徐丹，李風(fēng)森，龔理，李爭，荊晶，王晶

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 a.國家中醫(yī)臨床研究基地，b.呼吸科，c.新疆呼吸病研究實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

IL-17基因多態(tài)性位點(diǎn)與新疆地區(qū)慢性阻塞性肺病的風(fēng)險關(guān)系*

徐丹a，李風(fēng)森a，龔理b，李爭a，荊晶a，王晶c

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 a.國家中醫(yī)臨床研究基地，b.呼吸科，c.新疆呼吸病研究實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000)

目的 探討IL-17基因核苷酸多態(tài)性與新疆地區(qū)慢性阻塞性肺病(COPD)的風(fēng)險關(guān)系。方法 采用多重單堿基延伸單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型技術(shù)(SNaPshot)對149例COPD患者及97例健康人IL-17A基因rs2275913、rs3819024、rs3819025、rs4711998、rs8193036 5個SNP位點(diǎn)及IL-17F基因rs12203582、rs1266828、rs7771466、rs9382084 4個SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，并比較不同基因型和等位基因與COPD的風(fēng)險關(guān)系。結(jié)果 健康人與穩(wěn)定期COPD患者在IL-17A的5個SNP位點(diǎn)及IL-17F的4個SNP位點(diǎn)均未見差異。其位點(diǎn)的變異、突變基因型分布與COPD的易感性亦無明顯差異，對IL-17F及IL-17A基因的SNP進(jìn)行連鎖不平衡反應(yīng)后的分析結(jié)果表明，IL-17A基因CAA單體型在COPD與健康人間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(OR=0.244，95%CI：0.057～1.043，P<0.05)。結(jié)論IL-17F及IL-17A基因多態(tài)性與COPD患病無直接風(fēng)險關(guān)系，但在IL-17A基因單體型CAA改變可能與新疆地區(qū)COPD易感性有關(guān)。

慢性阻塞性肺??；IL-17；基因多態(tài)性

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)主要危險因素是遺傳與環(huán)境共同作用的結(jié)果?；趯OPD 病理遺傳機(jī)制研究的不斷深入，目前研究的候選基因主要參與水解和抗水解、氧化和抗氧化、炎癥反應(yīng)、有毒物質(zhì)代謝、氣道高反應(yīng)性和主動防御機(jī)制等[1-2]。研究資料顯示，IL-17A、IL-17F均能刺激COPD患者氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)[3-4]，且COPD患者IL-17的含量與氣道平滑肌增生程度及結(jié)締組織增生程度存在相關(guān)性。目前國內(nèi)外對IL-17基因多態(tài)性與COPD易感性的報道較少。本研究旨在分析新疆地區(qū)人群IL-17A、IL-17F基因多態(tài)性及單倍型的特點(diǎn)，探討該基因多態(tài)性與COPD患者的風(fēng)險關(guān)系，以期為COPD的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2014年1-12月于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院門診及住院的穩(wěn)定期COPD患者149例，男92例，女57例，年齡(65.5±12.2)歲；收集同期體檢健康者97例，男59例，女38例，年齡(63.7±10.2)歲。兩組在年齡及性別上差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且均來自新疆地區(qū)。COPD患者中漢族81例,維吾爾族35例，回族19例，哈薩克族9例，其他民族5例，健康人對照組中漢族59例，維吾爾族21例，回族7例，哈薩克族3例，其他民族7例。納入標(biāo)準(zhǔn)[5]：(1)根據(jù)臨床表現(xiàn)、危險因素接觸史、體征及肺功能測定等資料確診為COPD，(2)慢性咳嗽、咳痰和(或)呼吸困難及危險因素接觸史；存在不完全可逆性氣流受限(用支氣管舒張劑后FEV1/FVC<70%)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并氣胸、肺癌、肺結(jié)核等其他嚴(yán)重肺部疾病者，(2)合并嚴(yán)重心腦血管、肝腎和造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾病者，(3)精神病患者，(4)妊娠及哺乳期婦女。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 核酸蛋白定量儀(K5500，北京凱奧公司)，多用電泳儀電源(BG-Power3500，北京百晶公司)，凝膠成像系統(tǒng)(BioDoc-IT Imaging System，美國UVP公司)，紫外分析裝置(FR-110，上海復(fù)日科技公司)，2720型Thermal Cycle熱循環(huán)儀，ABI3730XL測序儀(美國ABI公司)，血液基因組DNA提取系統(tǒng)(非離心柱型)(DP319-02，北京天根公司)。瓊脂糖(AB0013)、50×TAE(SD8108)溴酚蘭(批號：B0312-5g)購自上海生工公司，溴化乙錠(E8751)、6×Loading buffer(9156)、DL 2 000 DNA Marker(批號：3427A)均購自TaKaRa公司，HotStarHiFidelity Polymerase Kit熱啟動高保真酶(批號：202605，Qiagen公司)，蝦堿酶(SAP)(批號：M9910，Promega公司)，外切酶I(EXO-I、批號：#EN0581，Thermo公司)，Hi-DiTMFormamide(批號：4311320)、SNaPshot?Multiplex Kit(批號：4323161)、GeneScanTM-120 GeneScan(批號：4324287)均購自ABI公司，DNA提取試劑盒(批號：DP319-02)、DNA純化試劑盒(批號：DP319-02)均購自北京天根公司。

1.3 基因組DNA提取 采集COPD患者及健康人空腹靜脈血2 mL，EDTA-Na2抗凝，用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，樣本置-80 ℃保存。

1.4 PCR及測序鑒定 采用多重單堿基延伸單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型技術(shù)(SNaPshot)對IL-17A基因rs2275913、rs3819024、rs3819025、rs4711998、rs8193036 5個SNP位點(diǎn)及IL-17F基因rs12203582、rs1266828、rs7771466、rs9382084 4個SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型。根據(jù)GenBank中基因的序列號[IL-17A(NC_000006.12)，IL-17F(NC_000006.12)],用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并送上海生工公司合成，各SNP位點(diǎn)的引物見表1，延伸引物序列見表2。

表1 引物序列及產(chǎn)物片段大小

PCR總反應(yīng)體系為25 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL，10 μmol/L dNTPs 4 μL,10×PCR buffer 1 μL，模板DNA 2 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足體積。采用Touch-down PCR，循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 20 s，65 ℃ (每個循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃)40 s，72 ℃ 1.5 min，共11個循環(huán),95 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共24個循環(huán)；72 ℃ 2 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物純化反應(yīng)：10 μL PCR產(chǎn)物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，37 ℃溫浴1 h,75 ℃滅活15 min。延伸產(chǎn)物純化在10 μL延伸產(chǎn)物中加入1 U SAP酶，37 ℃溫浴1 h,然后75 ℃滅活15 min。延伸產(chǎn)物檢測采用ABI 3730XL測序儀及GeneMapper 4.1軟件(美國Applied Biosystems公司)分析。

表2 延伸引物序列

2 結(jié)果

2.1 對照組與COPD組IL-17A與IL-17F基因多態(tài)性分析 結(jié)果顯示，健康人與穩(wěn)定期COPD患者在IL-17A5個SNP位點(diǎn)及IL-17F4個SNP位點(diǎn)表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，rs4711998基因型位點(diǎn)在共顯性模型下，與野生純合型AA攜帶者相比，GG純合型攜帶者與COPD患病風(fēng)險顯著相關(guān)(OR=2.947，95%CI：1.080～8.888，P=0.034)，其余位點(diǎn)的變異與COPD的易感性以及突變基因型分布與COPD的發(fā)病無明顯關(guān)系。

表3 COPD患者與健康人IL-17A及IL-17F 基因型及等位基因型頻率分析[n(%)]

續(xù)表

2.2 連鎖不平衡分析

2.2.1IL-17F基因4個SNP連鎖不平衡分析IL-17F基因rs7771466、rs12203582、rs9382084 和rs1266828 4個多態(tài)性位點(diǎn)連鎖不平衡分析顯示，無論在對照組還是在COPD組連鎖不平衡系數(shù)|D′|均>0.5，表明 4 個 SNP 位于同一個單體型區(qū)域，該4個SNPs可以構(gòu)建單體型。IL-17F基因單體型分析見表4。

表4 IL-17F基因單體型分布頻率[n(%)]

2.2.2IL-17A基因3個SNP連鎖不平衡分析IL-17A基因rs8193036、rs3819024和rs2275913多態(tài)性位點(diǎn)連鎖不平衡分析顯示，無論在對照組還是在CPOD組連鎖不平衡系數(shù)|D′|均>0.5，表明 3 個 SNP 位于同一個單體型區(qū)域，這3個SNPs可以構(gòu)建單體型。其余2個位點(diǎn)與rs8193036、rs3819024和rs2275913多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖不平衡系數(shù)|D′|均<0.5，尚不能構(gòu)成基因單體型。通過連鎖不平衡反應(yīng)，顯示IL-17A基因單體型CAA在COPD與健康人差異有統(tǒng)計學(xué)意義(OR=0.244，95%CI：0.057～1.043，P<0.05)。見表5。

表5 IL-17A基因單體型分布頻率[n(%)]

3 討論

研究表明，遺傳因素在COPD的發(fā)病及發(fā)展過程中具有重要作用，COPD患者的部分基因可以影響患者對周圍環(huán)境的敏感性，從而導(dǎo)致該疾病的易感性[6]。但目前已證實(shí)的遺傳基因?qū)OPD的影響報道不一。本課題組前期研究結(jié)果也顯示IL-17在COPD大鼠模型氣道呈高表達(dá)狀態(tài)。因此，本研究對IL-17A、IL-17F基因多態(tài)性的差異進(jìn)行分析，探討該基因與COPD的易感性及風(fēng)險性是否存在一定的關(guān)聯(lián)。

本研究用SNaPshot技術(shù)檢測IL-17A及IL-17F的多個SNP位點(diǎn)的基因型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17A及IL-17F的基因型及等位基因頻率分布COPD組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測其位點(diǎn)與COPD的易感性無明顯相關(guān)關(guān)系。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，僅IL-17Ars4711998基因型位點(diǎn)在共顯性模型下，與野生純合型AA攜帶者相比，GG純合型攜帶者與COPD患病風(fēng)險顯著相關(guān)(OR=2.947，95%CI：1.080～8.888，P=0.034)，進(jìn)一步對IL-17F及IL-17A基因的SNP進(jìn)行連鎖不平衡反應(yīng)，單體型分析結(jié)果顯示，IL-17F基因AGTA、CATA、CGGA、CGGG、CGTA 5種單體型在COPD組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而IL-17A單體型CAA在COPD與健康人對照間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(OR=0.244，95%CI：0.057～1.043，P<0.05)，提示IL-17A基因單體型CAA與COPD患者的易感性存在相關(guān)性。CAA可能使COPD患者的保護(hù)單倍型。

本研究并未發(fā)現(xiàn)IL-17A、IL-17F的基因型及等位基因與COPD存在相關(guān)性，推測與下列因素有關(guān)：(1)人種差異：在不同的人種同一基因位點(diǎn)的多態(tài)性分布可能存在差異，新疆為少數(shù)民族大聚集的地方，民族多樣化，可能影響基因的分布。(2)樣本數(shù)量：本研究樣本量適中，但進(jìn)行亞組分析樣本量較少，未對患者種族及表型、癥狀嚴(yán)重程度進(jìn)行等分層比較。(3)IL-17A、IL-17F基因位點(diǎn)較多，各位點(diǎn)之間存在連鎖不平衡，不能明確起決定性的基因位點(diǎn)。盡管本研究未能發(fā)現(xiàn)COPD患者與健康人對照組間IL-17F及IL-17A基因分布及等位基因頻率分布差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，但在IL-17A基因單體型CAA改變可能與新疆地區(qū)COPD易感性有關(guān)，可能具有降低新疆各民族患COPD的風(fēng)險。IL-17A基因單體型CAA改變可能使IL-17A對機(jī)體的影響加強(qiáng)從而增加呼吸道炎癥的產(chǎn)生和持續(xù)，使得COPD疾病的發(fā)生有易感趨勢。本研究下一步將增加樣本量，并對COPD患者進(jìn)行嚴(yán)重程度及新疆少數(shù)民族進(jìn)行分層研究，從而探索新疆地區(qū)COPD患者的基因水平的易感性及風(fēng)險相關(guān)性，為疾病的診斷及預(yù)防提供更多的試驗(yàn)依據(jù)。

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[2]Bosse Y．Genetics of chronic obstructive pulmonary disease:a succinct review,future avenues and prospective clinical applications[J]．Pharmacogenomics,2009,10(4):655-667．

[3]Ganjalikhani HM,Gheadi K,Andalib A,etal.Optimization of human Th17 cell differentiatiom in vitro:Evaluating different polarizing factors in vitro[J].Cell Dev Biol Anim,2011,47(8):581-592.

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[6]Anto JM, Vermeire P, Vestboz J,etal.Epidemiology of chronic obstructive pulmonary disease[J].Eur Respir J,2001,17(5): 982-994.

(本文編輯：許曉蒙)

Correlation ofIL-17 gene polymorphism with chronic obstructive pulmonary disease in Xinjiang aera

XUDana,LIFeng-sena,GONGLib,LIZhenga,JINGJinga,WANGJingc

(a.NationalClinicalResearchBaseofTCM,b.DepartmentofRespiration,c.XinjiangKeyLaboratoryofRespiratoryDiseaseResearch,TraditionalChineseMedicineHospitalAffiliatedtoXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,Xinjiang,China)

Objective To investigate the correlation ofIL-17 gene polymorphism with chronic obstructive pulmonary diseases (COPD) in Xinjiang area. Methods Five single nucleotide polymorphism (SNP) loci ofIL-17Agene, including rs2275913, rs3819024, rs3819025, rs4711998 and rs8193036, and 4 SNP loci ofIL-17Fgene such as rs12203582, rs1266828, rs7771466 and rs9382084 from 149 COPD patients and 97 healthy controls were performed typing using the multiple single-base extension SNP (SNaPshot) technology, and the risk correlations of different genotypes and alleles of these loci with COPD were analyzed. Results There was no difference in the SNP of 5IL-17Agene loci and 4IL-17Agene loci between stable COPD patients and healthy controls, and the mutation and genotype distribution of these loci were not correlated with COPD susceptibility. However, the linkage disequilibrium analysis showed that there was significant difference in the distribution ofIL-17Agene haplotype CAA between COPD patients and healthy controls (OR=0.244, 95%CI: 0.057-1.043,P<0.05). Conclusion TheIL-17FandIL-17Agene polymorphisms are not correlated with the risk of COPD, but the haplotype CAA ofIL-17Agene may be related to the susceptibility of COPD in Xinjiang area.

chronic obstructive pulmonary disease; IL-17; genetic polymorphism

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.06

新疆維吾爾自治區(qū)科研機(jī)構(gòu)創(chuàng)新發(fā)展專項(xiàng)資金(2014751005)。

徐丹，1983年生，女，主治醫(yī)師，碩士，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合呼吸。

李風(fēng)森，主任醫(yī)師，教授，博士，E-mail：fengsen602@163.com。

R563

A

2017-02-23)