申永銘, 李海源, 陳愛昌, 魏周全, 胡小平*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 楊凌 712100;2. 甘肅定西市植保植檢站, 定西 743000)

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甘肅定西地區(qū)甘藍(lán)枯萎病病原菌的分離與鑒定

申永銘1, 李海源1, 陳愛昌2, 魏周全2, 胡小平1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 楊凌 712100;2. 甘肅定西市植保植檢站, 定西 743000)

自2009年起,甘肅定西地區(qū)出現(xiàn)了甘藍(lán)植株矮化、葉片黃化、枯萎甚至死亡的現(xiàn)象。2015年8月,我們采集了田間病株樣本,使用常規(guī)組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行了分離和純化,依據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行了病原菌確認(rèn),并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)病原菌進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明病原菌的形態(tài)學(xué)特征與尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum一致,其rDNA-ITS、rDNA-IGS以及EF-1α序列與尖孢鐮刀菌F.oxysporum相似性達(dá)99%,基于病原菌及尖孢鐮刀菌各代表?；虴F-1α序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將該菌與尖孢鐮刀菌黏團(tuán)?；虵.oxysporumf.sp.conglutinans聚為一類,故引致甘肅定西地區(qū)甘藍(lán)枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌黏團(tuán)?；虵.oxysporumf.sp.conglutinans。

EF-1α;Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans; 鐮刀菌

甘藍(lán)枯萎病是一種危害性極強(qiáng)的土傳性病害,最早于1899年發(fā)現(xiàn)于美國紐約州,目前在全世界多數(shù)夏秋甘藍(lán)栽培地區(qū)都有發(fā)生,如美國、加拿大、希臘、日本等[1-4]。在我國,該病害僅在北京延慶和山西壽陽地區(qū)有病原菌分離鑒定的記載[5-8]。

甘肅省定西市位于甘肅省中部,地處秦嶺以西黃土高原溝壑丘陵區(qū),屬于南溫帶半濕潤、中溫帶半干旱區(qū),夏季氣候涼爽,雨量相對(duì)充沛,晝夜溫差大,有利于各類蔬菜干物質(zhì)的積累,因此成為西北最大的高原夏菜產(chǎn)地。甘藍(lán)作為當(dāng)?shù)氐闹匾?jīng)濟(jì)作物之一,有著悠久的種植歷史和近0.67萬hm2的種植面積。但自2009年起,在田間出現(xiàn)了甘藍(lán)葉片黃化,植株枯萎、死亡等癥狀。2016年,該病害的累計(jì)危害面積近0.2萬hm2,占當(dāng)?shù)馗仕{(lán)種植總面積的30%,嚴(yán)重影響了甘藍(lán)的質(zhì)量和產(chǎn)量,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本文從甘肅定西地區(qū)采集了發(fā)病甘藍(lán)樣品,并進(jìn)行了病原菌的分離與鑒定?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離純化

2015年8月于甘肅省定西市安定區(qū)采集具有典型癥狀的病害樣品,用常規(guī)組織分離方法進(jìn)行病原菌分離與純化[9]。

1.2 致病性測定

采用蘸根法對(duì)分離物進(jìn)行致病性測定。將分離物于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth, PDB)中搖培3 d后,濾除菌絲,收集孢子懸浮液,將其孢子濃度調(diào)至1×107個(gè)/mL。將兩葉一心期‘秋悅’甘藍(lán)(邢蔬種業(yè)有限公司)幼苗的根部浸于孢子懸浮液中15 min,移植在裝有無菌土的10 cm×10 cm(口徑×高度)營養(yǎng)缽中,以無菌水蘸根處理的甘藍(lán)幼苗作為空白對(duì)照。14 d后觀察記載甘藍(lán)發(fā)病情況。同時(shí),采用常規(guī)組織分離方法對(duì)病原菌進(jìn)行再分離,將分離物與初始接種體進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較。

1.3 病原菌形態(tài)特征觀察

將病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)上,25℃黑暗培養(yǎng),3 d后觀察菌落形態(tài)特征,并在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等形態(tài)特征。

1.4 病原菌分子鑒定

1.4.1 DNA提取

將病原菌接種于鋪有玻璃紙的PDA平板上,25℃黑暗培養(yǎng)5 d后收集菌絲,干燥后取0.2 g菌絲于研缽中,加入液氮研磨至粉狀后置于無菌的2.0 mL離心管中,加入800 μL 2% CTAB溶液混勻,65℃水浴15 min;然后加入800 μL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1),混勻后離心15 min (12 000 r/min),取上清液,在上清液中加入800 μL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1),混勻后離心15 min (12 000 r/min),取上清液,在上清液中加入350 μL冰異丙醇,混勻后于4℃下靜置30 min,在4℃條件下離心15 min (12 000 r/min),棄上清液,用75%乙醇洗滌沉淀2次,再用無水乙醇洗滌1次,晾干后加入50 μL超純水充分溶解。利用Nanodrop2000檢測合格后,于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 病原菌ITS、IGS及EF-1α序列擴(kuò)增及測序

PCR擴(kuò)增病原菌核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ribosome DNA internal transcribed spacer, rDNA-ITS)、核糖體DNA基因間隔區(qū)(intergenic spacer, IGS)及延長因子-1α(elongation factors-1α, EF-1α)序列。反應(yīng)體系25 μL:上下游引物(10 μmol/L) 各0.5 μL,10×TransTaq?-T Buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,TransTaq?-T DNA polymerase 0.25 μL,模板DNA (50 ng/μL) l μL, ddH2O 18.25 μL。所用引物及PCR程序見表1。PCR產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析

將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。從GenBank下載鐮刀菌屬代表種及尖孢鐮刀菌不同?；途甑腅F-1α序列,用ClustalX(1.8)進(jìn)行多重序列比對(duì)后,將序列信息導(dǎo)入MEGA(4.0)通過鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,同時(shí)利用Bootstrap(10 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的置信度。

表1 引物信息及PCR擴(kuò)增程序

Table 1 Information of primers and PCR programs

引物Primer引物序列(5'-3')Primersequence擴(kuò)增區(qū)域AmplificationregionPCR擴(kuò)增程序PCRprogramITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGCITS4TCCTCCGCTTATTGATATGCITS[10]94℃5min;94℃30s、55℃30s、72℃1min,35個(gè)循環(huán);72℃10minNL11CTGAACGCCTCTAAGTCAGCNS1GAGACAAGCATATGACTACIGS[11]94℃5min;94℃30s、55℃30s、72℃3min,35個(gè)循環(huán);72℃10minEF-1ATGGGTAAGGARGACAAGACEF-2GGARGTACCAGTSATCATGTTEF-1α[12]94℃5min;94℃30s、55℃30s、72℃1min,35個(gè)循環(huán);72℃10min

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

甘藍(lán)枯萎病在田間會(huì)形成典型的發(fā)病中心,中心的面積表現(xiàn)出連年擴(kuò)展的趨勢,所輻射的區(qū)域也逐年擴(kuò)大。處于發(fā)病中心邊緣的病株一般發(fā)病較輕,僅植株下部部分葉片表現(xiàn)出沿葉脈黃化并伴有輕微萎蔫的現(xiàn)象,病株莖部橫截面維管束處明顯變褐,越靠近發(fā)病中心,病情越加嚴(yán)重,病株葉片幾乎完全黃化,植株矮化枯死,以致田間出現(xiàn)明顯的缺苗斷壟現(xiàn)象(圖1)。

圖1 甘藍(lán)枯萎病發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of cabbage Fusarium wilt

2.2 致病性測定

經(jīng)過病原菌的分離與純化后共得到17個(gè)分離物,根據(jù)形態(tài)學(xué)特征歸為DXF001、DXF002、DXF003和DXF004四類。其中,DXF001包含11個(gè)分離物,占總分離物的64.7%;DXF002包含3個(gè)分離物,占總分離物的17.6%;DXF003包含2個(gè)分離物,占總分離物的11.8%;DXF004包含1個(gè)分離物,占總分離物的5.9%。從每類分離物中選取一個(gè)代表性菌株,分別為DXF001-01、DXF002-01、DXF003-01和DXF004-01,用于致病性測定。結(jié)果顯示,接種14 d后只有接種DXF001-01的植株表現(xiàn)出典型的甘藍(lán)枯萎病癥狀(圖2 b)。再分離物與DXF001-01表現(xiàn)出一致的形態(tài)學(xué)特征,說明DXF001-01為甘藍(lán)枯萎病的病原菌。

圖2 病原菌對(duì)甘藍(lán)致病性測定Fig.2 Pathogenicity identification of the pathogen to cabbage

2.3 病原菌形態(tài)特征

在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)4 d后,病原菌菌落圓形白色,氣生菌絲致密(圖3a);顯微觀察可見其菌絲呈絲狀、無色并伴有隔膜。病原菌產(chǎn)生大量的小型分生孢子和少量的大型分生孢子,其中小型分生孢子為卵圓形至長橢球形或腎型,無隔膜或具1個(gè)隔膜,大小為(3.8～15.0)μm×(1.5～5.0)μm,假頭狀著生于細(xì)長、瓶狀的分生孢子梗上;大型分生孢子鐮刀狀,兩端尖,一般具3～5個(gè)隔膜,大小為(18.6～33.8)μm×(3.2～6.2)μm(圖3b)。根據(jù)病原菌的形態(tài)學(xué)特征,依據(jù)Booth的鐮刀菌屬分類系統(tǒng)[13],該病原菌被鑒定為尖孢鐮刀菌F.oxysporum。

圖3 病原菌于PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征Fig.3 Cultural characteristics of the pathogen on potato dextrose agar (PDA)

2.4 病原菌的分子鑒定

病原菌ITS、IGS及EF-1α序列的測序結(jié)果在GenBank的注冊(cè)號(hào)分別為LC165017、LC165016和LC165018,BLAST分析結(jié)果顯示這3個(gè)序列分別與尖孢鐮刀菌F.oxysporum的相似性達(dá)到了99%、99%和100%。利用病原菌與尖孢鐮刀菌各?；途甑腅F-1α序列信息,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示EF-1α可以對(duì)Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans、Fusariumoxysporumf.sp.lilii、Fusariumoxysporumf.sp.melonis等10個(gè)尖孢鐮刀菌?；瓦M(jìn)行聚類(圖4)。最終DXF001-01被鑒定為尖孢鐮刀菌黏團(tuán)?；?F.oxysporumf.sp.conglutinans)。

圖4 尖孢鐮刀菌代表?；图癉XF001-01 EF-1α基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of translation elongation factor 1α (EF-1α) genes of DXF001-01 and Fusarium oxysporum formae speciales

3 討論

甘藍(lán)枯萎病首次發(fā)現(xiàn)于北京延慶地區(qū),其病原菌被確定為尖孢鐮刀菌黏團(tuán)?；虵.oxysporumf.sp.conglutinans[5,7]。張揚(yáng)等報(bào)道,在北京延慶地區(qū)除尖孢鐮刀菌黏團(tuán)?；虵.oxysporumf.sp.conglutinans外,輪枝樣鐮刀菌F.verticillioides也可導(dǎo)致甘藍(lán)枯萎病的發(fā)生[6]。田仁鵬從山西壽陽地區(qū)甘藍(lán)枯萎病株上分離到的GLHW1,經(jīng)鑒定為尖孢鐮刀菌F.oxysporum[8]。本文則通過形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合分子生物學(xué)方法將甘肅定西地區(qū)甘藍(lán)枯萎病鑒定為尖孢鐮刀菌黏團(tuán)?；虵.oxysporumf.sp.conglutinans。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,病原菌的鑒定不再局限于形態(tài)學(xué)的觀察。本文對(duì)病原菌的ITS序列進(jìn)行了測序,通過序列比對(duì)將病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌F.oxysporum。雖然ITS在進(jìn)化的過程中具有高度的保守性,但是由于鐮刀菌ITS2存在非同源的拷貝,可能會(huì)導(dǎo)致不準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果[14]。而EF-1α序列對(duì)鐮刀菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種的鑒定具有很大的可用性,它在鐮刀菌種的水平上具有豐富的信息量,在鐮刀菌屬中也并未發(fā)現(xiàn) EF-1α 序列的非直系同源拷貝[12]。目前已有很多學(xué)者利用EF-1α構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹成功地對(duì)鐮刀菌進(jìn)行了鑒定[15-17]。為了保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性,本文對(duì)病原菌的EF-1α序列進(jìn)行了擴(kuò)增、測序,并將測序結(jié)果與其他尖孢鐮刀菌?；偷腅F-1α序列進(jìn)行建樹分析,結(jié)果顯示,EF-1α基因可以對(duì)Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans、Fusariumoxysporumf.sp.lilii、Fusariumoxysporumf.sp.melonis等10個(gè)尖孢鐮刀菌?；瓦M(jìn)行聚類,本文所分離的病原菌劃歸于尖孢鐮刀菌黏團(tuán)?；虵.oxysporumf.sp.conglutinans,與前人的研究結(jié)果相一致[5-7]。

有文獻(xiàn)曾報(bào)道尖孢鐮刀菌黏團(tuán)?；虵.oxysporumf.sp.conglutinans的寄主范圍十分廣泛,不僅可以侵染大多數(shù)十字花科作物,還能侵染茄科、葫蘆科、豆科、菊科、旋花科、傘形科及百合科等主要蔬菜作物,并使其成為無癥帶菌的隱性寄主[3,5,18-19]。而甘肅定西是西北最大的高原夏菜產(chǎn)地之一,蔬菜品種多,種植面積廣,因此尖孢鐮刀菌黏團(tuán)專化型F.oxysporumf.sp.conglutinans不僅會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)馗仕{(lán)的生產(chǎn)造成嚴(yán)重的影響,也會(huì)成為其他蔬菜生產(chǎn)的潛在隱患。本研究結(jié)果為當(dāng)?shù)馗仕{(lán)枯萎病的防治奠定了可靠的理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Isolation and identification of the pathogen causing cabbage wilt in Dingxi District, Gansu Province

Shen Yongming1, Li Haiyuan1, Chen Aichang2, Wei Zhouquan2, Hu Xiaoping1

(1.CollegeofPlantProtection,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,China; 2.DingxiStationofPlantProtectionandQuarantine,Gansu743000,China)

Symptoms of stunting, leaf yellowing, withered and dead of cabbage were observed in Dingxi District, Gansu Province since 2009. Samples were collected from diseased field in August, 2015. The pathogen was isolated and purified by the method of general tissue isolation, confirmed according to Koch’s postulates, and identified by morphologic characteristics and molecular identification. The results showed that morphologic characteristics of the pathogen were consistent with those ofFusariumoxysporum. The similarity of rDNA-ITS, rDNA-IGS and EF-1α betweenF.oxysporumand the pathogen is 99%. The phylogenetic analysis of EF-1α gene sequences ofF.oxysporumformaespecialesand the pathogen showed that the pathogen was classified asF.oxysporumf.sp.conglutinans. Thus, the pathogen of cabbage wilt in Dingxi, Gansu wasF.oxysporumf.sp.conglutinans.

EF-1α;Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans;Fusarium

2016-09-07

2016-11-14

定西市蔬菜產(chǎn)業(yè)科技提升項(xiàng)目(DXSK2016006);高原夏菜病害防治技術(shù)與應(yīng)用項(xiàng)目

S 436.35

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.032

* 通信作者 E-mail:xphu@nwsuaf.edu.cn