馮博，周瑩，陳金玲，王英紅

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆 石河子 832000）

ING4在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達及與預(yù)后的關(guān)系

馮博，周瑩，陳金玲，王英紅

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆 石河子 832000）

為檢測生長抑制因子4（ING4）在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達，探討其與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。采用免疫組織化學(xué)法分別檢測20例非瘤子宮內(nèi)膜組織、38例非典型增生性子宮內(nèi)膜組織、76例子宮內(nèi)膜腺癌組織中 ING4的表達，結(jié)合術(shù)后隨訪資料，分析其表達與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，ING4在非瘤組子宮內(nèi)膜組織中陽性表達率為100%,非典型增生性子宮內(nèi)膜組織中表達陽性率為87.2%，而子宮內(nèi)膜腺癌組織陽性表達率為55.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ING4在不同組織分化程度、腫瘤組織大小的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ING4蛋白的表達與患者的年齡、癌組織肌層浸潤深度、有無血管浸潤、腫瘤臨床病理分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ING4表達陰性者 5年生存率與ING4陽性者 5年生存率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。由此可知，ING4的表達與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，檢測ING4的表達對于子宮內(nèi)膜腺癌的臨床診斷有重要意義。

生長抑制因子4；子宮內(nèi)膜腺癌；免疫組織化學(xué)

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma）是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，以來源于子宮內(nèi)膜腺體的腺癌最為常見，其發(fā)病率與死亡率均居女性生殖系統(tǒng)第二位，占女性全身惡性腫瘤第四位。然而，與大部分惡性腫瘤的發(fā)病率下降的趨勢相反，子宮內(nèi)膜癌的死亡率在2000年后隨著其發(fā)病率上升也 呈上升 趨勢［1］。

ING4是生長抑制因子（inhibitor of growth，ING）家族中的一員，因其在染色體的修飾、影響細胞增殖、抑制腫瘤血管生成、抑制腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中起著至關(guān)重要的作用，被認為是重要的腫瘤生長抑制因子。一些觀察表明［2］ING4通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子p53和NF-kappaB（NF-κB）在腫瘤發(fā)生的轉(zhuǎn)錄翻譯階段發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。很多研究報道ING4在腫瘤發(fā)生的過程中表達下調(diào)，然而其在子宮內(nèi)膜腺癌中的研究比較少，本實驗應(yīng)用免疫組化方法通過研究ING4在子宮內(nèi)膜腺癌及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達差異，探討其表達對子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

一抗為兔抗人 ING4多克隆抗體（ab113425）購自英國 Abcam公司，免疫組化Envision染色試劑盒、PBS緩沖液粉劑、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2 標(biāo)本

收集2008年1月-2013年1月在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科手術(shù)并有病理診斷的子宮內(nèi)膜組織蠟塊，根據(jù)術(shù)后病理診斷進行分組，其中對照組為非瘤子宮內(nèi)膜組織，共20例，病例組為非典型增生子宮內(nèi)膜組織39例及子宮內(nèi)膜腺癌組織76例?；颊吣挲g分布為34-79歲，平均54.73歲。所有子宮內(nèi)膜腺癌患者均符合：（1）初次手術(shù)；（2）所有患者術(shù)前均未接受放療、化療等輔助治療；（3）原發(fā)性子宮內(nèi)膜腺癌患者。隨訪時間為42-98個月，中位隨訪期為63個月。

1.3 免疫組化染色

應(yīng)用免疫組化Envision兩步法，對137例子宮內(nèi)膜組織蠟塊標(biāo)本5μm厚連續(xù)切片，烤干，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，置于20%EDTA抗原修復(fù)緩沖液（ph9.0）中高溫高壓抗原修復(fù)8 min，自然冷卻至室溫。3%H2O2常溫孵育10 min，滴加兔抗人ING4多克隆抗體（稀釋度1∶600），4℃孵育過夜。滴加兔鼠通用型生物素化二抗及過氧化氫物標(biāo)記的抗體；DAB顯色，蘇木精復(fù)染2 min，脫水透明封片。用已知陽性組織切片作陽性對照，用PBS溶液代替一抗作為空白對照。

1.4 結(jié)果判定

ING4陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要表現(xiàn)為分布于細胞核和(或)細胞漿內(nèi)的棕褐色顆粒［3-4］。每片均以高倍鏡(×40)觀察5個視野，每個視野約100個細胞，根據(jù)陽性細胞數(shù)及著色強度綜合判斷結(jié)果。根據(jù)細胞陽性率和陽性細胞的著色強度分別計分。細胞著色強度評分：無著色計為0分，淺棕黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分；按陽性細胞數(shù)所占百分比評分規(guī)則：陽性細胞數(shù)＜5%計為0分，6%-25%計為1分，26%-50%計為2分，51%-75%計為3分，76%-100%計為4分。ING4總分為陽性細胞百分比及著色強度相乘分級，所得分數(shù) ＜3，(-)；3–5，(+)；6–9，(++)；＞9，(+++)［5］。最終得分(-)為陰性，(+)為弱陽性，(++)和(+++)為強陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

對ING4表達采用陽性率（%）進行描述，組間ING4表達陽性率的比較采用χ2檢驗或Fisher’s精確概率法，等級資料采用 Kruskal－Wallis H秩和檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Kaplan-Meier法比較組間生存曲線，用Log-Rank法行生存率差異性檢驗，以P＜0.05（雙側(cè)）認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均用SPSS21.0統(tǒng)計軟件包分析。

2 結(jié)果

2.1 ING4在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達情況

本實驗免疫組化染色顯示，ING4蛋白定位于細胞核和（或）細胞漿（圖1），在非瘤組子宮內(nèi)膜組織中陽性表達率為 100%（20/20），其中 95%（19/20）表達為強陽性，非典型增生性子宮內(nèi)膜組織中表達陽性率為87.2%（34/38），其強陽性表達率僅占26.3%（10/38）。而子宮內(nèi)膜腺癌組織陽性表達率為55.3%（42/76），未見強陽性表達，且在子宮內(nèi)膜腺癌組織中發(fā)現(xiàn)，ING4在細胞核中的表達有著色面積減小、著色強度減輕的趨勢。各組間ING4的陽性表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表 1）。

表1 ING4在非瘤組子宮內(nèi)膜組織、非典型增生子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達Tab.1 the expression of ING4 in different endometrial tissues

圖1 ING4在不同子宮內(nèi)膜組織中的陽性表達情況Fig.1 The positive expression of ING4 in different endometrial tissues

2.2 子宮內(nèi)膜癌中ING4的表達與生物學(xué)行為的關(guān)系

子宮內(nèi)膜癌中ING4的表達與生物學(xué)行為的關(guān)系見表2。

表2 ING4在子宮內(nèi)膜腺癌表達及其與臨床特征的關(guān)系 n/%Tab.2 Relationship among expression of ING4 and clinicopathologic factors of endometrial tissues

本實驗分別研究分析了ING4表達與患者年齡、分化程度、癌組織肌層浸潤深度、有無血管浸潤、腫瘤大小、腫瘤臨床病理分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。結(jié)果表明，在子宮內(nèi)膜腺癌組織中，ING4蛋白的表達與患者的年齡、癌組織肌層浸潤深度、有無血管浸潤、腫瘤臨床病理分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ING4蛋白表達在子宮內(nèi)膜腺癌高分化組的陽性表達率為76.2%（16/21），中分化組的陽性表達率為53.5%（23/43），低分化組的陽性表達率為 33.3%（4/12），三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ING4蛋白表達在子宮內(nèi)膜腺癌腫瘤大小≤2cm的陽性表達率為67.5%（27/40），腫瘤大?。? cm的陽性表達率為41.7%（15/36），兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表 2）。

2.3 ING4的表達和子宮內(nèi)膜腺癌患者生存時間的關(guān)系

隨訪日期截止到2016年7月31日，隨訪時間42-98個月。用ING4蛋白陽性表達病例和陰性表達病例進行生存分析，結(jié)果顯示：ING4陰性表達組的中位生存時間為61.5個月，ING4陽性表達組的中位生存時間為66個月。ING4陰性者生存率為93.8%，ING4陽性者的生存率為91.9%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ Log-rankχ2=0.003，P=0.955）。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌（Endometrial Carcinoma，EC）是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，以子宮內(nèi)膜腺癌最常見。是女性生殖系統(tǒng)常見三大惡性腫瘤之一，約占女性癌癥發(fā)病的7%，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20%-30%。其平均發(fā)病年齡為60歲，其中75%發(fā)生于50歲以上婦女，近年來，子宮內(nèi)膜癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率有上升并呈年輕化的趨勢［6］。

本實驗結(jié)果顯示，ING4蛋白在非瘤組子宮內(nèi)膜組織中陽性表達率為100%，其中強陽性表達占95%，非典型增生性子宮內(nèi)膜組織中陽性表達率為87.2%，強陽性表達率下降至26.3%。而子宮內(nèi)膜腺癌組織陽性表達率為55.3%，未見強陽性表達，表明ING4的表達與子宮內(nèi)膜腺癌組織的發(fā)生、發(fā)展成負相關(guān)，即在非瘤組子宮內(nèi)膜組織中呈高表達，隨著子宮內(nèi)膜病變的發(fā)生及腫瘤惡性程度增高，ING4的表達逐漸下調(diào)。提示ING4蛋白在子宮內(nèi)膜病變的發(fā)生過展過程中發(fā)揮抑制作用，ING4表達下調(diào)與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生發(fā)展密不可分。Tapia［7］等檢測了乳腺癌組織中ING4的基因表達，發(fā)現(xiàn)其中16.5%的患者呈現(xiàn)表達缺失。Liu［8］等研究了ING4基因在卵巢癌中的表達，發(fā)現(xiàn)其在mRNA及蛋白水平的表達均下調(diào)，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。ING4的表達在肺癌［9］、結(jié)腸癌［10］和胃腸道間質(zhì)腫瘤［11］也呈現(xiàn)低表達的狀態(tài)。眾多研究均可表明ING4有抑制腫瘤細胞生長的用，與本實驗結(jié)果相符。

本實驗繼而分析了ING4與子宮內(nèi)膜腺癌臨床特征的關(guān)系，結(jié)果表明，在子宮內(nèi)膜腺癌組織中，ING4蛋白表達在不同腫瘤分化程度及腫瘤大小的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。即ING4在子宮內(nèi)膜腺癌高分化組的陽性表達率高于中分化組和低分化組的陽性表達率；在子宮內(nèi)膜腺癌腫瘤大小≤2 cm的陽性表達率高于腫瘤大小＞2 cm的陽性表達率；而ING4蛋白的表達與患者的年齡、癌組織肌層浸潤深度、有無血管浸潤、腫瘤臨床病理分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間均無統(tǒng)計學(xué)意義。據(jù)研究［12］證明：腫瘤細胞分級情況對子宮內(nèi)膜癌患者的生存期有顯著影響，且本研究證實ING4的表達與腫瘤細胞分級成負相關(guān)，進一步提示ING4的表達與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。亦有研究提出：在高度惡性膠質(zhì)母細胞瘤中ING4mRNA的含量較正常腦組織下降6倍，而II-III級膠質(zhì)母細胞瘤中的含量僅下降2-3倍［13］。提示ING4的低表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲相關(guān)，對于子宮內(nèi)膜腺癌的臨床治療及預(yù)后有指導(dǎo)性意義。與本實驗研究結(jié)果相符。蔡玉潔［14］等在ING4與子宮內(nèi)膜癌的表達研究中得出結(jié)論，ING4的表達與組織學(xué)分級顯著相關(guān)，而與肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，但因其RT-PCR結(jié)果顯示，Ⅲ-Ⅳ期子宮內(nèi)膜癌組織中 ING4的表達量顯著低于Ⅰ-Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這一結(jié)論與其ING4免疫組化結(jié)果相反，而本研究中，雖然ING4在FIGO分期Ⅰ-Ⅱ組的陽性表達率和Ⅲ-Ⅳ組的陽性表達率無統(tǒng)計學(xué)意義，但呈下降趨勢，與蔡的結(jié)論中RT-PCR結(jié)果相一致，免疫組化結(jié)果相反，造成這一差異的原因考慮兩個方面：一方面可能是由于樣本量小導(dǎo)致的；另一方面由于本地區(qū)臨床二級預(yù)防開展較好，疾病發(fā)現(xiàn)期別較早，晚期病變樣本量小，從而影響了本研究的結(jié)果。

研究報道［10，15，16］ING4 的低表達與腫瘤的預(yù)后關(guān)系密切，本研究對76例子宮內(nèi)膜腺癌患者進行回顧性分析，根據(jù)生存分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)ING4陽性表達的子宮內(nèi)膜腺癌的生存率有高于ING4陰性表達的趨勢，然而ING4陽性表達病例組和陰性表達病例組的生存率的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，提示ING4的表達對于子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不具有指導(dǎo)意義。此結(jié)論與文獻報道不一致，可能由于樣本量小，存在一定偏倚和個體異質(zhì)性，導(dǎo)致統(tǒng)計結(jié)果出現(xiàn)偏差。

綜上所述，ING4可作為篩查子宮內(nèi)膜病變的診斷指標(biāo)之一，同時一定程度上可以參與指導(dǎo)臨床上對子宮內(nèi)膜腺癌的治療及預(yù)后的判斷。

［1］Siegel R L，Miller K D，Jemal A.Cancer Statistics CA［J］.Cancer Journal for Clinicians，2016，66(1):7-30.

［2］Cui S，Gao Y，Zhang K，et al.The emerging role of inhibitor of growth 4 as a tumor suppressor in multiple human cancers［J］.Cellular Physiology and Biochemistry，International Journal of Experimental Cellular Physiology，Biochemistry，and Pharmacology，2015，36(2):409-422.

［3］Shen J C，Unoki M，Ythier D，et al.Inhibitor of growth 4 suppresses cell spreading and cell migration by interacting with a novel binding partner，liprin alpha1［J］.Cancer Research，2007，67(6):2552-2558.

［4］Bose P，Thakur S，Thalappilly S，et al.ING1 induces apoptosis through direct effects at the mitochondria［J］.Cell Death&Disease，2013(4):788-789.

［5］Zhao D，Liu X，Zhang Y，et al.Reduced expression and prognostic implication of inhibitor of growth 4 in human osteosarcoma［J］.Oncology Letters，2016，11(4):2869-2874.

［6］楊迪，馬曉欣.BCL2-L12在子宮內(nèi)膜癌中的表達及其與病理參數(shù)的關(guān)系［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2017(4):610-613.Yang D，Ma X X.The expression and pathological parametersofBCL2-L12 in endometrialcarcinoma ［J］.Modern Oncolog，2017，25(4):610-613.

［7］Tapia C，Zlobec I，Schneider S，et al.Deletion of the inhibitor of growth 4(ING4)tumor suppressor gene is prevalent in human epidermal growth factor 2(HER2)-positive breast cancer［J］.Human Pathology 2011，42(7):983-990.

［8］Liu Y，Yu L，Wang Y，et al.Expression of tumor suppressorgene ING4 in ovarian carcinoma is correlated with microvessel density ［J］.Journal of Cancer Research and Clinical oncology，2012，138(4):647-655.

［9］Huang J，Yang J，Ling C，et al.The mechanism of inhibition effect of adenovirus-mediated ING4 on human lung adenocarcinoma xenografts in nude mice［J］.Chinese Journal of Lung Cancer，2014，17(2):142-147.

［10］Chen Y，Huang Y，Hou P，et al.ING4 suppresses tumor angiogenesis and functions as a prognostic marker in human colorectal cancer［J］.Oncotarget 2016，7(48):79017-79031.

［11］Nanding A，Tang L，Cai L，et al.Low ING4 protein expression detected by paraffin-section immunohistochemistry is associated with poor prognosis in untreated patients with gastrointestinal stromal tumors［J］.Gastric Cancer:official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association，2014，17(1):87-96.

［12］Bogani G，Dowdy S C，Cliby W A，et al.Management of endometrial cancer:issues and controversies［J］.European Journal of Gynaecological Oncology，2016，37(1):6-12.

［13］Shi X，Hong T，Walter KL，et al.ING2 PHD domain links histone H3 lysine 4 methylation to active gene repression［J］.Nature，2006，442(7098):96-99.

［14］蔡玉潔，邊愛平，趙倩，等.生長抑制因子4在子宮內(nèi)膜癌中的表達及意義［J］.中國婦幼保健，2015(15):2414-2417.Cai Y J，Bian A P，Zhao Q，et al.Expression of inhibitor of growth family member 4 in endometrial cancer and its significance ［J］.Maternal and Child Health Care of China，2015(15):2414-2417.

［15］劉俊遠，黃桂林，張玉婷.生長抑制因子4和人表皮生長因子受體2在結(jié)直腸癌中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2014(29):3469-3472.

Liu J Y，Huang G L，Zhang Y T.Expression of ING4 and HER2 in colorectal cancer and their prognosis significance［J］.Chinese General Practice，2014(29):3469-3472.

［16］Lu J，Tang Y，Cheng Y，et al.ING4 regulates JWA in angiogenesis and their prognostic value in melanoma patients［J］.British Journal of Cancer 2013，109(11):2842-2852.

Expression and prognostic value of inhibitor of growth 4 in endometrial adenocarcinoma

Feng Bo，Zhou Ying，Chen Jinling，Wang Yinghong
（Department of Obstetrics and Gynecology，The First Affiliated Hospital,School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China）

To investigate the expression of ING4 in different endometrial tissues and the association with clinical pathological parameters and prognosis of endometrial adenocarcinoma.Expression of ING4 were detected in 20 cases of benign endometrial tissue,38 cases of atypical hyperplasia of endometrium and 76 cases of endometrial adenocarcinoma tissues by Immunohistochemical method,combined with postoperative follow-up data,the relationship between the ING4 expression and the clinical pathological features and prognosis was analyzed.The positive expression rate of ING4 was 55.3% in endometrial adenocarcinoma tissues,which was significantly lower than those of normal tissue samples and atypical hyperplasia endometrial tissues (100%and 87.2%respectively,P＜0.05).There were significant differences in the differentiation and tumor size.While the differences of the positive expression rates were not statistically significant in the ages,depth of invasion,vascular invasion,clinical pathologic stage and lymph node metastasis (P＞0.05).There was no significant difference in the 5 year survival rate between ING4 expression negative and positive patients.The expression of ING4 is strongly associated with the carcinogenesis and development of the endometrial adenocarcinoma,which suggests that ING4 might be used as prognostic marker for the endometrial adenocarcinoma．

Inhibitor of Growth 4;endometrial adenocarcinoma;Immunohistochemistry(IHC)

R711.74

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.03.016

1007-7383(2017)03-0363-05

2017-01-19

科技惠民計劃專項項目（2013GS650104）

馮博（1990-），女，碩士研究生，專業(yè)方向為婦科腫瘤。

*通信作者：王英紅（1960-），女，主任醫(yī)師，從事婦科腫瘤、婦科內(nèi)鏡研究，e-mail：wyhxj920@sina.com。