程仁洪，鄭健新，張 偉 （福州總醫(yī)院急診科，福建 福州 350025）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注對(duì)膿毒癥大鼠促炎因子和心功能的影響

程仁洪，鄭健新，張 偉 （福州總醫(yī)院急診科，福建 福州 350025）

目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）輸注對(duì)膿毒癥大鼠促炎因子和心功能的影響．方法：將BMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)之后，選取24只成功建立膿毒癥模型（盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)，CLP法）的Wistar大鼠，依照隨機(jī)數(shù)字法分成膿毒癥組、間充質(zhì)干細(xì)胞組以及上清液（間充質(zhì)干細(xì)胞上層培養(yǎng)液）組各8只，另選8只接受假手術(shù)干預(yù)的Wistar大鼠作為假手術(shù)組，各組均經(jīng)大鼠尾靜脈注射給藥干預(yù)1周，干預(yù)后以雙抗體免疫夾心法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、肌鈣蛋白、白介素?6（IL?6）、心肌勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量，同時(shí)在治療后利用超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)各組小鼠的心功能．結(jié)果：間質(zhì)干細(xì)胞組TNF?α（1253．701±326．960）pg／mL、肌鈣蛋白（79．720±11．352）pg／mL、IL?6（747．596±33．184）pg／mL、LVDS（2．925±0．271）mm與上清液組TNF?α（1337．888±201．937）pg／mL、肌鈣蛋白（83．923±14．491）pg／mL、IL?10（749．253 ±37．118）pg／mL、LVDS（3．013±0．236）mm顯著低于膿毒癥組（P＜0．05）．間質(zhì)干細(xì)胞組SOD（108．199±20．081）U／mg、LVEF（77．125±1．808）%與上清液組SOD（109．691±18．609）U／mg、LVEF（77．750±1．669）%顯著高于膿毒癥組（P＜0．05），且與假手術(shù)組水平接近（P＞0．05）．結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注能夠改善膿毒癥大鼠心功能，其作用機(jī)制可能與其能夠調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)有關(guān)．

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；膿毒癥；促炎因子；心功能

0 引言

膿毒癥是嚴(yán)重?zé)齻?、感染等急危重癥者最常見(jiàn)的并發(fā)癥，被認(rèn)為是重癥監(jiān)護(hù)患者最主要的死亡原因［1－4］．目前關(guān)于膿毒癥研究不斷增多，臨床已經(jīng)證實(shí)感染、炎癥反應(yīng)、組織損傷、免疫功能等均能夠影響膿毒癥的轉(zhuǎn)歸，有效治療膿毒癥極為重要．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）被證實(shí)具有心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，而且具有免疫調(diào)節(jié)能力．目前實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［6－9］BMSCs能夠抑制膿毒癥模型動(dòng)物體內(nèi)促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平，在阻止炎癥細(xì)胞組織浸潤(rùn)和氧化損傷的基礎(chǔ)上，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)菌清除效果，對(duì)于膿毒癥有一定治療效果．本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察BMSCs輸注對(duì)膿毒癥大鼠促炎因子、心功能的影響，初步分析了BMSCs輸注治療膿毒癥的潛在價(jià)值．

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)別的Wistar大鼠，全部購(gòu)自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司．

1．2 儀器和試劑 潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣公司）、倒置顯微鏡（日本奧林巴斯）、二氧化碳培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司）、BMSCs完全培養(yǎng)基（澳賽爾斯生物技術(shù)公司）、TNF?α、IL?6等試劑（美國(guó)Sigma公司）、EDTA消化液（索萊寶科技有限公司）、胎牛血清（四季青生物有限公司）．

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 膿毒癥模型建立方法 大鼠編號(hào)并稱量體重之后，按照20 mg／kg的劑量腹腔注射脂多糖毒素．假手術(shù)組注入物是等量生理鹽水．

1．3．2 動(dòng)物分組及干預(yù)方法 利用CLP法建立膿毒癥模型，選取成功建立模型的24只Wistar大鼠，依照數(shù)字法分成膿毒癥組、間充質(zhì)干細(xì)胞組、上清液組各8只，另選8只接受假手術(shù)干預(yù)的Wistar大鼠作為假手術(shù)組，假手術(shù)組、膿毒癥大鼠干預(yù)方法為在尾靜脈注射生理鹽水0．5 mL，間充質(zhì)干細(xì)胞組注射物為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞重懸溶液，密度為2×106個(gè)，上清液組注射物為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)的上層清液，注射量均為0．5 mL，術(shù)后干預(yù)1周．

1．4 觀察指標(biāo)

1．4．1 血清TNF?α、肌鈣蛋白、IL?6檢測(cè) 檢測(cè)炎癥因子（TNF?a、IL?6）、肌鈣蛋白Ⅰ，檢測(cè)步驟參照說(shuō)明書，按步驟逐一進(jìn)行，每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔進(jìn)行．

1．4．2 心肌勻漿SOD和MDA檢測(cè) ①制備勻漿介質(zhì)：1 L超純水，依次加入甘露醇 40．0774 g，蔗糖23．9603 g，HEPES 0．59575 g，EDTA 0．58448 g，攪拌，滴加數(shù)滴NaOH助溶，溶解后調(diào)pH至7．4；②10%心肌勻漿制備：稱取100 mg心肌組織，剪碎后放入玻璃勻漿器中，按1∶9的比例加入9倍體積的勻漿介質(zhì)，在冰浴條件下研磨30次．4℃，5000 g離心10 min，取上清．③心肌勻漿SOD檢測(cè)：10%心肌勻漿稀釋成0．5%心肌勻漿，考馬斯亮藍(lán)法（南京建成）測(cè)蛋白濃度，用總超氧化物歧化酶測(cè)試盒檢測(cè)SOD（南京建成）．④心肌勻漿MDA檢測(cè)：10%心肌勻漿稀釋成0．5%心肌勻漿，考馬斯亮藍(lán)法（南京建成）測(cè)蛋白濃度，用丙二醛測(cè)試盒檢測(cè)MDA（南京建成）．

1．4．3 心功能 阿洛卡F75型超聲儀檢測(cè)心動(dòng)圖，檢測(cè)指標(biāo)有左心室收縮末徑（left ventricular systolic diameter，LVDs）和左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）．每只大鼠均連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期的原始數(shù)據(jù)，并將平均值作為結(jié)果，該操作由經(jīng)驗(yàn)豐富的超聲科醫(yī)生協(xié)助完成．

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料表達(dá)用±s，多組間分析用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 組間血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析 血清炎癥因子檢測(cè)結(jié)果顯示，膿毒癥組血清TNF?α、肌鈣蛋白、IL?6顯著高于其他組，間質(zhì)干細(xì)胞組、上清液組血清TNF?α、肌鈣蛋白、IL?6雖然高于假手術(shù)組，但是組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05，表1～3）．

表1 各組血清炎癥因子表達(dá)水平（n＝8，pg／mL）

表2 各組血清炎癥因子單因素方差分析結(jié)果

表3 各組血清炎癥因子LSD多重比較

2．2 組間心肌SOD和MDA檢測(cè)結(jié)果分析 假手術(shù)組心肌SOD顯著高于其他組，而MDA顯著低于其他組，膿毒癥組心肌SOD顯著低于間質(zhì)干細(xì)胞組、上清液組，而各組間心肌MDA水平無(wú)顯著性差異，表4～6．

表4 組間心肌SOD和MDA檢測(cè)結(jié)果 （n＝8）

表5 組間心肌SOD和MDA單因素方差分析

表6 心肌SOD和MDA檢測(cè)結(jié)果多重比較

2．3 組間心功能檢測(cè)結(jié)果分析 膿毒癥組LVEF顯著低于其他組，而LVDS顯著高于其他組，假手術(shù)組心肌、間質(zhì)干細(xì)胞組、上清液組LVEF、LVDS水平無(wú)顯著性差異，見(jiàn)表7～9．

表7 組間心功能檢測(cè)結(jié)果（n＝8）

表8 心功能單因素方差分析

表9 心功能組間多重比較（n＝8）

3 討論

膿毒癥（sepsis）是感染、燒／創(chuàng)傷、休克等急危重患者的嚴(yán)重并發(fā)癥，死亡率高達(dá)20%以上，如果出現(xiàn)休克，死亡率明顯增加．心臟是膿毒癥時(shí)最常見(jiàn)受累的器官．心功能障礙是膿毒癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥，是導(dǎo)致膿毒癥早期死亡的主要原因，且病死率隨著年齡的增加而增加．因此，采取有效措施保護(hù)心功能、減輕心功能障礙是提高膿毒癥救治成功率的重要措施［10－12］．

在膿毒癥病情發(fā)展進(jìn)程中，炎癥反應(yīng)貫穿始終．感染引起炎癥因子大量釋放，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致組織灌注壓降低、白細(xì)胞／血小板黏附增加、纖維素沉積、紅細(xì)胞剛性增加等一系列改變．組織灌注不足導(dǎo)致的缺氧又與炎癥互為因果、相互促進(jìn)，最終導(dǎo)致器官功能障礙、患者死亡．同時(shí)，膿毒癥患者免疫系統(tǒng)失衡，也是導(dǎo)致其預(yù)后不佳的主要原因之一．因此，膿毒癥治療中抗炎治療與免疫調(diào)理越來(lái)越受到關(guān)注．

本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)構(gòu)造膿毒癥大鼠模型，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌鈣蛋白和心臟收縮舒張功能都發(fā)生異常，提示膿毒癥大鼠出現(xiàn)膿毒癥心肌病，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)．隨后在不同干預(yù)方式下，研究各組大鼠的炎癥因子表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞組、上清液組的促炎癥因子TNF?α、IL?6表達(dá)水平顯著低于膿毒癥組，其表達(dá)量與假手術(shù)大鼠極為接近，說(shuō)明間充質(zhì)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物都能抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)的作用．

超聲心動(dòng)圖分析膿毒癥大鼠心功能情況，發(fā)現(xiàn)在膿毒癥條件下，大鼠的心功能出現(xiàn)肌鈣蛋白升高、左室LVEF降低，表明膿毒癥的確能造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心功能損傷．實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞組、上清液組的超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)結(jié)果明顯優(yōu)于膿毒癥組，說(shuō)明間充質(zhì)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物均能夠改善心功能．這可能與間充質(zhì)干細(xì)胞自身特點(diǎn)有關(guān)．間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化能力［13－16］，能夠向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，對(duì)損傷組織具有修復(fù)能力，并且能夠通過(guò)自分泌途徑、旁分泌途徑產(chǎn)生抑制炎癥反應(yīng)和調(diào)控免疫功能的作用，因此，間充質(zhì)干細(xì)胞和充質(zhì)干細(xì)胞分泌物均有明顯的治療作用．但是本實(shí)驗(yàn)中充質(zhì)干細(xì)胞組、上清液組MAD水平未見(jiàn)明顯改善，這可能與干預(yù)時(shí)間短、組織損傷和線粒體損傷修復(fù)所需時(shí)間長(zhǎng)有關(guān)，間充質(zhì)干細(xì)胞組對(duì)于心肌線粒體功能的影響仍需長(zhǎng)期大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研討．

線粒體是心肌獲取能量的主要場(chǎng)所，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損在心肌損傷的發(fā)生發(fā)展中有重要影響．SOD作為抗氧化金屬酶能夠反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力，MAD作為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，能夠反映組織氧化損傷程度和線粒體損傷程度，在一定程度上反應(yīng)心肌損傷情況．本實(shí)驗(yàn)中分析各組大鼠SOD、MAD水平發(fā)現(xiàn)，膿毒癥能顯著降低機(jī)體抗氧化能力，同時(shí)造成組織細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷．而間充質(zhì)干細(xì)胞及其上清液能夠提高SOD水平，從而有效保護(hù)機(jī)體抗氧化能力，發(fā)揮保護(hù)臟器功能的作用．間充質(zhì)干細(xì)胞組、上清液組的超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)結(jié)果明顯優(yōu)于膿毒癥組，也和間充質(zhì)干細(xì)胞及其上清液能抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)，減輕機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的機(jī)制有關(guān)．

綜上所述，膿毒癥大鼠通過(guò)過(guò)度的炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)過(guò)氧化損傷等機(jī)制損傷心臟功能．間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞培養(yǎng)上清可以通過(guò)抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化損傷等功能實(shí)現(xiàn)改善膿毒癥大鼠的心臟功能．

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Effects of bone marrow mesenchymal stem cells infusion on proinflammatory cytokines and cardiac function for septic rats

CHENG Ren?Hong，ZHENG Jian?Xin，ZHANG Wei Emergency Department of Fuzhou General Hospital， Fuzhou 350025，China

AIM：To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）infusion on proinflammatory cytokines and cardiac function for sepsis rats．METHODS：The BMSCs were isolated and cultured，and 24 Wistar rats were se?lected and established sepsis model successfully（cecal ligation and puncture，CLP）．According to the random number method，they were randomly divided into sepsis group，mesenchymal stem cells group and supernatant group（mesenchymal stem cells cul?tured upper supernatant），8 rats in each group．Another 8 Wistar rats with sham surgical intervention were selected as sham opera?tion group．Each group was given subcutaneous injection interven?tion for one week．After the intervention，the serum tumor necrosis factor?α（TNF?α），troponin，interleukin?6（IL?6）were detected by double antibody sandwich method．The superoxide dismutase（SOD）in myocardial homogenate and malondialdehyde（MDA）content were detected at the same time．After the treatment，cardi?ac function of each group was evaluated by echocardiography．RESULTS：In mesenchymal stem cells group，TNF?α（1253．701 ±326．960）pg／mL，troponin（79．720±11．352）pg／mL，IL?6（747．596±33．184）pg／mL，LVDS（2．925±0．271）mm and in su?pernatant group，TNF?α（1337．888±201．937）pg／mL，troponin（83．923±14．491）pg／mL，IL?6（749．253±37．118）pg／mL，LVDS（3．013±0．236）mm were significantly lower than those of sepsis group（P＜0．05）．In mesenchymal stem cells group，SOD（108．199±20．081）U／mg，LVEF（77．125±1．808）%and in supernatant group，SOD（109．691±18．609）U／mg，LVEF（77．750±1．669）% were significantly higher than those of sepsis group（P＜0．05），and which were close to the level of sham operation group（P＞0．05）．CONCLUSION：Bone marrow mesenchymal stem cells infusion can improve cardiac function of septic rats with sepsis and its mechanism may be related to its regulating of inflammatory factors expression．

bone marrow mesenchymal stem cells infusion；sep?sis；proinflammatory cytokines；cardiac function

2095?6894（2017）06?20?06

R459．7

A

2017－05－05；接受日期：2017－05－20

福建省自然科學(xué)基金（2013J1037）

程仁洪．碩士，主治醫(yī)師．研究方向：急診醫(yī)學(xué)．E?mail：zh?easy＠163．com

張 偉．博士，副主任醫(yī)師．研究方向：急診醫(yī)學(xué)．E?mail：zh?easy＠163．com