王麗，張星平,2，王萬舜，曾焰燦，張歡，阿斯亞木·木沙江

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)國(guó)家十二五中醫(yī)各家學(xué)說重點(diǎn)學(xué)科,新疆 烏魯木齊 830000)

肝氣郁結(jié)證致ED大鼠模型建立的實(shí)驗(yàn)研究

王麗1，張星平1,2，王萬舜1，曾焰燦1，張歡1，阿斯亞木·木沙江1

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)國(guó)家十二五中醫(yī)各家學(xué)說重點(diǎn)學(xué)科,新疆 烏魯木齊 830000)

目的:建立肝氣郁結(jié)型陽痿病證大鼠模型，并評(píng)價(jià)模型的可行性。方法:采用復(fù)合情志刺激法施予刺激，建立大鼠肝氣郁結(jié)證候模型。觀察大鼠生物學(xué)表征，判定證候模型建立后，通過性行為學(xué)交配實(shí)驗(yàn)及APO勃起功能實(shí)驗(yàn)比較對(duì)照組、肝郁組大鼠的性行為變化。結(jié)果:(1)生物學(xué)表征：肝郁組生物學(xué)表征改變符合中醫(yī)臨床證候特點(diǎn)，且表現(xiàn)隨造模周期的延長(zhǎng)逐漸加重。(2)性行為學(xué)交配實(shí)驗(yàn)：肝郁組大鼠的爬背潛伏期、插入潛伏期、射精潛伏期較對(duì)照組大鼠均有所延長(zhǎng)(P<0.05)，而爬背次數(shù)、插入次數(shù)、射精次數(shù)較正常組大鼠均有所減少(P<0.05)。(3)APO勃起功能實(shí)驗(yàn)：肝郁組大鼠的勃起潛伏期較對(duì)照組有所延長(zhǎng)(P<0.05)，勃起次數(shù)較對(duì)照組有所減少(P<0.05)。結(jié)論:(1)采用復(fù)合情志造模法可成功建立中醫(yī)肝氣郁結(jié)證候大鼠模型，其生物學(xué)表征符合中醫(yī)臨床證候特點(diǎn)。(2)從肝氣郁結(jié)證候大鼠模型中可成功篩選出陽痿病證大鼠模型，說明該模型具有可靠性。

肝氣郁結(jié)；陽痿；動(dòng)物模型；復(fù)合情志造模法

近年來，隨著生活節(jié)奏加快，壓力增大，男性勃起功能障礙(erectile dysfunction,ED)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。勃起功能障礙現(xiàn)已成為當(dāng)今社會(huì)困擾人類健康一大問題[1]。勃起功能障礙(ED)，是指男性在性生活時(shí)，陰莖不能勃起或勃起不堅(jiān)或堅(jiān)而不久，不能完成正常性生活，或陰莖根本無法插入陰道進(jìn)行性交的一類男科疾病，中醫(yī)稱“陽痿”，又稱“陽事不舉”等。ED不但影響著患者的生活質(zhì)量、家庭和睦與社會(huì)的和諧，更給男性患者造成較大的身心痛苦，當(dāng)今社會(huì)是精神文明和物質(zhì)文明高速發(fā)展的時(shí)期，ED越來越被社會(huì)所關(guān)注，近年來較多注重于ED的中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究，對(duì)防治ED起到了很好的指導(dǎo)作用。ED發(fā)病的病因是多方面且復(fù)雜的[2]，中醫(yī)認(rèn)為ED的主要病因有情志刺激，房勞過度，勞傷久病，飲食不節(jié)，外邪侵襲等；基本病機(jī)為肝、腎、心、脾受損，經(jīng)脈空虛，或經(jīng)絡(luò)阻滯，導(dǎo)致宗筋失養(yǎng)而發(fā)為ED[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過復(fù)合情志造模法建立肝氣郁結(jié)證大鼠模型，探討肝氣郁結(jié)證與ED的可能發(fā)病機(jī)制。從而篩選出更合適的肝氣郁結(jié)致ED大鼠模型建立的方法。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只清潔級(jí)雄性SD大鼠，10只性成熟雌性大鼠(鼠齡2.5個(gè)月)，平均體質(zhì)量(200±20)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買。

1.2 主要試劑藥物及實(shí)驗(yàn)儀器

阿撲嗎啡(Apomorphine，APO，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：1001877691)，黃體酮(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：S151009)，雌二醇(寧波三生制藥有限公司，批號(hào)：S151002),維生素C注射液(河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司，批號(hào)：1508151)。LT3002E電子天平:北京賽多科斯天平有限公司。觀察箱：新疆醫(yī)科大學(xué)解剖教研室提供。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

20只雄性SD大鼠經(jīng)交配實(shí)驗(yàn)及APO勃起功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大鼠均具有正常性功能。采用隨機(jī)數(shù)字表法分組，分為對(duì)照組、肝郁組，每組10只。實(shí)驗(yàn)第1～10天于常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)(溫度22～27℃，濕度48%～53%，12/12 h人工照明)。第7天進(jìn)行第一次性行為學(xué)交配實(shí)驗(yàn)及APO勃起功能實(shí)驗(yàn)。10天后進(jìn)入造模階段。

2.2 實(shí)驗(yàn)造模刺激方法

對(duì)照組于常規(guī)環(huán)境中飼養(yǎng)，每日予400 g普通飼料、1 000 mL水，不施予任何不良情志刺激。肝郁組大鼠常規(guī)方法飼養(yǎng)，每日予400 g普通飼料、1 000 mL水；采用復(fù)合情志造模法[4-6]，每日施予下列刺激中的一種：冰水浸泡(在塑料桶中盛4℃冰水，水深9 cm，將大鼠放入浸泡3 min)、禁水24 h、束縛(將大鼠固定于鋼制束縛桶內(nèi)4 h)、禁食24 h、夾尾(用25 cm長(zhǎng)尾票夾在距尾端1 cm處30 min)、電擊(將大鼠放入電擊籠內(nèi)，每籠5只，電擊30 min,上調(diào)最大電壓至35V)。每日一種刺激，連續(xù)30天，為達(dá)到不可預(yù)見性，采用分段不重復(fù)隨機(jī)數(shù)字表法選取刺激順序如表1。

表1 刺激順序

2.3 造模期間觀測(cè)指標(biāo)

2.3.1 定性指標(biāo)

(1)皮膚毛發(fā)：日光燈下觀察毛發(fā)的榮枯。(2)日?；顒?dòng)：觀察600 s并保證周圍無雜音，主要觀察各大鼠的活動(dòng)情況及相互反應(yīng)靈敏度。(3)睡眠狀態(tài)：燈光調(diào)暗并保持安靜，觀察1 800 s，觀察大鼠休息情況。(4)刺激反應(yīng)：用夾尾實(shí)驗(yàn)判斷大鼠對(duì)刺激的反應(yīng)。(5)飲水狀態(tài)：給予水時(shí)，觀察其飲水情況，主要是觀察大鼠有無互相爭(zhēng)水現(xiàn)象。(6)尿：主要觀察大鼠當(dāng)時(shí)排出小便的量與色的情況。(7)大便：主要觀察大鼠當(dāng)時(shí)排出大便的量與形態(tài)。

2.3.2 定量指標(biāo)

(1)體質(zhì)量：每周三做完性行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，對(duì)大鼠進(jìn)行稱質(zhì)量。(2)性行為學(xué)指標(biāo)。(3)APO勃起功能實(shí)驗(yàn)。

2.4 性行為學(xué)交配實(shí)驗(yàn)及APO勃起功能實(shí)驗(yàn)的操作方法

2.4.1 性行為學(xué)交配實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)安排在北京時(shí)間20:00開始，保持室內(nèi)安靜，調(diào)暗燈光，以剛好能看清為宜。將實(shí)驗(yàn)雄鼠放置于觀察箱中5～10 min適應(yīng)環(huán)境后，將雌鼠(已進(jìn)行發(fā)情期制備)輕輕放入籠中。每只觀察箱中放置1只雄鼠，2只雌鼠。觀察1 800 s內(nèi)雄性大鼠的爬背潛伏期、爬背次數(shù)、插入潛伏期、插入次數(shù)、射精潛伏期、射精次數(shù)。若雄性大鼠在1 800 s內(nèi)未進(jìn)行爬背，則該大鼠爬背潛伏期記為1 800 s,爬背次數(shù)記為0。插入與射精行為同理[7]。

2.4.2 APO勃起功能實(shí)驗(yàn)

參照Heaton[8]等的方法，實(shí)驗(yàn)安排在北京時(shí)間20:00開始，保持室內(nèi)安靜，調(diào)暗燈光，以剛好能看清為宜。將實(shí)驗(yàn)雄鼠放置于觀察箱中5～10 min適應(yīng)環(huán)境，每只觀察箱中放置3只雄鼠。在大鼠皮下注射鹽酸阿撲嗎啡90 μg/kg(0.5 mg/kg維生素C于中溶解阿撲嗎啡后，與5 mL/kg生理鹽水混勻)，注射后立即觀察，采用倒計(jì)時(shí)法記錄大鼠在1 800 s內(nèi)的勃起潛伏期、勃起次數(shù)。若1 800 s內(nèi)未見勃起，則該大鼠勃起潛伏期記為1 800 s，勃起次數(shù)記為0。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 生物學(xué)表征變化

造模期間肝郁組大鼠逐漸出現(xiàn)毛發(fā)雜亂且粗糙暗淡無光澤，體型瘦小，倦怠嗜臥，貼邊喜扎堆，飲食減少，爭(zhēng)水現(xiàn)象明顯減少甚至消失，對(duì)刺激的反應(yīng)逐漸減弱，易捕捉，尿量減少，色偏黃，大便溏薄，舌質(zhì)黯，苔薄膩，有瘀點(diǎn)。對(duì)照組大鼠毛發(fā)順，有光澤，日?；顒?dòng)及睡眠狀態(tài)正常，偶有相互追打現(xiàn)象，對(duì)刺激(夾尾實(shí)驗(yàn))的反應(yīng)敏感，有正常的爭(zhēng)水現(xiàn)象，尿?yàn)闇\黃色，尿量正常，大便成形，舌質(zhì)淡紅，苔薄白。

3.2 體質(zhì)量

造模第1周，肝郁組體質(zhì)量與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模第2周，肝郁組大鼠體質(zhì)量較對(duì)照組相比減少(P<0.05)。造模第3～4周，肝郁組大鼠體質(zhì)量較對(duì)照組相比顯著減少(P<0.01)。見表2。

3.3 性行為學(xué)交配實(shí)驗(yàn)結(jié)果

造模第1～2周，肝郁組大鼠與對(duì)照組相比，爬背潛伏期、爬背次數(shù)、插入潛伏期、插入次數(shù)、射精潛伏期、射精次數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模第3周，肝郁組大鼠爬背次數(shù)、插入次數(shù)、射精次數(shù)較對(duì)照組相比均減少(P<0.05)，而爬背潛伏期、插入潛伏期、射精潛伏期較對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模第4周，肝郁組大鼠爬背次數(shù)、插入次數(shù)、射精次數(shù)較對(duì)照組相比均減少(P<0.05)，爬背潛伏期、插入潛伏期、射精潛伏期較對(duì)照組相比均增加(P<0.05)。見表3～表8。

3.4 APO勃起功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果

造模第1～2周，肝郁組大鼠與對(duì)照組相比，勃起潛伏期和勃起次數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模第3～4周，肝郁組大鼠較對(duì)照組相比勃起潛伏期增加(P<0.05)，勃起次數(shù)減少(P<0.05)。見表9～表10。

表2 各組體質(zhì)量比較

注：與對(duì)照組比較,*P<0.01，**P<0.01

表3 各組爬背潛伏期比較

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05

表4 各組爬背次數(shù)比較

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05

表5 各組插入潛伏期比較

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05

表6 各組插入次數(shù)比較

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05

表7 各組射精潛伏期比較

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05

表8 各組射精次數(shù)比較

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05

表9 各組勃起潛伏期比較

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05

表10 各組勃起次數(shù)比較

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05

4 討論

臨床流行病學(xué)資料顯示，在五臟病證中，中醫(yī)肝臟病證占總體病證40%[9]，而肝郁證是肝臟病證的基本病理變化，是肝病證候的核心，是最為常見的中醫(yī)臟腑證候之一。因此建立和復(fù)制中醫(yī)“肝郁證”模型對(duì)研究中醫(yī)臨床病證的辨證論治有著重要的意義。本實(shí)驗(yàn)旨在建立肝氣郁結(jié)證的大鼠模型，進(jìn)而探討肝氣郁結(jié)證與發(fā)生ED的可能機(jī)制。

4.1 肝氣郁結(jié)證致ED大鼠模型的建立原理

陰器的正常功能既依賴腎精腎氣的充盈，也依靠肝臟疏泄功能的正常。肝主疏泄，體陰用陽，喜條達(dá)而惡抑郁。當(dāng)下社會(huì)、家庭生活壓力增大，使肝氣郁結(jié)證型發(fā)病率日益增高，成為最常見的中醫(yī)證型之一[10]。因此我們實(shí)驗(yàn)從肝郁論治，認(rèn)為肝郁可以導(dǎo)致ED。歷代古籍中關(guān)于肝郁致ED也可找到相關(guān)理論依據(jù)。如《素問·厥論》指出：“前陰者，宗筋之所聚”?！鹅`樞·經(jīng)脈》載有：“肝，足厥陰之脈……循陰股，入毛中，過陰器……其別者，經(jīng)脛上睪，結(jié)于莖”。其他如《增補(bǔ)病機(jī)沙篆》也指出陰器由宗筋所系，統(tǒng)屬于肝；也即陰莖勃起必須以肝氣和肝經(jīng)功能正常為保證，若肝臟及肝經(jīng)為病，勢(shì)必累及宗筋發(fā)為ED?？傊?，肝臟情志調(diào)暢是保持陰莖正常勃起的基本條件之一。情志和調(diào)則氣機(jī)升降自如、氣血調(diào)暢，若有所動(dòng)情，陰莖則能勃發(fā)而起；若情志活動(dòng)異常，氣機(jī)失調(diào)、氣血運(yùn)行不循常道，無法完成勃起活動(dòng)，則發(fā)ED。郁怒、思慮、驚恐、悲憂等情志因素是肝郁ED的主要發(fā)病原因。

據(jù)此查閱近20年文獻(xiàn)，搜索了陽痿、肝氣郁結(jié)證、大鼠模型、ED等關(guān)鍵詞，結(jié)果顯示近年來關(guān)于肝郁證動(dòng)物模型的建立方法主要有下面幾種：①藥物造模法：艾葉注射法和腎上腺皮下注射法；②情志刺激造模法：頸部帶枷單籠飼養(yǎng)法、夾尾激怒打斗法和捆綁法；③藥物+情志刺激造模法[11]。而在組合了肝氣郁結(jié)證與ED兩個(gè)關(guān)鍵詞后搜索文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)雖然有關(guān)于肝郁證ED大鼠模型的研究，但研究者甚少。僅有研究者在研究肝郁證ED大鼠模型時(shí)，采用束縛盒慢性應(yīng)激法建立肝郁證大鼠模型后，探討肝郁證與ED的發(fā)病機(jī)制[12]；至今尚未見用復(fù)合情志造模法建立肝氣郁結(jié)證致ED大鼠的模型，因此本實(shí)驗(yàn)以“證候模型”為造模理念，以復(fù)合情志造模法為干預(yù)方法建立肝氣郁結(jié)證致ED的大鼠模型。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)組合了慢性的不可預(yù)見的復(fù)合不同情志刺激方法，使動(dòng)物無法預(yù)知未來刺激，避免適應(yīng)現(xiàn)象的發(fā)生，也可更好地模擬臨床情志異常引發(fā)肝郁證的過程。以此方法建立的中醫(yī)肝郁證大鼠模型可以造成大鼠不適而又無法緩解，進(jìn)而大鼠有氣不能發(fā)泄而抑制體內(nèi)的憤恨，憂思郁怒，情志不遂，致肝失調(diào)達(dá)，疏泄不利，氣機(jī)不暢，脈絡(luò)不張，血液不充，宗筋弛縱，引發(fā)ED。

4.2 生物學(xué)表征

肝郁證的基本病機(jī)是肝失疏泄，臨床主要表現(xiàn)為：精神抑郁，情緒不寧，胸部滿悶，脅肋脹痛，痛無定處，脘悶噯氣，不思飲食，大便不調(diào)，苔薄膩，脈弦[13]。本實(shí)驗(yàn)中肝郁組大鼠隨著造模周期的延長(zhǎng)，逐步開始出現(xiàn)肝氣郁結(jié)的證候特點(diǎn)，即：飲食量、飲水量及尿量均減少，大便溏薄，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢甚至下降。在行為上，表現(xiàn)為倦怠嗜臥，貼邊喜扎堆，由最初喜歡爭(zhēng)水到最后爭(zhēng)水現(xiàn)象減少甚至消失。舌象由最初淡紅舌、薄白苔變?yōu)樯噘|(zhì)黯淡、苔薄白、有瘀點(diǎn)。以上生物學(xué)表征的變化與文獻(xiàn)[13-14]中描述的大鼠肝氣郁結(jié)證候基本一致,符合中醫(yī)臨床肝氣郁結(jié)證候特點(diǎn)。

4.3 體質(zhì)量變化

隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，肝郁組大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)逐漸緩慢甚至下降，與性功能下降呈正相關(guān)關(guān)系。體質(zhì)量下降可作為肝氣郁結(jié)證的一項(xiàng)判定標(biāo)準(zhǔn)[13]。肝郁組體質(zhì)量下降反映了本實(shí)驗(yàn)采用的慢性的不可預(yù)知的復(fù)合情志造模法建立的肝氣郁結(jié)證大鼠模型是可靠的。

4.4 性行為學(xué)實(shí)驗(yàn)及勃起功能實(shí)驗(yàn)

隨著造模周期的延長(zhǎng)，同時(shí)可見陰莖勃起功能與性行為學(xué)能力逐漸減退。具體表現(xiàn)為：在APO勃起功能實(shí)驗(yàn)中，肝郁組大鼠的勃起潛伏期較對(duì)照組逐漸延長(zhǎng)，勃起次數(shù)較對(duì)照組逐漸減少。在性行為學(xué)交配實(shí)驗(yàn)中，肝郁組大鼠的爬背潛伏期、插入潛伏期、射精潛伏期較對(duì)照組均逐漸延長(zhǎng)，而爬背次數(shù)、插入次數(shù)、射精次數(shù)較對(duì)照組均逐漸減少甚至消失。證明隨著造模周期的延長(zhǎng)，肝郁組大鼠的陰莖勃起功能與性行為學(xué)能力逐漸減退。直至造模第4周，APO勃起功能實(shí)驗(yàn)中不能正常勃起且性行為學(xué)交配實(shí)驗(yàn)中不能交配的大鼠占肝郁組全部大鼠的50%。說明通過慢性的不可預(yù)知的復(fù)合情志造模法可以篩選出肝氣郁結(jié)證致ED大鼠模型。

本實(shí)驗(yàn)表明，從模擬病因、證候表現(xiàn)、慢性應(yīng)激過程等方面建立的肝氣郁結(jié)證致ED大鼠模型符合中醫(yī)肝氣郁結(jié)證的臨床特點(diǎn)，篩選出的ED大鼠模型也比較穩(wěn)定。我們認(rèn)為采用慢性的不可預(yù)知的復(fù)合情志造模法建立的肝氣郁結(jié)證致ED大鼠模型是可靠的。

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2016-10-08

2016-12-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260526)；新疆自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015211C023)

王麗(1994-)，女，專業(yè):中西醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)。

*通訊作者：張星平(1961-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)藥防治腎病、不孕不育、男科疾病等。

R285.5

A

1002-2392(2017)03-0009-05