魏 力，徐寧迎

(浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058)

動物免疫抗體產(chǎn)生因素的初步研究

魏 力，徐寧迎

(浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058)

動物的免疫保護效果受抗原劑量、濃度、佐劑、接種間隔時間以及抗體檢測方法等多種因素的影響。為確定試驗兔免疫過程中影響免疫效果的具體因素及其影響程度，優(yōu)化兔子的免疫程序，筆者探究了佐劑、免疫次數(shù)和性別對供試兔免疫保護效果的影響。結(jié)果顯示：佐劑組新西蘭大白兔抗體水平顯著高于對照組(P<0.01)；不同性別組新西蘭大白兔的抗體滴度水平均隨免疫次數(shù)呈上升趨勢，組間上升趨勢相近(P>0.05)；同時，在一定范圍內(nèi)，抗原活化B細胞產(chǎn)生的抗體水平與免疫次數(shù)呈正相關(guān)，但到達一定限度后抗體水平不再顯著上升。

抗原；免疫程序；抗體水平；佐劑；兔

免疫程序是根據(jù)動物年齡、疫苗種類、飼養(yǎng)目的等制定的免疫接種計劃，包括接種時間、接種劑量、接種途徑、接種次數(shù)等。免疫程序的選擇需多方面、綜合性考量，其結(jié)果可能受抗原、佐劑、接種間隔時間等多種因素影響。對于同種疫苗，不同的免疫程序?qū)ζ涿庖咝Ч绊戄^大[1]。明確免疫程序中具體影響因素的作用，通過改進、優(yōu)化免疫程序，對于收獲高效的免疫保護效果具有重要意義。

影響動物免疫保護效果的因素一般有疫苗質(zhì)量、疫苗劑量、佐劑、免疫時間和次數(shù)等。佐劑與抗原同時或預先應用，能增強機體針對該抗原的免疫應答能力，對于提升抗原或疫苗的免疫保護效果起著重要作用[2]。首免時間和次數(shù)對于免疫保護效果的影響同樣較大[3]。此外，動物如果存在先天性免疫缺陷，或者感染某些可引起免疫抑制的病原(如PRRSV、IBDV等)，其免疫系統(tǒng)受損，也會最終影響免疫保護效果。

近年來，浙江、四川等地養(yǎng)兔產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，部分養(yǎng)殖戶對于優(yōu)化家兔免疫程序具有現(xiàn)實需求，同時關(guān)于家兔免疫保護效果影響因素的研究報道相對較少，本研究旨在探討抗原、佐劑、免疫次數(shù)和性別對家兔免疫效果的影響，以期為制定科學的免疫程序提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗兔購自杭州某兔業(yè)專業(yè)合作社，隨機選擇3月齡新西蘭大白兔60只(公母各30只)，體重2.5～2.6 kg。隨機分成6組，每組5只公兔、5只母兔，分別命名為PKC zeta+FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2、PKC zeta、P300+FCA/FIA、P300+Montanide ISA50 V2、P300組(詳見表1)。

表1 試驗動物分組

1.2 抗原與佐劑 試驗選用PKC zeta與P300兩種抗原；FCA/FIA、Montanide ISA50 V2作為疫苗佐劑。其中FCA/FIA購自美國Sigma公司，Montanide ISA50 V2購自法國SEPPIC公司。

1.3 試驗方法 試驗期71 d，初免時間為第4 d，然后于第25 d、39 d、53 d和67 d進行第二至第五次的加強免疫，所有供試兔均于71 d時剖殺，采集血樣和脾臟，并于每次免疫前3 d采集血樣備用。每次免疫佐劑量為0.5 mL ，抗原量除第一次和第五次為0.5 mg外，其余均為0.25 mg，濃度為1 mg/mL。采用皮下分點注射免疫。

血清抗體水平檢測按ELISA試劑盒說明步驟檢測血清抗體水平，每份血清檢測3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 佐劑和抗原對特異性IgG抗體水平的影響 詳見圖1、圖2。

圖1 血清中抗PKC zeta特異性IgG抗體的動態(tài)變化

由圖1可見，從二免開始至終免，PKC zeta+FCA/FIA組與PKC zeta+Montanide ISA50 V2組的抗體水平一直高于PKC zeta組，差異極顯著(P<0.01)，提示疫苗佐劑FCA/FIA與Montanide ISA50 V2均具有良好的免疫增強效果，且對PKC zeta抗原而言，佐劑FCA/FIA的免疫增強效果優(yōu)于佐劑Montanide ISA50 V2。

圖2 血清中抗P300特異性IgG抗體的動態(tài)變化

由圖2可見，從二免開始至終免，除二免時P300與P300+FCA/FIA組抗體水平無顯著差異外(P>0.05)，其余各時期P300+FCA/FIA組與P300+Montanide ISA50 V2組抗體水平差異均顯著高于對照組P300組(P<0.05)，其中三免時P300+Montanide ISA50 V2組與P300組抗體水平差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果提示佐劑FCA/FIA與Montanide ISA50 V2均具有較好的增強免疫應答效果，且對P300抗原，Montanide ISA50 V2佐劑的增強效果優(yōu)于FCA/FIA佐劑。

2.2 動物性別對特異性IgG抗體水平的影響 詳見圖3。

由圖3可見，免疫抗原PKC zeta、PKC zeta+佐劑FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2免疫后，公、母兔抗體水平均呈上升趨勢，且兩種趨勢相近，差異不顯著(P>0.05)。免疫抗原P300免疫后，公、母兔抗體水平基本維持不變，兩者無顯著差異(P>0.05)；免疫P300+FCA/FIA、P300+Montanide ISA50 V2后，公、母兔抗體滴度水平均呈上升趨勢，兩者趨勢相近，差異不顯著(P>0.05)。

2.3 免疫次數(shù)對特異性IgG抗體水平的影響 詳見圖4。

由圖4可見，采用PKC zeta、PKC zeta+FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2、P300、P300+FCA/FIA、P300+Montanide ISA50 V2 6組抗原+佐劑免疫后，除抗原P300組的一免外，其他各組的抗體水平總體隨免疫次數(shù)呈上升趨勢，其中PKC zeta、PKC zeta+FCA/FIA、P300+FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2組的抗體水平上升趨勢呈線性上升，而P300+Montanide ISA50 V2組抗體水平則在三免前抗體水平呈線性上升，之后一直維持在較高水平。由此可見，隨著免疫次數(shù)的增加，動物抗體水平呈現(xiàn)上升趨勢，至一定限度后上升幅度漸趨平緩；提示在一定范圍內(nèi)，抗原活化B細胞產(chǎn)生的抗體水平與免疫次數(shù)呈正相關(guān)，到達一定限度后，不再上升而是維持在較高水平；研究結(jié)果與克隆選擇理論基本一致。

3 小結(jié)與討論

抗原免疫保護效果受抗原劑量與濃度、佐劑、免疫接種間隔時間及抗體檢測方法等多種因素影響[4]。因此，明確每一種因素的影響效果，對合理優(yōu)化抗原的免疫程序具有重要意義。筆者在本次試驗中著重探討了抗原、佐劑、免疫次數(shù)和動物性別對免疫保護效果的影響，以期為制定科學的免疫程序、進一步提高疫苗的免疫保護效果提供試驗依據(jù)。

圖3 不同性別新西蘭大白兔免疫PKC zeta、P300后特異性IgG抗體的動態(tài)變化

3.1 佐劑對于免疫保護效果具有重要影響 由圖1與圖2可知，抗原組的抗體水平顯著低于抗原+佐劑組的抗體水平，顯示了佐劑具有良好的免疫增強效果。使用佐劑FCA/FIA、Montanide ISA50 V2均能誘導強而持久的免疫保護效果，且兩者各具優(yōu)勢，F(xiàn)CA/FIA作為經(jīng)典的油包水佐劑，來源廣泛、價格經(jīng)濟；而Montanide ISA50 V2乳劑非常穩(wěn)定、易于注射且基本無副作用[5]。

3.2 動物性別對于免疫保護效果的影響不顯著 由圖3可知，同一抗原不同性別組的抗體水平之間無顯著性差異，顯示動物性別對免疫保護效果無明顯影響或影響不顯著。理論上認為，動物的免疫保護效果受抗原本身、佐劑、免疫程序、機體健康水平等多種因素的影響，性別因素則對其影響甚微，目前亦未見相關(guān)報道證實動物性別因素在免疫保護效果方面存在顯著影響。

3.3 免疫次數(shù)與免疫效果存在相關(guān)性 由圖3、圖4可知，在一定范圍內(nèi)抗體水平與免疫次數(shù)呈正相關(guān)，達到一定限度后，抗體水平不再顯著上升而維持在較高水平。

圖4 不同免疫次數(shù)的新西蘭大白兔特異性IgG抗體的動態(tài)變化

鑒于動物性別對于抗原免疫保護效果的影響不顯著，故將同一抗原免疫的10只供試兔的相關(guān)數(shù)據(jù)合并統(tǒng)計，即每一組10只供試兔不再區(qū)分公母，一并統(tǒng)計。從圖4可知，隨著免疫次數(shù)的增加，試驗動物抗體水平亦不斷升高，如PKC zeta、PKC zeta+FCA/FIA、P300+FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2組；比較特別的是，P300+Montanide ISA50 V2組抗體水平先隨免疫次數(shù)增加而增加，后維持較高水平不再上升。試驗結(jié)果表明：抗體水平達到一定限度后，抗體水平不再隨免疫次數(shù)增加而上升，而是維持在較高水平或趨緩慢上升，這與顧一峰等(2004)[6]對大鼠的相關(guān)研究結(jié)果相似。因此，為獲得較高的抗體水平不可一味加大免疫劑量，達一定限度后即使增加免疫劑量抗體水平也不再上升，有時還會加重動物的承載負擔，故應根據(jù)抗體監(jiān)測水平?jīng)Q定免疫次數(shù)，適量免疫。推薦采用低劑量長程免疫的免疫方法為佳。

根據(jù)上述佐劑、性別、免疫次數(shù)對抗原免疫保護效果影響的試驗與分析，可以確定家兔免疫程序中佐劑、免疫次數(shù)和動物性別的作用，而且可從該角度出發(fā)經(jīng)科學安排以提高抗原免疫保護效果。為獲得良好的免疫保護效果，建議可選擇適宜的免疫程序和佐劑、適當增加免疫次數(shù)來提高動物的免疫保護效果。

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2017-02-20

S852.4

A

1005-7307(2017)03-0006-004