朱德全 王茗悅 栗金柳 張躍華 張武

摘要[目的]分析動物雙歧桿菌AD011暴露外表面蛋白的種類和功能，有助于了解該菌株的各項生理功能以及為探討該菌與宿主相互作用的分子機制奠定基礎(chǔ)。[方法]以動物雙歧桿菌AD011基因組序列為研究對象，采用Inmembrane方法和COG功能數(shù)據(jù)庫對預(yù)測的外表面蛋白進行功能注釋和聚類分析。[結(jié)果]AD011菌體暴露外表面蛋白數(shù)目為193個，包括11個細胞壁蛋白、20個脂蛋白、暴露外表面的膜蛋白140個、22個細胞外蛋白。AD011外表面蛋白的功能分析結(jié)果顯示，193個外表面蛋白中，含有較大比例的蛋白沒有功能注釋（78個），115個蛋白具有COG功能注釋。在有功能注釋的蛋白中，所占比例較大的是氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝（16個），無機離子轉(zhuǎn)運與代謝（14個），細胞壁、細胞膜生物合成（13個），碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝（10個），防御機制（10個）等有關(guān)蛋白。[結(jié)論]AD011菌體外表面蛋白與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運，細胞壁、細胞膜生物合成，防御機制有關(guān)。

關(guān)鍵詞動物雙歧桿菌；基因組；外表面蛋白；種類；功能

中圖分類號TS201.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）11-0119-02

Abstract[Objective]Species and function of the outer surface proteins of Bifidobacterium animalis AD011 were analyzed.Analysis of their outer surface proteins will help us to correctly understand its physiological function and molecular mechanisms of interaction with their host. [Method]The genome sequence of B. animalis AD011 was used to study the potentially surface exposed proteins （ PSE proteins ） by Inmembrane. Functional annotation and cluster analysis of predicted surface proteins were performed using COG functional database. [Result]There were 193 surface exposed proteins which include 11 cell wall proteins， 20 lipoproteins， 140 membrane proteins and 22 extracellular proteins. Results of functional analysis showed there were 78 proteins which have not COG functional annotation in 193 surface exposed proteins. Most outer surface proteins were involved in amino acid transport and metabolism（16 proteins）， inorganic ion transport and metabolism（14 proteins），cell wall/membrane formation（13 proteins）， carbohydrate transport and metabolisms（10 proteins）， defense mechanisms（10 proteins）. [Conclusion]The function of outer surface proteins of AD011 were involved in absorption and transport of nutrient， cell wall/membrane biosynthesis and defense mechanisms.

Key wordsBifidobacterium animalis；Genome；Outer surface protein；Species；Function

雙歧桿菌作為一種腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌種，在臨床上，具有調(diào)整腸道菌群等益生作用。動物雙歧桿菌具有較強的耐受環(huán)境脅迫能力，如AD011，它是目前應(yīng)用較多的益生雙歧桿菌菌株之一[1]。雙岐桿菌的外表面蛋白在介導(dǎo)菌體與宿主細胞黏附定殖、與外界環(huán)境相互作用方面起著非常重要的作用[2-3]。2009年該菌株完成了全基因組測序和功能注釋，該菌株1 614個基因，1 518個編碼蛋白[4]。

該菌株基因組測序的完成使利用基因組學(xué)數(shù)據(jù)進行功能基因組學(xué)的分析得以實施，如菌體外表面蛋白的分析。目前關(guān)于細菌外表面蛋白的基因組分析主要集中在致病菌[5-7]和乳桿菌方面，如Barinov等[8]采用SurfG+的方法對革蘭氏陽性菌進行了預(yù)測，結(jié)果顯示該方法是一種非常有效的分析革蘭氏陽性菌外表面蛋白的方法。2013年，Perry等[9]提出更為容易和方便的分析方法——Inmembrane。目前關(guān)于雙歧桿菌暴露外表面蛋白的基因組預(yù)測和功能分析，國內(nèi)外還少見報道。筆者以動物雙歧桿菌AD011全基因組編碼蛋白序列為研究對象，采用Inmembrane方法分析該菌株暴露的外表面蛋白和功能，為探討益生菌與宿主相互作用的分子機制提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）GenBank公布的動物雙歧桿菌AD011的基因組編碼的蛋白質(zhì)序列，GenBank 的登錄號是NC_011835.1。

1.2方法采用Inmembrane方法[9]，即采用SignalP4.0、LipoP、HMM search 2.0等一系列生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測革蘭氏陽性菌暴露菌體外表面的蛋白。預(yù)測并統(tǒng)計各類外表面蛋白（脂蛋白、細胞壁蛋白、細胞膜蛋白、分泌蛋白），利用COG功能數(shù)據(jù)庫對各類蛋白進行注釋，同時進行COG功能聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1AD011暴露外表面蛋白的種類分析動物雙歧桿菌AD011基因組外表面蛋白的種類分析結(jié)果見表1。分析結(jié)果顯示，動物雙歧桿菌AD011基因組編碼的1 518個蛋白中，暴露于菌體外表面蛋白共計193個，所占基因組蛋白比例為12.6%。在這些蛋白中，定位于細胞膜的蛋白數(shù)目最多，達140個，所占基因組蛋白比例為9.2%，這些跨膜螺旋數(shù)的膜蛋白分布見圖1。

外表面蛋白的膜蛋白中，具有1個跨膜螺旋數(shù)的蛋白最多，達69個，其次是具有2個和5個跨膜螺旋數(shù)的蛋白，分別為19個和12個。

菌體外表面蛋白數(shù)目為193個。從圖2可以看出，在這些蛋白中，含有較大比例的蛋白沒有功能注釋（78個），115

個蛋白具有COG功能注釋。在有功能注釋的蛋白中，所占比例較大的蛋白功能是氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝（16個），無機離子轉(zhuǎn)運與代謝（14個），細胞壁、細胞膜生物合成（13個），碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝（10個），防御機制有關(guān)（10個）等。功能分析結(jié)果表明菌體外表面蛋白與這些功能有關(guān)。

2.2AD011暴露外表面蛋白的功能分析動物雙歧桿菌AD011基因組預(yù)測的外表面蛋白功能分析結(jié)果見圖2。

3討論與結(jié)論

細菌外表面蛋白的數(shù)量和種類與微生物的特性和生長環(huán)境有著密切的聯(lián)系，特別是與宿主之間的相互作用。如根癌土壤桿菌，它是一類普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性菌，圖2動物雙歧桿菌AD011外表面蛋白功能聚類

Fig.2Function clustering of outer surface proteins of B. animalis AD011植物根表面依靠根組織滲透出來的營養(yǎng)物質(zhì)進行生存[10]。再如馬鈴薯晚疫病菌是引起馬鈴薯和西紅柿晚疫病的病原菌，其生存環(huán)境主要是植物體內(nèi)，分析發(fā)現(xiàn)潛在的分泌到細胞外蛋白為671個，占基因組蛋白總數(shù)的3%。越來越多菌株全基因組測序的完成使得采用基因組編碼蛋白序列預(yù)測細菌外表面蛋白成為可能。最早預(yù)測革蘭氏陽性菌外表面蛋白的方法是SurfG+，但該方法里的一些程序在網(wǎng)上不一定能隨時獲得，另外它主要用于預(yù)測革蘭氏陽性菌。Perry等[9]于2013年提出了Inmembrane的分析方法，該方法對SurfG+方法進行了完善和補充，程序很容易網(wǎng)上在線獲取，并且也可以對革蘭氏陰性菌進行預(yù)測分析。

在該研究預(yù)測分析得到的雙歧桿菌AD011的193個外表面蛋白中，78個蛋白沒有功能注釋，這部分蛋白將在以后進行進一步的功能研究和注釋。在有功能注釋的蛋白中，所占比例較大的是營養(yǎng)物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)運，細胞壁、細胞膜生物合成，防御機制有關(guān)的蛋白。功能分析結(jié)果表明菌體外表面蛋白與這些功能有關(guān)。該研究獲得的結(jié)果將對今后研究動物雙歧桿菌AD011與宿主作用的分子機制提供標靶，同時也為益生菌領(lǐng)域的研究發(fā)展及應(yīng)用分析提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] MILANI C，DURANTI S，LUGLI G A，et al.Comparative genomics of Bifidobacterium animalis subsp.lactis reveals a strict monophyletic bifidobacterial taxon[J].Applied and environmental microbiology，2013，79（14）：4304-4315.

[2] LIU C，ZHANG Z Y，DONG K，et al.Adhesion and immunomodulatory effects of Bifidobacterium lactis HN019 on intestinal epithelial cells INT-407[J].World journal of gastroenterology，2010，16（18）：2283-2290.

[3] GILAD O，SVENSSON B，VIBORG A H，et al.The extracellular proteome of Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB12 reveals proteins with putative roles in probiotic effects[J].Proteomics，2011，11（12）：2503-2514.

[4] LEE J H，O'SULLIVAN D J.Genomic insights into bifidobacteria[J].Microbiology and molecular biology reviews，2010，74（3）：378-416.

[5] 趙文杰，曾嘉，柳建設(shè)，等.嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因組分泌蛋白的初步分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2008，8（1）：22-26.

[6] 周曉罡，侯思名，陳鐸文，等.馬鈴薯晚疫病菌全基因組分泌蛋白的初步分析[J].遺傳，2011，33（7）：785-793.

[7] 周曉罡，李成云，趙之偉，等.粗糙脈孢菌基因組分泌蛋白的初步分析 [J].遺傳，2006，28（2）：200-207.

[8] BARINOV A，LOUX V，HAMMANI A，et al.Prediction of surface exposed proteins in Streptococcus pyogenes，with a potential application to other Grampositive bacteria[J].Proteomics，2009，9（1）：61-73.

[9] PERRY A J，HO B K.Inmembrane，a bioinformatic workflow for annotation of bacterial cellsurface proteomes[J].Source code for biology and medicine，2013，8（1）：9.

[10] 范成明，李成云，趙明富，等.根癌土壤桿菌C58 Cereon中分泌蛋白信號肽分析[J].微生物學(xué)報，2005，45（4）：561-566.