劉 枋， 林萬松， 陳淑萍， 葉韻斌△

(1福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤免疫學研究室， 2福建省腫瘤轉化醫(yī)學重點實驗室，福建 福州 350014)

CARMA3基因敲減對結腸癌細胞HCT116生長和侵襲轉移的抑制*

劉 枋1, 2， 林萬松1, 2， 陳淑萍1, 2， 葉韻斌1, 2△

(1福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤免疫學研究室，2福建省腫瘤轉化醫(yī)學重點實驗室，福建 福州 350014)

目的： 探討CARMA3基因在人結腸癌細胞HCT116生長和侵襲轉移中的作用及其機制。方法: 選取高表達CARMA3的人結腸癌細胞株。應用慢病毒技術敲減CARMA3基因，puromycin篩選后構建穩(wěn)定轉染的HCT116-shCARMA3細胞株。Real-time PCR和Western blot鑒定 mRNA和蛋白表達的抑制情況。WST-1法和RTCA S16系統(tǒng)分析細胞增殖情況。集落形成實驗觀察集落形成。流式細胞術檢測細胞周期。顯微鏡下觀察上皮-間充質轉化(EMT)形態(tài)變化。劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲能力的改變。Western blot分析相關分子變化，探討可能機制。結果: 4株人結腸癌細胞株中HCT116細胞的CARMA3 mRNA和蛋白表達量最高，構建穩(wěn)定沉默CARMA3的HCT116-shCARMA3細胞株，其中HCT116-shCARMA3-93細胞中CARMA3 的mRNA和蛋白受抑制最明顯，將其作為細胞模型。相比于對照組，HCT116-shCARMA3-93細胞形態(tài)發(fā)生EMT逆轉，其增殖、集落形成、遷移和侵襲能力明顯下降(P<0.01)。HCT116-shCARMA3-93的G0/G1細胞所占比例明顯升高，S期細胞比例相應下降(P<0.05)。信號通路分子Bcl10和NF-κB表達明顯下調，MALT-1變化不明顯；細胞周期相關蛋白cyclin D1顯著下調，cyclin A表達略有下降；侵襲轉移相關分子MMP-2和MMP-9的表達下調，MMP-7未見改變，TIMP-1和TIMP-2的表達上調；EMT相關分子E-cadherin的表達水平升高，N-cadherin、Snail、Slug和Twist的表達水平呈不同程度降低。結論: CARMA3可通過改變細胞周期和侵襲轉移分子的表達、調控EMT來影響結腸癌細胞HCT116的生長和侵襲轉移。這可能與NF-κB信號通路發(fā)生改變有關。

CARMA3； 結腸癌； 慢病毒； 細胞生長； 細胞遷移； 細胞侵襲

結腸癌是我國最常見的消化道腫瘤之一。2015年中國結直腸癌新增病例37.63萬，死亡19.1萬，發(fā)病率和致死率均位居第5位，呈逐年上升趨勢[1]。結腸癌發(fā)病機制復雜，篩選參與結腸癌發(fā)生發(fā)展的關鍵性靶點，選擇性阻斷腫瘤相關信號通路是結腸癌治療的研究方向。Caspase 募集結構域膜相關鳥苷酸激酶蛋白3(caspase recruitment domain membrane-associated guanylate kinase protein 3，CARMA3)，又稱CARD10或Bimp1，屬于膜相關鳥苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinase，MAGUK)家族成員，高表達于結腸癌等多種實體瘤。CARMA3異常表達可激活腫瘤相關信號通路，發(fā)揮促癌作用。多篇文獻證實CARMA3通過CARMA3-Bcl10-MALT-1復合物(CBM復合物)誘導經典的核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路。NF-κB與細胞增殖分化、腫瘤侵襲轉移、上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和腫瘤血管新生密切相關[2-3]。關于CARMA3在結腸癌生長和侵襲轉移方面的研究，目前罕見報道，機制尚不清楚。本研究以高表達CARMA3的人結腸癌細胞株HCT116為實驗對象，通過慢病毒技術敲減CARMA3，分析CARMA3調控細胞生長、遷移、侵襲和EMT的可能機制，旨在從基礎理論角度探究以CARMA3為靶點治療結腸癌所具有的臨床應用價值。

材 料 和 方 法

1 細胞

人結腸癌細胞株HCT116、HT29、SW480、SW620和人胚腎細胞株293T購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

2 主要試劑

質粒(sheGFP和shCARMA3)、DMEM培養(yǎng)基和McCoy’s 5A培養(yǎng)基購自Gibco；質粒和慢病毒表達系統(tǒng)購自上海吉凱基因化學技術有限公司； NucleoBond Xtra Midi Kit購自MN；大腸桿菌DH5α、脂質體Lipofectamine 2000和引物購自Invitrogen；LightCycler 480 SYBR Green I Master熒光定量試劑盒購自Roche；Nuclear Extract Kit購自Millipore；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司；兔抗人CARMA3購自Sigma；鼠抗人NF-κB p65和兔抗人B細胞白血病淋巴瘤蛋白10(B-cell leukemia-lymphoma 10，Bcl10)、黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤易位蛋白1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1，MALT-1)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、鋅指轉錄因子Snail、Slug抗體購自Cell Signaling；兔抗人細胞周期蛋白D1 (cyclin D1)、細胞周期蛋白A (cyclin A)、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、基質金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7，MMP-7)、金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)、金屬蛋白酶組織抑制物2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)、β-actin以及抗兔IgG II 抗、抗鼠IgG II抗購自Santa Cruz；兔抗人EMT因子Twist抗體購自Abcam；化學發(fā)光試劑盒購自Thermo； BD CycletesTMPlus DNA Reagent Kit購自BD； WST-1試劑購自Roche；劃痕小室購自Ibidi； TranswellTM小室購自Millipore； Matrigel? Invasion Chambers購自Coring。

3 主要方法

3.1 慢病毒感染 按試劑盒說明書進行質粒大量抽提。質粒(sheGFP和shCARMA3)序列詳見表1。用脂質體轉染法將質粒和慢病毒表達系統(tǒng)共轉染到293T細胞中，收集24 h和48 h病毒液。4 ℃、5 000 r/min離心5 min去除病毒液中的碎片,收集上清液。21 600 r/min繼續(xù)離心1.5 h，1 mL無血清培養(yǎng)液重懸沉淀，0.22 μmol/L過濾除菌獲得病毒濃縮液，-80 ℃保存。慢病毒感染前1 d，每孔接種5×105個細胞(2 mL)至6孔板,次日棄舊培養(yǎng)液，同時加入相應病毒液1 mL、McCoy’s 5A培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清)1.5 mL和15 μg polybrene，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，更換新鮮培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入1.5 mg/L puromycin篩選細胞。每3～4 d更換1次培養(yǎng)液。1～2周后，陽性集落逐漸形成，擴大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定傳代的細胞株。

表1 對照組sheGFP和實驗組shCARMA3的序列

Table 1.The sequences of sheGFP in negative control group and shCARMA3 in experimental group

shRNAnameshRNAsequencesheGFPTTCTCCGAACGTGTCACGTshCARMA3-91TCCTAGAAGTTCAGGAGAAshCARMA3-92CCTTCTACATTCGTGCCAAshCARMA3-93CTGCTCCATGATCCTCGATshCARMA3-94CAGGGAGTGTGACACTTAA

3.2 Real-time PCR檢測mRNA的表達 用Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA后,按照LightCycler 480 SYBR GreenⅠ Master 試劑盒說明書進行測定。CARMA3的上游引物為5’-CCCCTAAGAGATCCTTCAGCAG-3’，下游引物為5’-CCACACGCTGTCAGAGGATG-3’，產物長度為104 bp；β-actin的上游引物為5’-TGGCACCACACCTTCTACA-3’，下游引物為5’-AGCACAGCCTGGATAGCA-3’， 產物長度為164 bp。擴增條件為 95 ℃ 15 min； 95 ℃ 15 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 s， 共40個循環(huán)。

3.3 Western blot檢測蛋白表達 收集細胞蛋白并定量。上樣蛋白為25 μg或40 μg，SDS- PAGE電泳分離后轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入1∶200～1∶1 000稀釋的 I 抗，4 ℃孵育過夜。次日TBST洗膜5 min×3次。HRP標記的抗兔或鼠IgG II 抗(1∶2 000稀釋)繼續(xù)室溫孵育2 h。TBST洗膜5 min×3次。按1∶1配置化學發(fā)光顯影劑，避光孵育3～5 min后，經Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像。應用ImageJ軟件進行灰度分析。

3.4 WST-1法和RTCA S16系統(tǒng)檢測細胞增殖情況 調整細胞密度至5×107/L，接種于96孔板，每孔100 μL，每組3個復孔。37 ℃、5% CO2分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h，加入10 μL WST-1孵育2 h后檢測吸光度A值。繪制細胞活力曲線。調整細胞密度至1×108/L接種于96孔板，每孔100 μL，每組3個復孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)72 h，應用 RTCA S16 系統(tǒng)實時動態(tài)檢測細胞增殖情況。

3.5 集落形成實驗檢測細胞集落形成能力 每孔接種500個細胞(2 mL)于6孔板，每隔3～4 d補充新鮮培養(yǎng)液。12～14 d后棄舊培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，甲醇固定30 min。 自然晾干后，每孔取600 μL結晶紫(1 g/L)染色20 min，PBS再洗滌2次，計算集落數(shù)。

3.6 流式細胞術檢測細胞周期 按試劑盒說明書進行。

3.7 劃痕實驗檢測細胞的創(chuàng)傷愈合能力 調整細胞密度至7×109/L，接種到劃痕小室中，每孔100 μL，設置3個復孔。待24 h細胞貼壁后，吸棄舊培養(yǎng)液，拔掉小室并加入2 mL新鮮培養(yǎng)液。37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察0 h、24 h、48 h創(chuàng)傷愈合情況。

3.8 體外遷移實驗檢測細胞遷移能力 吸取10 μL纖連蛋白(1 g/L)均勻涂抹在TranswellTM下室的膜上，37 ℃培養(yǎng)4 h。用無血清培養(yǎng)液調整細胞密度至7×108/L，取100 μL細胞懸液加至上室，下室加入600 μL 含20% FBS的McCoy’s 5A培養(yǎng)液，各設3個復孔。37 ℃、5% CO2孵育48 h后，用棉簽輕輕擦去上室膜上未遷移的細胞，PBS洗2次，甲醇固定30 min。自然晾干后，用1 g/L結晶紫染液染色20 min。棄染液，雙蒸水洗2次。200倍顯微鏡下，計數(shù)上、下、左、右、中5個不同視野的總細胞數(shù)取平均值。

3.9 體外侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 采用Corning? BioCoatTMMatrigel invasion chambers，步驟同體外遷移實驗。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用 Bonferroni 校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 構建CARMA3基因穩(wěn)定沉默的HCT116細胞株

首先，檢測人結腸癌細胞株HCT116、HT29、SW480和SW620中CARMA3的表達，并選擇一株高表達CARMA3的細胞株。由圖1可知，HCT116和HT29中CARMA3的mRNA和蛋白表達水平較高。本研究以HCT116為主要實驗對象。應用脂質體轉染法包裝慢病毒，將收集到的慢病毒感染細胞，puromycin篩選后構建穩(wěn)定沉默CARMA3的HCT116-shCARMA3細胞(HCT116-shCARMA3-91、HCT116-shCARMA3-92、HCT116-shCARMA3-93和HCT116-shCARMA3-94)，以HCT116細胞為空白對照，HCT116-sheGFP細胞為陰性對照。慢病毒感染48 h，除HCT116-shCARMA3-92細胞外，其它組細胞綠色熒光表達效率均達90%以上(圖2)，其中HCT116-shCARMA3-93細胞CARMA3的mRNA和蛋白水平受抑制最明顯(圖3)。因此后續(xù)實驗選用HCT116-shCARMA3-93作為細胞模型進行功能研究。

Figure 1.The expression of CARMA3 at mRNA(A) and protein (B) levels in different colonic carcinoma cell lines. Mean±SD.n=3.

圖1 不同結腸癌細胞株CARMA3 mRNA和蛋白的表達情況

Figure 2.The expression of green fluorescence in transfected cell lines after 48 h infection (×100). A: HCT116-sheGFP; B: HCT116-shCARMA3-91; C: HCT116-shCARMA3-92; D: HCT116-shCARMA3-93; E: HCT116-shCARMA3-94.

圖2 轉染細胞綠色熒光的表達情況

Figure 3.The expression of CARMA3 at mRNA(A) and protein (B) levels in different transfected cell lines. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHCT116-sheGFP.

圖3 不同轉染細胞CARMA3 mRNA和蛋白的表達情況

2 敲減CARMA3基因抑制HCT116細胞生長

本研究通過WST-1實驗、RTCA實驗和集落形成實驗分析CARMA3在結腸癌細胞生長中的作用。相比于空白對照HCT116細胞和陰性對照HCT116-sheGFP細胞, WST-1法檢測發(fā)現(xiàn)HCT116-shCARMA3-93細胞活力顯著下降，72 h抑制率為41.8%±4.9% (圖4A)。RTCA系統(tǒng)檢測同樣發(fā)現(xiàn)HCT116-shCARMA3-93細胞生長減緩，72 h抑制率為50.5%±6.5% (圖4B)。與HCT116和HCT116-sheGFP細胞相比，HCT116-shCARMA3-93細胞的集落形成能力受到明顯抑制，2周后集落形成抑制率為78.5%±9.5% (圖5)。細胞增殖和克隆形成受抑制與細胞周期改變有關。流式細胞術檢測結果顯示HCT116、HCT116-sheGFP和HCT116-shCARMA3-93的G0/G1期細胞所占比例分別為45.5%±5.6%、47.1%± 4.3%和60.4%±6.0%；S期細胞所占比例分別為48.4%±5.0%、46.0%±5.6%和31.9%±2.9%(圖6)。與對照組相比，HCT116-shCARMA3-93的G0/G1期細胞所占比例明顯升高，S期細胞比例相應下降。用Western blot檢測HCT116、HCT116-sheGFP和HCT116-shCARMA3-93細胞相關蛋白表達的變化，發(fā)現(xiàn)CARMA3受抑制后下游信號通路分子Bcl10和NF-κB表達下調，MALT-1變化不明顯；cyclin D1顯著下調，cyclin A表達略有下降(圖11)。

Figure 4.WST-1 assay (A) and RTCA assay (B) for cell viability. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHCT116-sheGFP (72 h).

圖4 WST-1和RTCA法檢測細胞活力的變化

Figure 5.The colony formaion ability of different cell lines (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHCT116-sheGFP.

圖5CARMA3基因敲減對細胞集落形成能力的抑制作用

3 敲減CARMA3基因抑制HCT116細胞遷移和侵襲能力

為深入探討CARMA3在腫瘤侵襲轉移中的作用，本研究應用劃痕實驗和體外遷移實驗分別觀察細胞水平方向和垂直方向遷移能力的改變，利用體外侵襲實驗分析細胞侵襲能力的變化。如圖7所示，細胞培養(yǎng)48 h后，對照組HCT116細胞和HCT116-sheGFP細胞的損傷基本恢復，而HCT116-shCARMA3-93細胞的損傷恢復能力明顯減弱。48 h損傷恢復率分別為93.5%±5.8%、93.9%±6.1%和68.9%±2.1%。體外遷移實驗表明，HCT116-shCARMA3-93較HCT116和HCT116-sheGFP穿膜細胞數(shù)明顯減少，48 h抑制率分別為57.3%±9.5%和55.7%±9.5%，差異具有統(tǒng)計學意義(圖8)。為進一步分析細胞侵襲能力的改變，應用體外侵襲實驗觀察細胞突破基底膜的情況。同樣可見，HCT116-shCARMA3-93穿膜細胞數(shù)明顯減少，48 h抑制率分別為68.5%±10.2%和67.6%±10.3%(圖9)。說明敲減CARMA3會降低HCT116細胞的遷移和侵襲能力。采用Western blot檢測侵襲轉移相關蛋白，進一步分析機制。結果顯示，相較于對照組，HCT116-shCARMA3-93細胞中MMP-2、MMP-9表達下調，MMP-7未見改變。TIMP-1和TIMP-2表達上調(見圖11)。

Figure 6.The cell cycle analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHCT116-sheGFP.

圖6 流式細胞術檢測各組細胞周期的變化

Figure 7.Wound healing ability of different cell lines (×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHCT116-sheGFP.

圖7 劃痕實驗檢測細胞創(chuàng)傷愈合能力

4 敲減CARMA3基因逆轉HCT116細胞的EMT

敲減CARMA3后觀察HCT116細胞形態(tài)的改變，發(fā)現(xiàn)對照組細胞HCT116和HCT116-sheGFP細胞均呈長梭形，細胞排列松散，細胞間黏附力弱。而HCT116-shCARMA3-93細胞則呈卵圓形上皮樣，細胞排列規(guī)則、細胞間連接緊密(圖10)。Western blot檢測EMT相關分子的表達，發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達水平升高，N-cadherin、鋅指轉錄因子Snail、Slug和EMT因子Twist表達水平呈不同程度降低(圖11)。

討 論

研究表明，CARMA3在多種實體瘤中高表達，如腸癌[4]、肺癌[5]、乳腺癌[6]、卵巢癌[7]、腎癌[8]、膀胱癌[9]等。趙婷婷等[4]應用免疫組化技術發(fā)現(xiàn)結直腸癌組織過表達CARMA3，表達水平與TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移以及Ki-67表達明顯相關。Miao等[10]在結腸癌細胞HCT116和HT29中也發(fā)現(xiàn)CARMA3呈高水平表達。推測CARMA3在結腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有一定促進作用。為了觀察CARMA3對結腸癌生長和侵襲轉移的影響，本研究通過RNA干擾和慢病毒感染技術敲減結腸癌細胞HCT116中CARMA3的表達，發(fā)現(xiàn)細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲隨之受到抑制，這與Wang等[11]在結腸癌細胞SW480和HT29中觀察到的現(xiàn)象相符，說明CARMA3會促進結腸癌細胞的生長和轉移。

Figure 8.CARMA3 knockdown inhibited the migration of the HCT116 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHCT116-sheGFP.

圖8 敲減CARMA3抑制HCT116細胞遷移能力

Figure 9.CARMA3 knockdown inhibited the invasion of the HCT116 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHCT116-sheGFP.

圖9 敲減CARMA3抑制HCT116細胞侵襲能力

Figure 10.The morphological changes of the cells withCARMA3 knockdown (×400).

圖10 敲減CARMA3后細胞形態(tài)的變化

Figure 11.The protein expression in different cell lines determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsHCT116-sheGFP.

圖11 Western blot檢測蛋白表達

腫瘤增殖失控與生長相關信號通路異常有關。持續(xù)性激活NF-κB信號通路可誘導腫瘤生長相關細胞因子的產生，促進腫瘤的形成。CARMA3作為NF-κB上游的關鍵信號分子，通過其CARD結構域與Bcl10的CARD結構域相連，再結合MALT-1形成CBM復合物。Bcl10 CARD結構域的Lys63殘基經多次泛素化后，被IKK復合物中的NEMO殘基所識別，促使IKK與CBM復合物相互作用，誘發(fā)NF-κB的活化。Western blot結果顯示，CARMA3受抑制后下游信號分子Bcl10和NF-κB明顯下調，與Du等[12]在胰腺癌中得到的結果一致。說明CARMA3可通過CBM復合物介導的NF-κB信號通路影響腫瘤生物學行為。NF-κB通路是CARMA3發(fā)揮促癌作用最主要的信號通路，這在多種腫瘤中得到證實。NF-κB過度活化還會引起細胞周期相關蛋白活性異常，導致細胞周期紊亂。細胞周期蛋白cyclin D1的主要功能是推動細胞周期由G1期進入S期，cyclin A則促進S期向G2期轉變。而cyclin D1啟動子含有2個NF-κB結合位點，活化的NF-κB具有促進cyclin D1表達及G1/S期轉換的功能。Miao等[10]應用瞬時轉染技術使結腸癌細胞Lovo過表達CARMA3，發(fā)現(xiàn)NF-κB和cyclin D1表達隨之增高。將NF-κB抑制劑BAY 11-7082作用于轉染后的LoVo細胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長減緩，NF-κB和cyclin D1表達受到明顯抑制。說明cyclin D1受NF-κB的直接調控。結合本研究結果推測，敲減CARMA3基因后結腸癌細胞HCT16被阻滯于G0/G1期，生長和克隆形成受抑制。這可能與CARMA3調控下游NF-κB信號通路，進而下調cyclin D1有關。

腫瘤的侵襲轉移是導致結腸癌高致死率的主要原因。目前已發(fā)現(xiàn)多條信號通路參與調控結腸癌的侵襲轉移，包括NF-κB信號通路、PI3K/AKT信號通路、TGF-β-Smad信號通路、Wnt-連環(huán)素信號通路、整合素激活FAK介導的信號通路等[13]。其中NF-κB信號通路尤為重要。CARMA3作為NF-κB上游信號分子，其過表達會持續(xù)激活NF-κB。活化后的NF-κB通過結合下游MMPs的啟動子序列，使其表達上調[14]。MMPs能特異性降解細胞外基質幾乎所有成分，促進腫瘤浸潤和轉移。MMPs的活性還受其抑制劑TIMPs的調控。MMPs和TIMPs的比例(MMPs上調或TIMPs下調)可引起腫瘤轉移表型的產生。在結直腸癌組織中，李中信等[15]發(fā)現(xiàn)NF-κB可通過上調MMP-9促進癌細胞脫落至腹腔形成微轉移。本研究體外實驗也證實了CARMA3通過改變侵襲轉移分子(MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2)影響結腸癌細胞HCT116的遷移和侵襲，與非小細胞肺癌[5]和膠質瘤細胞[16]中的結論一致。Qin等[17]應用經典的NF-κB通路激活劑TNF-α干預HCT116細胞證實NF-κB通路活化后MMP-2和MMP-9表達量增高，提示NF-κB可直接調控HCT116細胞中MMP-2和MMP-9的表達。但CARMA3是否通過NF-κB通路直接調控MMPs和TIMPs影響腫瘤侵襲轉移，有待進一步驗證。

EMT亦被認為是參與實體瘤轉移的主要機制之一。EMT通過肌動蛋白-肌球蛋白的收縮和細胞黏附的變化改變細胞形態(tài)，分泌MMPs破壞基底膜，重組細胞骨架增強細胞運動能力。EMT和MET表型轉換是可逆的，大部分由轉錄因子Snail、Slug、Twist和Sip調控。這些轉錄因子表達水平降低會引起上皮標志物E-cadherin表達上調、間充質標志物N-cadherin和MMPs表達下調，促進MET[18]。本研究觀察到敲減CARMA3基因后HCT116細胞發(fā)生MET，Western blot檢測EMT相關分子亦發(fā)生相應改變。其他學者在膀胱癌中也觀察到CARMA3對EMT相關分子和MMPs的影響[19]。Pires 等[18]發(fā)現(xiàn)NF-κB p65可直接結合于Twist1、Slug和Sip1啟動子區(qū)域調控EMT，進而改變MMPs的表達，抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲能力。劉寶玉等[20]用NF-κB抑制劑PDTC干預HCT116細胞，發(fā)現(xiàn)EMT形態(tài)受抑制，細胞侵襲遷移能力減弱。這與NF-κB、N-cadherin表達下調，E-cadherin表達增加有關。結合本研究結果，推測CARMA3參與調節(jié)EMT，改變MMPs和TIMPs表達，影響結腸細胞HCT116的侵襲轉移，這可能是通過改變NF-κB活性實現(xiàn)的。

綜上所述，敲減結腸癌細胞HCT116中的CARMA3基因會降低細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力。研究結果證實CARMA3通過將細胞阻滯于G0/G1期來抑制腫瘤生長，同時促進EMT逆轉，改變侵襲轉移分子表達影響腫瘤的侵襲轉移，推測與其下游NF-κB信號通路發(fā)生改變有關。本研究初步探討了CARMA3在結腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為以CARMA3為靶點治療結腸癌提供新思路。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

CARMA3 gene knockdown in HCT116 cells inhibits cell growth, migration and invasion

LIU Fang1, 2, LIN Wan-song1, 2, CHEN Shu-ping1, 2, YE Yun-bin1, 2

(1Immuno-OncologyLaboratory,FujianCancerHospital&FujianMedicalUniversityCancerHospital,2FujianKeyLaboratoryofTranslationalCancerMedicine,Fuzhou350014,China.E-mail:zjyunbin@189.cn)

AIM: To study the effcts of caspase recruitment domain membrane-associated guanylate kinase protein 3 (CARMA3) knockdown on the growth, migration and invasion of human colonic carcinoma HCT116 cells and to analyze the mechanism. METHODS: A colonic carcinoma cell line with CARMA3 over-expression was selected. TheCARMA3 gene in the HCT116 cells was knocked down by lentivirus technique. After screening by puromycin, the stably-transfected HCT116-shCARMA3 cell line was constructed. CARMA3 expression at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blot， respectively. The cell proliferation was analyzed by WST-1 assay and RTCA S16 system. The colony formation ability was measured by colony-forming assay. The cell cycle was analyzed by flow cytometry. The cell morphological changes were observed under microscope. The abilities of migration and invasioninvitrowere observed by wound healing assay and Transwell assay. The changes of related molecules were determined by Western blot to explore the mechanism. RESULTS: The expression of CARMA3 at mRNA and protein levels in the HCT116 cells was the highest in the 4 colonic carcinoma cell lines. HCT116-shCARMA3 cells with stably-silencedCARMA3 gene were successfully established. Among them, HCT116-shCARMA3-93 cells showed the greatest inhibition of CARMA3 at mRNA and protein levels. Therefore， HCT116-shCARMA3-93 cells were chosen as the cell model. Compared with control group, the morphological changes of the HCT116-shCARMA3-93 cells had epithelial-mesenchymal transition (EMT) reversion. The abilities of proliferation, colony formation, migration and invasion in the HCT116-shCARMA3-93 cells were obviously suppressed (P<0.01). G0/G1phase proportion was increased and S phase proportion was correspondingly decreased (P<0.05). Bcl10 and NF-κB were down-regulated, and mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1 (MALT-1)showed no change. Cyclin D1 was decreased obviously and cyclin A declined slightly. Metastasis-related mar-kers matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 were reduced， MMP-7 remained unchanged, while tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP)-1 and TIMP-2 were up-regulated. Furthermore, EMT-associated molecule E-cadherin was increased, while N-cadherin, Snail, Slug and Twist were decreased to some extent. CONCLUSION: CARMA3 has an impact on the growth， migration and invasion of colonic carcinoma cell line, which is possibly related to NF-κB signaling pathway to change cell cycle and metastasis-related markers and to regulate EMT.

CARMA3; Colonic carcinoma; Lentivirus; Cell growth; Cell migration; Cell invasion

1000- 4718(2017)06- 1021- 10

2017- 03- 07

2017- 04- 06

國家臨床重點?？平ㄔO項目資助；福建省衛(wèi)生廳青年科研課題(No. 2014-1-12)

R730.23； R735.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.011

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