任開新， 樊子旭， 游如春， 韓蔚珉， 張 然， 黃 銳， 閆國良， 張 業(yè)

(廈門大學醫(yī)學院， 福建 廈門 361102)

·短篇論著·

DAPT在ox-LDL損傷HUVECs過程中的細胞保護作用*

任開新， 樊子旭， 游如春， 韓蔚珉， 張 然， 黃 銳， 閆國良?， 張 業(yè)?

(廈門大學醫(yī)學院， 福建 廈門 361102)

目的： 探究γ-分泌酶抑制劑N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT)在氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)模型中的細胞保護作用及其對Notch信號通路的調(diào)控。方法: 體外培養(yǎng)HUVECs，用ox-LDL處理HUVECs構(gòu)建細胞損傷模型。實驗分為對照組、ox-LDL處理組、DAPT處理組和DAPT+ox-LDL處理組。用倒置相差顯微鏡觀察不同處理方法下細胞的形態(tài)變化；CCK-8法檢測細胞存活率；Western blot法檢測蛋白Notch1、Notch4和Jagged1的表達情況。結(jié)果: 體外培養(yǎng)HUVECs，倒置相差顯微鏡下發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理組細胞死亡和碎片增多，經(jīng)DAPT預處理后，ox-LDL作用造成的細胞損傷死亡較少，細胞碎片較少。通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理組細胞存活率降低，DAPT處理組細胞存活率升高，DAPT預處理后ox-LDL造成存活率降低的幅度變小。在ox-LDL作用下，Notch1和Jagged1蛋白表達量降低，Notch4表達量升高；而DAPT作用下Notch1和Jagged1表達量升高，Notch4表達量降低；ox-LDL與DAPT共同作用時蛋白接近正常水平。結(jié)論: ox-LDL對HUVECs具有損傷作用； DAPT減輕ox-LDL對HUVECs造成的損傷； DAPT保護HUVECs免受ox-LDL損傷的作用與Notch信號通路有關。

人臍靜脈內(nèi)皮細胞； 氧化低密度脂蛋白； DAPT； Notch信號通路

血管內(nèi)皮細胞是血管壁的主要屏障，當血管內(nèi)皮細胞損傷時，會導致泡沫細胞形成，從而誘發(fā)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，此外，當血管內(nèi)皮細胞的屏障作用缺失時，會引發(fā)血小板聚集、凝血，促進血栓性疾病的發(fā)生[1-2]。目前許多研究發(fā)現(xiàn)氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)可以造成血管內(nèi)皮細胞損傷，是動脈粥樣硬化等許多心血管疾病發(fā)生發(fā)展的一個重要因素[3]。有研究表明ox-LDL可以激活Notch信號通路促進巨噬細胞激活引起炎癥反應[4]，我們由此推測兩者在血管內(nèi)皮細胞中也有一定的關聯(lián)。既往關于Notch信號通路在血管中的研究主要集中于新生血管發(fā)育與成熟的過程，但是缺乏在ox-LDL損傷血管內(nèi)皮細胞過程中是否具有保護作用的相關研究。同時，γ-分泌酶抑制劑N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phe-nylglycine t-butyl ester (DAPT)可以抑制Notch信號通路上的相關位點[5]。因此我們推測ox-LDL損傷血管內(nèi)皮細胞時可能與Notch信號通路有關聯(lián)，并且DAPT對血管內(nèi)皮細胞可能具有一定的保護作用。本研究以體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為研究模型，研究DAPT在ox-LDL損傷HUVECs過程中是否具有細胞保護作用，以及DAPT對Notch信號通路的調(diào)控情況。

材 料 和 方 法

1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(ATCC)由廈門大學醫(yī)學院器官移植研究所李成林博士惠贈。

2 主要試劑

培養(yǎng)基DMEM/F-12購自HyClone；人表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)購自 PeproTech；anti-Notch1抗體、anti-Notch4抗體和anti-Jagged1抗體均購自Abcam；氧化低密度脂蛋白購自廣州奕源生物公司；DAPT購自Sigma；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)購自Dojindo。

3 主要方法

3.1 HUVECs體外培養(yǎng) HUVECs培養(yǎng)在DMEM/F-12培養(yǎng)基中，其中含7%的優(yōu)質(zhì)胎牛血清和EGF 5 μg/L，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。待細胞鋪滿培養(yǎng)皿時傳代，吸去培養(yǎng)液，用PBS輕柔洗2次，胰酶消化2～3 min，待細胞脫落后，加入適量培養(yǎng)基終止胰酶的消化作用，收集細胞于離心管中，離心1 000 r/min、3 min，棄上清，用新的培養(yǎng)基1 mL重懸細胞，按1∶5接種于新培養(yǎng)基中。

3.2 藥物處理和分組 (1)對照組：正常培養(yǎng)24 h；(2)DAPT處理組：待細胞貼壁后給予25 μmol/L DAPT作用24 h；(3)ox-LDL處理組：同一批細胞貼壁后12 h給予100 mg/L ox-LDL作用12 h；(4)DAPT+ox-LDL處理組：待同一批細胞貼壁后先給予25 μmol/L DAPT預處理12 h，再給予100 mg/L ox-LDL作用12 h。

3.3 細胞形態(tài)學觀察 將貼壁長滿的HUVECs用胰蛋白酶進行消化，細胞懸液接種于直徑2 cm的培養(yǎng)皿，細胞密度1×105/L，每皿1 mL，按以上分組給藥。培養(yǎng)箱培養(yǎng)孵育后倒置相差顯微鏡下觀察。

3.4 CCK-8法檢測細胞活力 胰酶消化HUVECs，以每孔8×103個接種于96孔板。按常規(guī)培養(yǎng)方式復蘇細胞活力2 h，待細胞貼壁后給藥，按分組給藥。藥物處理后用PBS洗去含藥培養(yǎng)基，每孔加入新培養(yǎng)基100 μL及CCK-8試劑10 μL，孵育120 min。用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度(A)值，各組的A值取均數(shù)用于計算細胞存活率。計算公式：細胞存活率(%) =(藥物處理組A值-空白組A值)/(無藥物處理組A值-空白組A值)×100%。

3.5 Western blot檢測相關蛋白變化 取HUVECs 1×108/L接種于10 cm培養(yǎng)皿，按分組給藥。培養(yǎng)后用RIPA裂解液，含1×cocktail裂解細胞，并用細胞刮子充分刮下貼壁細胞，收集后搖床上冰水浴搖晃45 min，12 000×g、4 ℃ 離心10 min取上清。取蛋白樣品5 μL，用BCA試劑盒測定樣品濃度。余下部分加入loading buffer 煮沸5 min，-20 ℃凍存，留待上樣。各個蛋白樣品取30 μg上樣，10% SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜 6 min×3次。室溫孵育 I 抗(Notch1 1∶2 000， Notch4 1∶1 000， Jagged1 1∶1 000)1 h，TBST洗膜6 min×3次。加入辣根過氧化物酶標記的兔抗人IgG(Notch1 1∶2 000， Notch4 1∶250， Jagged1 1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜6 min×3次。加入現(xiàn)配制的ECL顯色液，避光2 min，貼膜曝光。以β-actin蛋白作為內(nèi)參照，用ImageJ灰度分析后行統(tǒng)計學處理。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 藥物對細胞形態(tài)學的影響

對照組的臍靜脈內(nèi)皮細胞的細胞胞漿豐富，胞核大，細胞間連接緊密，邊界清楚，呈單層鋪路石狀排列，細胞呈多角形、梭形或卵圓形。ox-LDL處理組細胞分解死亡，細胞碎片增多。DAPT處理組和對照組無明顯區(qū)別，細胞排列緊密整齊。經(jīng)過DAPT預處理12 h后再給ox-LDL作用12 h組，細胞較ox-LDL組死亡較少，碎片較少，見圖1。

Figure 1.The light-microscopic images of HUVECs 24 h after treatment (×200).

圖1 藥物對細胞形態(tài)影響

2 CCK-8法檢測細胞存活率

CCK-8法檢測細胞存活率結(jié)果顯示，與對照組相比，ox-LDL組細胞存活率下降，DAPT處理組細胞存活率升高，差別具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；經(jīng)過DAPT預處理后加入ox-LDL的細胞與ox-LDL處理組相比存活率升高，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，而與對照組相比，其差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

3 Western blot法檢測蛋白變化

Western blot實驗結(jié)果顯示，Jagged1和Notch1在DAPT影響下表達降低，在ox-LDL影響下表達增加，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，而經(jīng)過DAPT預處理后，ox-LDL對Jagged1和Notch1表達的影響變小，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學顯著性；相反地，蛋白Notch4在DAPT影響下表達升高，在ox-LDL影響下表達降低，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，而經(jīng)過DAPT預處理后，ox-LDL對Notch4表達的影響變小，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3。

Figure 2.The viability of the HUVECs treated with DAPT, ox-LDL and in combination. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsDAPT group;#P<0.05vsox-LDL group.

圖2 DAPT干預條件下ox-LDL對HUVECs存活率的影響

Figure 3.The changes of protein expression of Notch1, Notch4 and Jagged1. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsDAPT group;#P<0.05vsox-LDL group.

圖3 藥物對蛋白表達的影響

討 論

內(nèi)皮細胞功能障礙是許多心血管疾病的始動環(huán)節(jié)，如動脈粥樣硬化，血栓形成等，而已有的研究表明ox-LDL是誘導血管內(nèi)皮功能受損的重要因素。因此研究ox-LDL對血管內(nèi)皮細胞損傷的機制以及尋找保護血管內(nèi)皮細胞免受ox-LDL損傷具有重要意義。

我們以不同濃度的ox-LDL處理HUVECs，發(fā)現(xiàn)隨著濃度增加，ox-LDL對細胞的損傷程度逐漸加大，與相關研究結(jié)果一致[6]。對于ox-LDL損傷血管內(nèi)皮細胞的機制，以往研究發(fā)現(xiàn)其通過與細胞上的凝集素樣氧化性低密度脂蛋白受體-1結(jié)合而使血管內(nèi)皮細胞損傷[7-8]。其中，ox-LDL可以通過細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導激活NF-κB，降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性，減少一氧化氮生成，同時增加乳酸脫氫酶和白細胞介素-8的釋放和環(huán)氧化酶-2的表達，引起內(nèi)皮細胞功能障礙[9-10]。但是目前國內(nèi)外缺乏關于ox-LDL對血管內(nèi)皮細胞損傷過程中Notch信號通路影響的研究。

Notch信號通路廣泛存在幾乎所有細胞，調(diào)控著不同細胞的增殖、分化和凋亡，對不同的器官組織發(fā)揮不同效應[11-12]。Notch 信號通路在相鄰細胞之間通過配體與受體相互結(jié)合而影響細胞的增殖、分化和凋亡，人源細胞中配體包括Delta樣配體(Dll1、3、4)與Jagged(Jagged1、2)，受體包括Notch1～4[13]。近來研究表明，Notch信號通路和動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展也有密切關系[14]。同時也有研究表明在ox-LDL刺激巨噬細胞過程中，Notch信號通路受體Notch1升高，可以增加NF-κB的活性，從而損傷巨噬細胞[15]。因此我們推斷在血管內(nèi)皮細胞損傷過程中，ox-LDL與Notch信號通路存在相關聯(lián)系，而Notch信號通路抑制劑DAPT可以保護HUVECs免受ox-LDL損傷。

我們通過實驗，發(fā)現(xiàn)DAPT可以減少ox-LDL造成血管內(nèi)皮細胞損傷形成的細胞碎片，通過CCK-8法檢測細胞存活率發(fā)現(xiàn)DAPT能提高ox-LDL作用下HUVECs的存活率，由此驗證了我們之前的推斷，即在ox-LDL損傷HUVECs的模型中，DAPT可以起到保護細胞，減少細胞損傷的作用。

DAPT通過抑制γ-分泌酶使Notch受體胞內(nèi)段(Notch intracellular domain，NICD)水解和釋放，導致游離NICD減少，NICD對下游通路的激活減少，從而發(fā)揮效應[16]。在我們研究中，通過對蛋白Notch1、Notch4和Jagged1的檢測發(fā)現(xiàn)，在ox-LDL與DAPT各自影響下，蛋白表達量增減完全相反，因此說明ox-LDL與DAPT在血管內(nèi)皮細胞的Notch信號通路上影響是完全相反的。據(jù)Pedrosa 等[17]研究表明，Jagged1對于平衡體內(nèi)血管內(nèi)皮的生長和成熟具有重要作用，在傷口愈合過程中，Dll4/Notch1信號途徑會抑制血管內(nèi)皮的覆蓋和血管生長，但這個過程又會激活Jagged1，Jagged1卻可以通過Jagged1/Notch4信號途徑抵消這種作用，促進內(nèi)皮細胞成熟后血管生長，從而促進傷口愈合。結(jié)合我們實驗結(jié)果，我們認為ox-LDL可能通過Dll4/Notch1信號途徑使HUVECs損傷，同時會抑制具有平衡作用的Jagged1/Notch4信號途徑，進一步加重細胞損傷，由于受體Notch4表達被抑制，使得相應配體Jagged1反饋性升高。同理，DAPT可以抑制Dll4/Notch1信號途徑，減少細胞損傷，通過激活Jagged1/Notch4信號途徑而使HUVECs增殖成熟，使損傷血管壁再內(nèi)皮化。因此DAPT可以拮抗ox-LDL對血管內(nèi)皮細胞的損傷，同時保護血管內(nèi)皮細胞再生和成熟，對保護血管壁的完整性有重要意義。

對于Notch信號通路，仍存在許多機制尚未明確，可能在ox-LDL影響下，Notch信號通路的其它蛋白亦會發(fā)生不同改變。由于還存在不依賴經(jīng)γ-分泌酶水解過程的非經(jīng)典Notch信號通路，DAPT不能完全阻斷Notch信號通路下游靶基因的表達，其它的配體受體通路發(fā)揮的作用有待進一步研究[18]。

總之，通過我們的研究可以得出以下結(jié)論： ox-LDL可以通過激活Notch信號通路使血管內(nèi)皮細胞損傷，DAPT對血管內(nèi)皮細胞具有保護作用，DAPT通過調(diào)控Notch信號通路拮抗ox-LDL對HUVECs造成的損傷。

(致謝：感謝廈門大學醫(yī)學院大學生創(chuàng)新實驗室；感謝廈門大學醫(yī)學院機能學實驗平臺；感謝廈門大學醫(yī)學院器官移植研究所李成林博士；感謝廈門大學公共衛(wèi)生學院黃楨翔老師。)

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

DAPT attenuates ox-LDL-induced human umbilical vein endothelial cell injury

REN Kai-xin, FAN Zi-xu, YOU Ru-chun, HAN Wei-min, ZHANG Ran, HUANG Rui, YAN Guo-liang, ZHANG Ye

(MedicalCollegeofXiamenUniversity,Xiamen361102,China.E-mail:zhangye@xmu.edu.cn； 79720905@qq.com)

AIM: To investigate the effect ofN-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) on the Notch signaling pathway in a model of oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)-induced human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) damage. METHODS: HUVECs were divided into control group, ox-LDL group, DAPT group and ox-LDL+DAPT group. The morphological changes of the HUVECs with different treatments were observed under light microscope. The viability of the HUVECs was measured by CCK-8 assay. The protein expression levels of Notch1, Notch4 and Jagged1 were determined by Western blot. RESULTS: ox-LDL induced great damage to the HUVECs, evidenced by increased cell death and debris in the culture. However, the cell damage was abolished by adding DAPT into the culture. The viability of the HUVECs was increased by co-treatment with DAPT and ox-LDL. ox-LDL treatment significantly decreased the protein expression levels of Notch1 and Jagged1, and elevated Notch4. However, these changes were totally reversed by DAPT. None of these proteins showed significant change in the HUVECs co-treated with DAPT and ox-LDL as compared with control group.CONCLUSION: ox-LDL is able to induce HUVEC damageinvitro. DAPT attenuates ox-LDL-induced damage in the HUVECs by regulating the Notch signaling pathway.

HUVECs; Oxidized low-density lipoprotein; DAPT; Notch signaling pathway

1000- 4718(2017)06- 1125- 05

2016- 10- 17

2017- 03- 30

廈門大學校長基金本科生項目(No.CXB2014010)

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.027

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 張 業(yè) Tel: 0592-2188670； E-mail: zhangye@xmu.edu.cn； 閆國良 Tel: 0592-2187157； E-mail: 79720905@qq.com