療心肌缺血的療效在臨床與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到不斷驗(yàn)證，其相關(guān)機(jī)制研究也成為中醫(yī)現(xiàn)代化研究的一個(gè)熱點(diǎn)。研究表明針刺治療心肌缺血的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)自主神經(jīng)活動(dòng)[5-6]、調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞離子通道蛋白[7-8]、激活凋亡信號(hào)途徑[9]等相關(guān)。近年來，基因組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為針刺治療心肌缺血的機(jī)制研究開辟了一條新思路，如通過基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)，針刺內(nèi)關(guān)穴對(duì)缺血心肌差異表達(dá)mRNA有良性調(diào)節(jié)趨勢(shì)，且主要參與氧化磷酸化、線粒體電子傳遞、能量代謝等過程[10]；MicroRNA(miRNA)也可能參與了電針防治心肌缺血的過程[11]。隨著新技術(shù)的發(fā)展和研究的不斷深入，非編碼RNA逐漸進(jìn)入了人們的研究視野。

人類基因組中，非編碼RNA在轉(zhuǎn)錄組中的含量高達(dá)98%以上，而能編碼蛋白質(zhì)的基因僅占1.2%，提示非編碼RNA在生物體內(nèi)可能具備豐富的生物學(xué)功能[12]。lncRNA就是一類細(xì)胞內(nèi)源性的非編碼RNA小分子，其長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸單位。lncRNA沒有完整開放閱讀框，不編碼蛋白質(zhì)，但其本身具有mRNA的特點(diǎn)，可被剪切和多聚腺苷酸化，從而參與表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)等過程[13-14]，在生理病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[15-17]。

作為一種新的生物調(diào)控模式，lncRNA在缺血性心臟病發(fā)生發(fā)展過程扮演了重要的角色，也越來越受到研究者的關(guān)注。尋找血清相關(guān)標(biāo)志物是冠心病臨床研究的一大焦點(diǎn)。Cai等[18-19]通過臨床試驗(yàn)比較分析了冠心病患者和正常人血漿，并采用Fisher標(biāo)準(zhǔn)建立診斷模型，發(fā)現(xiàn)外周血中l(wèi)ncRNA NONHSAT112178(LncPPARδ)和CoroMarker 2種lncRNAs，均可作為診斷冠心病的新型的血漿生物標(biāo)志物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Zou等[20]在心肌缺血大鼠模型中發(fā)現(xiàn)星狀神經(jīng)節(jié)中l(wèi)ncRNA NONRATT021972明顯升高，應(yīng)用小干擾RNA抑制lncRNA后，血清心肌酶水平顯著降低，星狀神經(jīng)節(jié)中P2X7蛋白表達(dá)降低，從而改善心肌缺血程度。Wang等發(fā)現(xiàn)一種lncRNA——自噬促成因子（autophagy-promoting factor，APF），能夠與miR-188-3P和自噬相關(guān)基因7（ATG7）相互作用，影響心肌梗死程度[21]。由研究現(xiàn)狀可見，lncRNA參與了心肌缺血的調(diào)控過程，然而有關(guān)電針對(duì)心肌缺血大鼠心肌組織lncRNA表達(dá)的影響，則鮮有報(bào)道。

本研究應(yīng)用lncRNA微陣列芯片同時(shí)檢測(cè)心肌缺血模型組和電針組大鼠心肌組織lncRNA和mRNA的表達(dá)水平，篩選電針治療心肌缺血相關(guān)lncRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異的lncRNA共547個(gè)，其中203個(gè)上調(diào)，344個(gè)下調(diào)；表達(dá)差異的mRNA共738個(gè)，其中288個(gè)上調(diào)，450個(gè)下調(diào)。提示，lncRNA的差異表達(dá)可能與電針干預(yù)有著重要聯(lián)系。對(duì)差異表達(dá)mRNA進(jìn)行GO分析，可以更好了解其功能。與心肌相關(guān)的生物過程，主要集中在心肌細(xì)胞發(fā)育、心肌細(xì)胞增殖等條目，提示電針干預(yù)可能通過調(diào)控心肌細(xì)胞增殖、分化調(diào)控心肌缺血過程。此外，對(duì)隨機(jī)挑選出的差異表達(dá)的3個(gè)lncRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)基本保持一致，提示了芯片檢測(cè)的可靠性。由此，結(jié)合國內(nèi)外研究，提示lncRNA在電針治療心肌缺血過程中發(fā)揮了重要作用。

本研究從篩選差異表達(dá)lncRNA的視角對(duì)電針治療心肌缺血相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探究，為電針治療心肌缺血的機(jī)制研究提供一條新線索。但要深入了解lncRNA的參與機(jī)制還需進(jìn)一步結(jié)合生物信息學(xué)分析，挑選特異性lncRNA，并應(yīng)用RNA干擾和基因過表達(dá)等技術(shù)進(jìn)行l(wèi)ncRNA功能研究，以揭示電針治療心肌缺血的分子機(jī)制。

[1]陳偉偉，高潤(rùn)霖，劉力生，等.中國心血管病報(bào)告2013概要[J].中國循環(huán)雜志，2014，29(7):487-491.

[2]Painovich J，Longhurst J.Integrating acupuncture into the cardiology clinic: can it playa role?[J].Acta Physiologica Sinica，2015，67(1):19-31.

[3]Ren Y，Li D，Zheng H，et al.Acupoint application in patients with chronic stableanginapectoris:studyprotocolofarandomized，double-blind，controlled trial[J].EvidBasedComplementAlternatMed，2013，2014(23):619706.

[4]栗新，曹建平，姜愛平，等.針刺結(jié)合西藥治療不穩(wěn)定型心絞痛臨床療效及動(dòng)態(tài)心電圖觀察[J].中國針灸，2015，35(9):895-896.

[5]崔帥，許靜，王潔，等.電針心經(jīng)腧穴對(duì)急性心肌缺血大鼠自主神經(jīng)活動(dòng)的影響[J].針刺研究，2016，41(6):515-520.

[6]Sa Z Y，Meng H，Zhang D，et al.The interaction of mast cells and cardiac sympathetic nerves during acupuncture in acute myocardial ischemia rats[J]. Med Acupunct，2013，25(5):343-352.

[7]Wang Y，Zhang X L，Wang W，et al.The beneficial effects of electroacupuncture at PC6(neiguan-point)ofgene and protein expressions ofclassical inward-rectifier potassium channels in myocardial ischemic rats[J]. Acupunct Eletrother Res，2015，40(4):335.

[8]WangW，Li J，MengX，et al.Effect of electronic stimulation at neiguan(PC 6)acupoint on gene expression of adenosine triphosphate-sensitive potassium channel and protein kinases in rats with myocardial ischemia[J].J Tradit Chin Med，2015，35(5):577-582.

[9]Lu SF，Huang Y，Wang N，et al.Cardioprotective effect of electroacupuncture pretreatment on myocardial ischemia/reperfusion injury via antiapoptotic signaling[J].Evid Based Complement Alternat Med，2016，2016:4609784.

[10]梁憲如，席強(qiáng)，李曉梅，等.針刺內(nèi)關(guān)穴對(duì)急性心肌缺血大鼠缺血心肌基因表達(dá)譜的影響[J].天津中醫(yī)藥，2012，29(4):349-355.

[11]盧繼東.“標(biāo)本配穴”電針對(duì)心肌缺血大鼠細(xì)胞凋亡miRNA的影響及調(diào)控機(jī)制研究[D].湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[12]Ponting C P，Belgard T G.Transcribed dark matter:meaning or myth?[J]. HumMol Genet，2010，19(R2):R162.

[13]MuersM.RNA:Genome-wideviewsoflongnon-codingRNAs[J].NatRevGenet，2011，12(11):742.

[14]Sotillo E，Thomastikhonenko A.The long reach of non-coding RNAs[J].Nat Genet，2011，43(7):616-617.

[15]Bhan A，Mandal SS.LongnoncodingRNAs:emergingstars in gene regulation，epigenetics and human disease[J].ChemMed Chem，2014，9(9):1932-1956.

[16]Lalevee S，F(xiàn)eil R.Long noncoding RNAs in human disease:emerging mechanisms and therapeutic strategies[J].Epigenomics，2015，7(6):877-879.

[17]Seo H，Yoon S J，Yoon J，et al.Recent trends in economic burden of acute myocardial infarction in South Korea[J].PLoSOne，2015，10(2):e0117446.

[18]Cai Y，Yang Y，Chen X，et al.Circulating"LncPPARδ"from monocytes as a novel biomarker for coronaryarterydiseases[J].Medicine，2016，95(6): e2360.

[19]Yang Y，Cai Y，Wu G，et al.Plasma long non-coding RNA，CoroMarker，a novel biomarker for diagnosis of coronary artery disease[J].Clin Sci(Lond)，2015，129(8):675-685.

[20]Zou L，Tu G，Wei X，et al.LncRNA NONRATT021972 involved the pathophysiologic processes mediated byP2X7 receptors in stellate ganglia after myocardial ischemic injury[J].Purinergic Signal，2016，12(1):127-137.

[21]Wang K，Liu C Y，Zhou L Y，et al.APF lncRNA regulates autophagy and myocardial infarction by targeting miR-188-3p[J].Nat Commun，2015，6: 6779.

Effects of Electroacupuncture on the Expression Profiles of Long Noncoding RNA and mRNA in Myocardial Tissue of Myocardial Ischemia in Rats

SA Zheyan,PAN Xiaohua,HUANG Qianru,WAN Long,ZHU Xiaoxiang,DONG Yaqin,XU Jinsen
(Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine·Key Laboratory of Propagated Sensation along Meridian of Fujian Province,Fujian Province, Fuzhou 350003,China)

Objective To explore the effect of electroacupuncture(EA)on expression profiles of long noncoding RNA of myocardial ischemia in rats.Methods 18 SD rats were randomly divided into myocardial ischemia model group,EA group and control group, with 6 rats in each group.Myocardial infarction was produced in rats with isoproterenol administered subcutaneously(sc)twice. Rats of EA group were treated with EA for 5 days.ECG in all rats were recorded.The expression profiles of lncRNA and mRNA of EA group compared with model group were analyzed through the rat lncRNA microarray.Quantitative real-time PCR was used to validate 3 selected lncRNAs.Results Voltage changes of the EA group were much lower than that of the model group.547 lncRNAs and 738 mRNA were identified to be different expression(fold change≥1.5).The results of real-time PCR were shown to be consistent with the microarray data.Conclusion Comparing with the model group,there are evidently differentially expressed profiles of lncRNA in EA group.LncRNA may play a role in the treatment of myocardial ischemia by EA.

long noncoding RNA;myocardial ischemia;electroacupuncture;Myocardial ischemia

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.16.061

1672-2779（2017）-16-0140-04

：李海燕本文校對(duì)：陳銘

2017-06-20）

國家自然科學(xué)基金資助課題【No.81001505】；國家自然科學(xué)基金資助課題【No.81403490】；福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)資助課題【No.2015R1035-14】

*通訊作者：xujinsenjls@163.com