高雪松， 王曉玉

(暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510632)

Taxol對(duì)宮頸癌U14細(xì)胞增殖、凋亡及α2,6-SA和ST6Gal mRNA表達(dá)的影響*

高雪松， 王曉玉△

(暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510632)

目的： 研究泰素(Taxol)對(duì)小鼠宮頸癌U14細(xì)胞株增殖、凋亡以及α2,6-唾液酸(SA)和α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6Gal)mRNA表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討宮頸癌Taxol化療機(jī)制提供新思路。方法: Taxol處理U14細(xì)胞后，MTT檢測(cè)Taxol對(duì)U14細(xì)胞的IC50值。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞α2,6-SA、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子(Bcl-2、Bax、caspase 8和caspase 3)、凋亡率和細(xì)胞周期改變。 qPCR檢測(cè)ST6Gal1 和ST6Gal2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果: 與對(duì)照組相比，Taxol對(duì)U14細(xì)胞有明顯的抑制作用，減弱α 2，6-SA熒光強(qiáng)度，上調(diào)Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值，并增強(qiáng)caspase 8和caspase 3活性；Taxol處理顯著增加U14細(xì)胞凋亡率及S期細(xì)胞和G2/M期細(xì)胞比率，此外還下調(diào)ST6Gal1 mRNA表達(dá)。結(jié)論: α2,6-SA和ST6Gal可能參與了Taxol對(duì)U14細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡調(diào)控的多重作用。

泰素; 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞周期； α2,6-唾液酸； α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶

近年來，泰素(Taxol；紫杉醇注射液)已成為晚期宮頸癌化療常用的治療藥物。研究表明，細(xì)胞表面唾液酸化水平的改變與細(xì)胞的癌變、腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后顯著相關(guān)。因而，在癌癥進(jìn)展中檢測(cè)唾液酸有助于癌癥診斷，評(píng)估療效和預(yù)后。根據(jù)與糖殘基的連接方式,唾液酸(sialic acid，SA)可分為α2，3-、α2，6-和α2，8- 三大類，細(xì)胞表面唾液酸化是由唾液酸轉(zhuǎn)移酶(sialyltransferase，ST)催化，α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(α2,6-sialyltransferase，ST6Gal)成員包括ST6Gal1和ST6Gal2。α2, 6-唾液酸化與 ST6Gal的活性密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，α2,6-唾液酸(α2,6-SA)和ST6Gal1在宮頸癌中呈高表達(dá)[1]，但它們?cè)赥axol治療宮頸癌中的改變及其作用，報(bào)道甚少。子宮頸癌是全球女性僅次于乳腺癌的第二大常見癌癥，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察Taxol對(duì)小鼠宮頸癌U14細(xì)胞增殖、凋亡及α2,6-SA和ST6Gal表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討宮頸癌Taxol化療機(jī)制提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠宮頸癌 U14 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所；Taxol(紫杉醇注射液)購(gòu)自Bristol-Myers Squibb；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；FACSAria流式細(xì)胞儀和Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒(BD)；α2,6-SA FITC-SNA試劑盒(Vector)；Bcl-2、Bax和caspase-8試劑盒(SCBT)；caspase-3試劑盒(CST)；Cell Cycle Assay Kit 購(gòu)自Abcam；qPCR所用試劑和所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成提供；CFX實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀 (Roche)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U14細(xì)胞用含 10% 胎牛血清 的 DMEM 高糖培養(yǎng)液在 37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行。

2.2 MTT檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U14細(xì)胞，分未加藥物常規(guī)培養(yǎng)的U14細(xì)胞為對(duì)照(control)組和Taxol處理組，其中Taxol組分為7個(gè)不同濃度的亞組。首先將4×107/L單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。Taxol組再分別加入依次以4倍比稀釋的Taxol，終濃度分別為60 mg/L、15 mg/L、3.75 mg/L、0.938 mg/L、0.234 mg/L、0.059 mg/L和0.015 mg/L。加藥后，將細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，然后，行常規(guī)MTT檢測(cè)，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度，計(jì)算不同Taxol濃度孵育的細(xì)胞存活率，繪制藥物濃度-細(xì)胞存活曲線并做線性回歸，通過IC50軟件計(jì)算出相應(yīng)的IC50值。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U14 細(xì)胞α2,6-SA、Bcl-2、Bax、caspase 8和caspase 3的表達(dá)及細(xì)胞凋亡和周期 選MTT檢測(cè)中Taxol達(dá)到較好殺傷效果的IC50值處理的U14細(xì)胞為Taxol組，常規(guī)培養(yǎng)的U14細(xì)胞為對(duì)照組。嚴(yán)格按照檢測(cè)項(xiàng)目各自試劑盒說明書操作，Cell Quest 軟件分析樣品，重復(fù)進(jìn)行3次。

2.4 qPCR檢測(cè)ST6Gal mRNA表達(dá) qPCR所用引物如下: ST6Gal1(檢測(cè)3個(gè)剪接體的同源序列)上游引物5’-CCACTCAGCCCCTGGTGT-3’，下游引物5’-CAGCTCGAAACACCGAAGC-3’；ST6Gal2上游引物5’-TGGCTGTCCAGCAGCACTTT-3’，下游引物5’-AGCAATCCTGCGGCACCTAT-3’;GAPDH的上游引物5’-TGGGTGTGAACCACGAGAAATAT-3’，下游引物5’-CAGAGGGGCCATCCACAGTC-3’。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，應(yīng)用qPCR儀進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件: 95 ℃ 2 min； 95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s, 70 ℃ 30 s， 40個(gè)循環(huán)； 熔解溫度70～95 ℃。收集熒光信號(hào)，繪制擴(kuò)增曲線，計(jì)算mRNA的2-ΔΔCt相對(duì)表達(dá)量。將Taxol組分為3個(gè)亞組(10 mg/L組、20 mg/L組和30 mg/L組)，常規(guī)培養(yǎng)的U14細(xì)胞為對(duì)照組，GAPDH作為內(nèi)參照，行qPCR檢測(cè)，依據(jù)CFX Manager軟件進(jìn)行基因表達(dá)分析，獲取ST6Gal1 mRNA和 ST6Gal2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

隨著Taxol濃度梯度的遞增和時(shí)間的延長(zhǎng)，U14細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)。24 h，IC50=168.8 mg/L；48 h，IC50=22.15 mg/L；72 h，IC50=8.04 mg/L，隨著Taxol作用時(shí)間的延長(zhǎng),IC50值逐漸降低。3個(gè)時(shí)間段相比，48 h的存活率曲線與線性回歸直線方程擬合的趨勢(shì)效果較佳，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制呈明顯的時(shí)效和量效關(guān)系，見圖1。因此，選擇IC50值 22.15 mg/L或相近濃度10 mg/L、20 mg/L和30 mg/L作用于U14細(xì)胞48 h，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的作用濃度和作用時(shí)間。

Figure 1.The dose-effect curve and linear regression of mouse cervical cancer cell line U14 treated with various concentrations (0.015 mg/L～60 mg/L) of Taxol for 48 h.

圖1 Taxol孵育U14細(xì)胞48 h量效曲線與線性回歸

2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

依據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Taxol組采用濃度為22.15 mg/L，孵育U14細(xì)胞48 h后顯示：與對(duì)照組相比，Taxol對(duì)U14細(xì)胞有明顯的抑制作用，α2，6-SA熒光強(qiáng)度減弱, Bax表達(dá)上調(diào), Bcl-2表達(dá)下調(diào), Bcl-2/Bax比值降低caspase 8和caspase 3活性增強(qiáng)；Taxol處理后U14細(xì)胞凋亡率(早期和晚期凋亡)增加；Taxol組U14細(xì)胞可見G0/G1期前出現(xiàn)顯著的Sub-G1期凋亡峰，G0/G1期細(xì)胞百分率減少，而S期和G2/M期細(xì)胞比率顯著增多，見圖2、表1。

Figure 2.Changes of α2,6-SA, Bcl-2 and Bax expression, caspase 8 and caspase 3 activity, apoptosis rate and cell cycle in U14 cells treated with 22.15 mg/L Taxol for 48 h were detected by flow cytometry.

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組與Taxol組U14細(xì)胞的α2,6-SA、Bcl-2、 Bax、 caspase 8、caspase 3、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的改變

3 ST6Gal1 和ST6Gal2 mRNA 的表達(dá)

U14細(xì)胞經(jīng) Taxol 10 mg/L、20 mg/L和30 mg/L濃度分別處理48 h后，ST6Gal1 mRNA相對(duì)表達(dá)量隨著Taxol藥物濃度的遞增而遞減，呈顯著的劑量依賴性。而ST6Gal2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均輕度上調(diào)，且有波動(dòng)，以20 mg/L組上調(diào)較明顯，但與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

討 論

紫杉醇是一種高效、作用強(qiáng)、廣譜的細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥物，能協(xié)同多種抗癌藥物，并增敏放療。Bava等[2]指出，MTT測(cè)定法評(píng)價(jià)紫杉醇藥物敏感性是非常方便的方法，100 nmol/L Taxol對(duì)人源性宮頸癌HeLa、SiHa、CaSki和ME-180細(xì)胞系具有高度的細(xì)胞毒性，而5 nmol/L和10 nmol/L Taxol誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性分別為17%和50%。本研究中Taxol作用24 h對(duì)U14細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用欠佳，作用48 h和72 h則有一定的細(xì)胞毒性，呈現(xiàn)時(shí)間和一定劑量的依賴性，隨藥物濃度的遞增和時(shí)間的延長(zhǎng)毒性作用增加, U14細(xì)胞的增殖存活逐漸受到抑制。

表1 流式細(xì)胞術(shù)分析Taxol處理48 h對(duì)U14細(xì)胞α2,6-SA、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子和細(xì)胞周期的影響

Table 1.Effects of 22.15 mg/L Taxol treatment for 48 h on α2,6-SA, apoptosis-related factors and cell cycle in U14 cells were detected by flow cytometry (%. Mean±SEM.n=6)

ItemTaxolgroupControlgroupα2,6-SA11.25±0.65**43.70±1.28Bcl-212.71±1.82**56.24±3.79Bax29.67±5.07*9.77±1.39Caspase856.50±3.85**33.88±3.23Caspase315.73±2.37*4.72±0.83Apoptosisrate25.18±2.46*0.92±0.31Cellcycle Apoptosis(Sub-G1)12.56±0.45**6.46±0.31 G0/G1phase28.59±0.87**70.57±0.32 Sphase43.07±1.08**23.82±1.01 G2/Mphase28.34±1.64**5.41±1.50

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

細(xì)胞周期調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程, 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期密切相關(guān)，越來越多的研究顯示，腫瘤是一類細(xì)胞周期性紊亂性疾病[3]。細(xì)胞凋亡與腫瘤有著密切關(guān)系。腫瘤不僅是細(xì)胞增生過度，而且細(xì)胞死亡率過低，是增生與死亡失調(diào)所致，所以腫瘤不但是細(xì)胞增生異常的疾病，亦是死亡異常的疾病[4]，1979年，Schiff等[5]首次研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇抑制成倍增長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞的分裂，孵育20 h，HeLa細(xì)胞被阻止在G2/M期，阻滯細(xì)胞有絲分裂的完成。由此提出，紫杉醇抗腫瘤獨(dú)特機(jī)制是作用于細(xì)胞骨架蛋白微管系統(tǒng)，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Dang等[6]發(fā)現(xiàn)，紫杉醇孵育可增強(qiáng)HeLa細(xì)胞(HPV18陽(yáng)性)和CaSki細(xì)胞(HPV16陽(yáng)性)的凋亡(早期和晚期凋亡)，抑制癌細(xì)胞增殖。表明，紫杉醇是人類宮頸癌的廣譜有效藥物。Sreekanth等[7]利用3-甲基膽蒽(3-MC)制作小鼠宮頸多級(jí)鱗狀細(xì)胞癌模型，然后將腫瘤分離出的原代細(xì)胞，進(jìn)行紫杉醇藥物處理，在10 nmol/L和25 nmol/L濃度下作用24 h，可見顯著的代表凋亡細(xì)胞群體的亞G1峰，G0/G1期細(xì)胞百分率減少，S期隨紫杉醇濃度的增加，呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，G2/M期百分率則明顯增多，提示紫杉醇誘導(dǎo)G2/M期阻滯。Bao等[8]觀察到HeLa細(xì)胞內(nèi)及其表面顯示出較高的ST6Gal活性，且在G1期比S期有較大的ST6Gal活性，表明，在藥物治療中，對(duì)G1期HeLa細(xì)胞的ST6Gal活性的監(jiān)控，可為ST6Gal相關(guān)抗癌藥物的開發(fā)和篩選提供一種有效的平臺(tái)。Baskaran等[9]發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者促凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bax表達(dá)減少， Bax蛋白與Bcl-2蛋白比例降低，caspase 3的活性顯著減弱，表明它們可能在宮頸癌細(xì)胞的異常增殖中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Taxol作用后，U14細(xì)胞表面α2，6-SA熒光強(qiáng)度降低，Bcl-2表達(dá)減少，Bax表達(dá)增加，Bcl-2/Bax比值降低；caspase 8和caspase 3上調(diào)；細(xì)胞凋亡率增加；細(xì)胞周期檢測(cè)：G0/G1期前出現(xiàn)顯著的Sub-G1期凋亡峰，G0/G1期細(xì)胞顯著減少；而S期細(xì)胞和G2/M期細(xì)胞明顯增多，使較多U14細(xì)胞阻滯于 S期和G2/M期，提示Taxol可通過凋亡的細(xì)胞內(nèi)線粒體途徑和細(xì)胞外死亡受體途徑引起caspase的級(jí)聯(lián)活化來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Taxol下調(diào)α2，6-SA，伴隨細(xì)胞凋亡增加,表明Taxol可通過對(duì)U14細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡調(diào)控的多重效應(yīng)，殺傷癌細(xì)胞，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。

Figure 3.The relative expression of ST6Gal1 mRNA and ST6Gal2 mRNA in U14 cells treated with different concentrations of Taxol for 48 h. Mean±SEM.n=9.*P<0.05vs0 mg/L.

圖3 qPCR 檢測(cè)ST6Gal1 mRNA和ST6Gal2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

癌細(xì)胞ST6Gal1的上調(diào)，催化癌細(xì)胞表面α2,6-唾液酸化，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡作用。本課題組發(fā)現(xiàn)，下調(diào)HeLa 細(xì)胞ST6Gal1的表達(dá)水平，可以降低宮頸癌 HeLa 細(xì)胞 α2,6-SA的表達(dá)，增強(qiáng)順鉑對(duì) HeLa細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)[10]。增加ST6Gal1表達(dá)可介導(dǎo)整合素β1的α2,6-唾液酸化，保護(hù)結(jié)腸癌SW48細(xì)胞，阻斷細(xì)胞外分泌型Gal-3與整合素β1結(jié)合產(chǎn)生的促凋亡效應(yīng)[11]。ST6Gal1可促進(jìn)死亡受體Fas的α2，6-唾液酸化修飾，下調(diào)caspases 8和caspases 3的活化，抑制Fas誘導(dǎo)凋亡的能力，致腫瘤逃避凋亡[12]。強(qiáng)制下調(diào)ST6Gal1，可顯著增加TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13]。以上可見， ST6Gal1是多種細(xì)胞存活途徑的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可作為一種潛在的抗細(xì)胞凋亡識(shí)別信號(hào)。

Mannherz等[14]通過TUNEL測(cè)定和流式細(xì)胞儀分析，首次確認(rèn)ST6Gal2具誘導(dǎo)人HEK293T細(xì)胞凋亡功能。楊佳曄等[15]觀察到，轉(zhuǎn)染ST6Gal2的HeLa細(xì)胞，呈現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞。轉(zhuǎn)染ST6Gal2的HEK293T細(xì)胞，切割的caspase 3、caspase 7和PARP含量增加。轉(zhuǎn)染ST6Gal2的HEK293T細(xì)胞和內(nèi)源性ST6Gal2蛋白水平顯著增加的小鼠大腦原代神經(jīng)元中，分別檢測(cè)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白BiP、Bim和CHOP含量增加，caspase 3增加，以上表明，ST6Gal2可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通道，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。證明，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是ST6Gal2特有的性質(zhì)。而轉(zhuǎn)染ST6Gal1的HEK293T細(xì)胞，BiP、Bim和CHOP的蛋白含量沒有增加，提示同屬一個(gè)家族的ST6Gal1不參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究Taxol處理U14細(xì)胞，ST6Gal2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均輕度上調(diào)，由于標(biāo)準(zhǔn)誤較大，未呈現(xiàn)顯著性差異，有待進(jìn)一步研究。

本研究初步探討了Taxol抗宮頸癌U14細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和誘導(dǎo)凋亡作用的分子機(jī)制。首次報(bào)道了Taxol處理U14細(xì)胞，下調(diào)α2,6-SA和ST6Gal1表達(dá)。這些結(jié)果提示，α2,6-SA和ST6Gal可能參與Taxol對(duì)U14細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡調(diào)控的多重作用，為Taxol治療宮頸癌的機(jī)制補(bǔ)充了新的資料。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲, 羅 森)

Effects of Taxol on proliferation, apoptosis, and mRNA expression of α2,6-sialic acid and ST6Gal in cervical carcinoma cell line U14

GAO Xue-song, WANG Xiao-yu

(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:twxy@jnu.edu.cn)

AIM: To study the effect of Taxol on the proliferation, apoptosis, and mRNA expressions of α2,6-sialic acid (SA) and α2，6-sialyltransferase (ST6Gal) in mouse cervical cancer cell line U14. METHODS: After the U14 cells were treated with Taxol, the IC50value of Taxol to U14 cells was detected by MTT assay. The expression of α2,6-SA and apoptosis-related factors (Bcl-2, Bax, caspase 8 and caspase 3), the apoptosis rate and cell cycle were determined by flow cytometry. The mRNA expression of ST6Gal1 and ST6Gal2 was detected by qPCR.RESULTS: As compared with control group, Taxol induced obvious U14 cell growth inhibition, reduced α2,6-SA expression, up-regulated Bax, down-regulated Bcl-2, decreased the ratio of Bcl-2/Bax, enhanced caspase 8 and caspase 3 activity, increased the apoptotic rate and cell proportions of Sub-G1and S phases, and induced G2/M phase arrest. Taxol also down-regulated the mRNA expression of ST6Gal1, and slightly up-regulated the mRNA expression of ST6Gal2. CONCLUSION: α2,6-SA and ST6Gal are involved in the multiple effects of Taxol on modulation of the cell cycle and apoptosis in U14 cells.

Taxol; Apoptosis; Cell cycle; α2,6-sialic acid; α2，6-sialyltransferase

1000- 4718(2017)06- 1038- 05

2016- 01- 21

2017- 03- 21

廣東省藥學(xué)會(huì)婦科腫瘤用藥研究基金資助項(xiàng)目(No. 2012D15)； 暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院科研培育專項(xiàng)基金[2012]7號(hào)青年項(xiàng)目(No. 9)

R730.23； R711.74

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.013

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