張世超 王英哲 王志鋒 金艷 陳晶晶 徐博

摘要闡述了紫花苜蓿雄性不育性的概況、紫花苜蓿的細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子機(jī)理及雄性不育系國(guó)內(nèi)外應(yīng)用研究進(jìn)展，并展望了紫花苜蓿今后的研究趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞紫花苜蓿；雄性不育系；不育機(jī)理

中圖分類(lèi)號(hào)S541+.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）11-0096-03

AbstractWe summarized the overview of alfalfa male sterility，molecular mechanism of cytoplasm male sterility and male sterile lines application research progress at home and abroad briefly，and put forward alfalfa development trend in the future.

Key wordsAlfalfa；Male sterile line；Sterile mechanism

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）最初從伊朗傳入各國(guó)，歷史久遠(yuǎn)，無(wú)論在其他國(guó)家還是我國(guó)，都是被廣泛種植應(yīng)用的優(yōu)良牧草，且是種植面積較大的人工牧草。紫花苜蓿因其產(chǎn)量高、蛋白質(zhì)含量豐富、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、草種品質(zhì)優(yōu)良，被稱(chēng)為“牧草之王”。紫花苜蓿只能異花授粉，自交結(jié)實(shí)率低，需要采用雜交方式來(lái)生產(chǎn)種子。紫花苜蓿有著很強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，但若要在生產(chǎn)中大規(guī)模利用紫花苜蓿的雜種優(yōu)勢(shì)，則需要建立一套高效、安全的授粉控制系統(tǒng)，而雄性不育是紫花苜蓿利用雜種優(yōu)勢(shì)的重要途徑之一。紫花苜蓿的雄性不育也是蝶形花亞科植物花器官分化及發(fā)育的良好材料，倍受各國(guó)學(xué)者的重視[1-3]。目前，我國(guó)對(duì)品質(zhì)優(yōu)秀的豆科牧草需求量逐年增加，利用雄性不育特性獲得雜種優(yōu)勢(shì)是培育優(yōu)質(zhì)苜蓿品種及其雜交制種的最有效方式[4-5]。紫花苜蓿雄性不育系的開(kāi)發(fā)為苜蓿育種做出了重要貢獻(xiàn)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上是一種既經(jīng)濟(jì)又可以提供充足F1代種子的可行方法。

雄性不育的遺傳機(jī)理近幾年引起研究苜蓿的育種專(zhuān)家的廣泛關(guān)注。在對(duì)紫花苜蓿繁殖特性的階段性改良、種子產(chǎn)量的提高和雜種優(yōu)勢(shì)的利用等研究中，紫花苜蓿雄性不育系的獲得及遺傳分析是不可或缺的，是紫花苜蓿雄性不育遺傳機(jī)理研究的前提和基礎(chǔ)。鑒于此，筆者綜述了紫花苜蓿雄性不育性的概況、紫花苜蓿的細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子機(jī)理及雄性不育系國(guó)內(nèi)外應(yīng)用研究進(jìn)展，并展望了紫花苜蓿今后的研究趨勢(shì)，旨在為紫花苜蓿遺傳育種研究提供參考。

1植物雄性不育的研究概況

植物在每一個(gè)階段的進(jìn)化發(fā)展中，都會(huì)有多種多樣的育性變異在發(fā)生，其中包括雄性不育、自交不親和等，人們?cè)谥参锔牧忌先〉玫闹匾M(jìn)展離不開(kāi)對(duì)這些變異的利用。在1763年，雄性不育的現(xiàn)象就被Kolreuter初步觀(guān)察發(fā)現(xiàn)。1876年，Coleman使人們接受“植物雄性不育”的觀(guān)點(diǎn)并開(kāi)始使用[6]。造成植物雄性不育現(xiàn)象的原因是多種多樣的，無(wú)論是環(huán)境的惡劣還是疾病的發(fā)生或者基因的突變都可能成為雄性不育現(xiàn)象形成的因素。因?yàn)槿藗儫o(wú)法準(zhǔn)確找到雄性不育現(xiàn)象發(fā)生的具體原因，從而導(dǎo)致不確定性較多，所以不同的雄性不育材料的表現(xiàn)形式也是多種多樣的。

1.1雄性不育的概念雄性不育是在兩性花中才會(huì)發(fā)生的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為雄器官退化、產(chǎn)生畸形或者功能喪失，影響了其花藥、花粉及雄配子的正常形成與發(fā)育[7]。迄今為止，雄性不育的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用在植物界已經(jīng)非常常見(jiàn)，植物界有43科162屬617種均發(fā)現(xiàn)有雄性不育現(xiàn)象[8]。雄性不育系作為遺傳育種研究應(yīng)用中的主要資源，歸因于其同時(shí)擁有自然條件下的生殖潛質(zhì)和栽培狀況下的育種價(jià)值。在發(fā)現(xiàn)不育系之前，對(duì)于異花授粉和自花授粉作物，人工去雄、化學(xué)殺雄等方法是得到雜交種的常見(jiàn)手段，但這樣的方法生產(chǎn)成本高、勞資投入大，并沒(méi)有被廣泛應(yīng)用。而運(yùn)用不育系做母本所得到的雜交種種子，不僅使授粉和雜交過(guò)程簡(jiǎn)單化，降低了成本，而且提高了雜交種種子產(chǎn)量和制種效率，并使雜交種的產(chǎn)量得到了保證，不育系雜交種制種技術(shù)也因此正式走入人們的視線(xiàn)。對(duì)于花器小和雌雄同花的植物來(lái)講，利用雄性不育系這一雜種優(yōu)勢(shì)是最優(yōu)選擇。目前，隨著育種專(zhuān)家對(duì)植物雄性不育機(jī)理的深入探究，通過(guò)雄性不育系獲得雜交種的方式必將成為雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要方式。

1.2雄性不育的類(lèi)型Sears因雄性不育材料基因型之間的不同表現(xiàn)，將雄性不育分為3類(lèi)，即細(xì)胞質(zhì)不育型、細(xì)胞核不育型和質(zhì)核互作不育型，即“三型學(xué)說(shuō)”[9]。Edwardson將“三型學(xué)說(shuō)”修改為“二型學(xué)說(shuō)”，即核不育型（GMS）和核質(zhì)互作不育型（CMS）2類(lèi)[10]。核質(zhì)互作不育型也被稱(chēng)為細(xì)胞質(zhì)雄性不育。

GMS通常受單基因的調(diào)控，不育基因的轉(zhuǎn)化容易，所以它的優(yōu)點(diǎn)是不育性相對(duì)穩(wěn)定，但由于找不到相應(yīng)的保持系，從而限制了其在生產(chǎn)制種中的應(yīng)用。CMS的不育性是由不育的細(xì)胞質(zhì)基因和相對(duì)應(yīng)的核基因所決定的，比較容易找到保持系并進(jìn)行“三系”配套，在生產(chǎn)應(yīng)用上前景廣闊。CMS在雜交育種上的成功很大程度歸因于其育性恢復(fù)能力，在雜交過(guò)程中，當(dāng)它與攜帶顯性恢復(fù)基因的父本雜交時(shí)，就可恢復(fù)其部分育性。這在雜交育種上是十分重要的，但是大部分雄性不育系，其育性恢復(fù)能力的遺傳結(jié)構(gòu)尚不明確。

2紫花苜蓿的細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子機(jī)理

國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者均普遍認(rèn)為線(xiàn)粒體基因組決定了高等開(kāi)花植物胞質(zhì)雄性不育花粉敗育的特征，并且受到核育性恢復(fù)基因（Rf）抑制或互作[11]。線(xiàn)粒體的功能是依賴(lài)于核基因組和線(xiàn)粒體基因組共同作用的，線(xiàn)粒體基因組的重排、突變以及線(xiàn)粒體基因的剪切、編輯都可能引起細(xì)胞質(zhì)雄性不育[12]。線(xiàn)粒體基因恢復(fù)育性則依賴(lài)于核基因，核基因干擾了與CMS相關(guān)線(xiàn)粒體基因的功能；核基因組中存在CMS育性恢復(fù)基因，顯性抑制CMS的表現(xiàn)[13-16]。

近年來(lái)，序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）、簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間（ISSR）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）等分子標(biāo)記技術(shù)不斷被成功應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位研究。而利用分子標(biāo)記對(duì)植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因及其核恢復(fù)基因的分析和定位方面的研究也較多。Zhou等[17]用SSR分子標(biāo)記將T型恢復(fù)基因定位到1B染色體上。劉保申等[18]采用SSR分子標(biāo)記方法對(duì)其恢復(fù)系的恢復(fù)基因進(jìn)行尋找，對(duì)這個(gè)恢復(fù)基因進(jìn)行染色體定位后發(fā)現(xiàn)與4個(gè)SSR引物擴(kuò)增位點(diǎn)有連鎖關(guān)系，后計(jì)算出它們相應(yīng)的遺傳距離，這個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)K型小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系恢復(fù)基因的標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用有重要意義。Sinha等[19]利用SSR標(biāo)記對(duì)小麥的F2代分離群體進(jìn)行遺傳分析，并確定了Rf8的染色體定位并對(duì)該基因進(jìn)行了精細(xì)定位。劉金兵等[20]利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)甜椒的不育系和保持系進(jìn)行分子標(biāo)記，篩選到了與甜椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因連鎖的分子標(biāo)記。張春寶等[21]利用大豆線(xiàn)粒體DNA開(kāi)發(fā)了細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料的SCAR標(biāo)記，并用于大豆細(xì)胞質(zhì)不育系的篩選和不育系種子純度鑒定，也進(jìn)一步證明了植物中細(xì)胞質(zhì)雄性不育花粉敗育的特征是由線(xiàn)粒體基因組決定的。

關(guān)于紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)基因?qū)ζ溆援a(chǎn)生的影響是如何通過(guò)線(xiàn)粒體-核基因互作達(dá)到的，目前還處于初步研究階段，因此迫切需要根據(jù)已有材料對(duì)紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)基因進(jìn)行定位分析，為紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的精細(xì)定位、克隆和功能分析提供參考，進(jìn)而為了解這一復(fù)雜的分子過(guò)程提供直接或間接的理論依據(jù)。

3紫花苜蓿雄性不育系應(yīng)用的研究現(xiàn)狀

3.1國(guó)外應(yīng)用研究現(xiàn)狀1958年加拿大學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)了紫花苜蓿雄性不育株20DRC[22]，然后找到了相對(duì)應(yīng)的恢復(fù)系和保持系，配制雜種后F1代的飼草產(chǎn)量高出對(duì)照30%以上[23]，美國(guó)、俄羅斯、匈牙利、保加利亞、法國(guó)等國(guó)的學(xué)者也相繼培育出紫花苜蓿雄性不育系植株，并通過(guò)無(wú)數(shù)的雜交試驗(yàn)得到了良好的雜交種[24]。人們對(duì)苜蓿雄性不育系的基礎(chǔ)理論研究是在20世紀(jì)80年代，英國(guó)、俄羅斯等國(guó)學(xué)者比較了苜蓿雄性不育系的不育和可育花粉的基因型[25]，分析了其不育類(lèi)型和機(jī)制[26]。在不育系的繁育研究方面，Tereshchenko等[27]最早發(fā)現(xiàn)了紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的保持系，并組配雜交組合檢驗(yàn)后代育性恢復(fù)狀況，使得不育系種子的大量獲得成為可能。Rosellini等[28]采取了轉(zhuǎn)基因的方式，成功培育出紫花苜蓿雄性不育植株，同時(shí)對(duì)其不育系的細(xì)胞學(xué)機(jī)理和相應(yīng)的遺傳分析兩方面進(jìn)行新的探究 。但由于紫花苜蓿屬于異花授粉植物，不育系無(wú)花粉，不能吸引昆蟲(chóng)傳粉，使得雜種優(yōu)勢(shì)的利用和種子生產(chǎn)上也存在一些問(wèn)題[29]。美國(guó)Dairyland種子公司利用其掌握的紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系，于2001年最早推出了紫花苜蓿雜交種，并陸續(xù)推廣上市了多個(gè)紫花苜蓿雜交種，研究顯示紫花苜蓿雜交種在產(chǎn)量、抗旱性、整齊性等方面都有著非常優(yōu)良的表現(xiàn)[30]。這一成功經(jīng)驗(yàn)表明了利用紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系培育和繁育雜交種的可行性，為我國(guó)紫花苜蓿雜交品種的選育工作指明了方向。但是針對(duì)紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育的理論研究仍然較少，這是由于雜交種的生產(chǎn)涉及到一些商業(yè)秘密，從而限制了對(duì)其更加深入的探索。

3.2國(guó)內(nèi)應(yīng)用研究現(xiàn)狀與國(guó)外相比，我國(guó)對(duì)苜蓿雄性不育系的研究相對(duì)較晚，1978年吳永敷教授從草原一號(hào)雜花苜蓿（Medicago varia Martin.cv.‘Caoyuan No.1）中選育出3個(gè)部分不育株和3個(gè)完全不育株[31]。有學(xué)者于1986年通過(guò)對(duì)細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程的研究，在Ms-4植株和9個(gè)苜蓿品種的測(cè)交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)F1代群體中的雄性不育比例在2%～10%[32]。不育系MS-4植株屬完全不育類(lèi)型，遺傳性狀穩(wěn)定，適合育種生產(chǎn)。隨后，用不育系Ms-4和40個(gè)優(yōu)良苜蓿品種雜交[33]，篩選出的高產(chǎn)組合，和對(duì)照品種相比產(chǎn)量平均增加25.8%[34]。自1998年以后，石鳳翎等[35]開(kāi)始對(duì)苜蓿雄性不育系展開(kāi)了更深入的研究。通過(guò)分析苜蓿雄性不育系及其F1代不同時(shí)期葉子和花朵的同工酶發(fā)現(xiàn)，不育系Ms-4與可育系相比較，無(wú)論是酶帶數(shù)量、酶活性等都存在差異，但由于雜種優(yōu)勢(shì)并不是在任何時(shí)期都能用同工酶檢測(cè)到，所以在某些時(shí)期沒(méi)有出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)酶。學(xué)者們?cè)趯?duì)苜蓿雄性不育系的生殖生物學(xué)、花蕊細(xì)胞形態(tài)學(xué)和花蜜腺解刨學(xué)進(jìn)行研究后[36-37]，為改善不育系花序短小、蜜腺分泌物少等不良生殖性狀，曾運(yùn)用多次回交轉(zhuǎn)育法得到育性分離后的不育株，建立相對(duì)穩(wěn)定的苜蓿雄性不育系，發(fā)現(xiàn)不育植株的幼嫩莖段、葉片、葉柄可以作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，從而找到了保存和繁殖不育系的方法[38]；通過(guò)PARD技術(shù)，獲得了1個(gè)與苜蓿雄性不育系相關(guān)的分子標(biāo)記，探索了苜蓿雄性不育性的分子鑒定方法，篩選到與苜蓿雄性不育性相關(guān)的基因片段，并利用它得到了3個(gè)F1代不育系植株，14個(gè)回交一代不育系植株[39]。

雖然我國(guó)學(xué)者對(duì)紫花苜蓿雄性不育系進(jìn)行了較多研究，但多集中在細(xì)胞核不育機(jī)理方面，這對(duì)紫花苜蓿雜交新品種的選育工作推動(dòng)不大。于洪柱等[40]于2008年在公農(nóng)1、2、3號(hào)紫花苜蓿衛(wèi)星搭載后代中發(fā)現(xiàn)了紫花苜蓿雄性不育材料的新成員（MS-GN），不育特性表現(xiàn)為無(wú)花粉或花粉敗育。目前已獲得穩(wěn)定的紫花苜蓿雄性細(xì)胞質(zhì)不育材料4份，利用測(cè)交、回交方法，初步選育出3份對(duì)細(xì)胞質(zhì)不育性保持穩(wěn)定的保持系育種材料，后代不育率均高于95%，有廣闊的理論研究和應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步對(duì)苜蓿雄性不育系的利用提供了有效的前提條件。

4苜蓿雄性不育系今后的研究趨勢(shì)

紫花苜蓿在產(chǎn)量上取得重要突破的途徑之一就是利用雜種優(yōu)勢(shì)，國(guó)外的研究表明利用紫花苜蓿的細(xì)胞質(zhì)不育系、保持系和恢復(fù)系進(jìn)行“三系”配套，輔以相應(yīng)的制種方法，進(jìn)行商業(yè)制售雜交種是可行的。

盡管目前紫花苜蓿不育系的相關(guān)研究較多，但在紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)不育的研究方面仍存在一些問(wèn)題。在國(guó)際上，相關(guān)研究多集中于不育系多態(tài)性片段分析上，在對(duì)紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)不育的機(jī)理、核質(zhì)互作機(jī)制方面研究不足，而國(guó)內(nèi)由于紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料的缺乏，相關(guān)研究多集中于細(xì)胞核雄性不育機(jī)理方面；缺乏系統(tǒng)的研究紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育的遺傳基礎(chǔ)和遺傳模式，使得進(jìn)一步研究紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)機(jī)制缺乏理論基礎(chǔ)；雖然群體分離分析法的發(fā)展、植物的細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的定位和克隆技術(shù)的進(jìn)步及高質(zhì)量紫花苜蓿的遺傳圖譜的構(gòu)建都為紫花苜蓿的細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的克隆提供了依據(jù)，但缺乏對(duì)于紫花苜蓿核質(zhì)互作不育這一復(fù)雜分子過(guò)程的理論依據(jù)，所以仍需要對(duì)紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的定位、克隆和功能分析等進(jìn)行大量研究。

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