趙祥穎， 趙 晨， 張家祥， 楊麗萍， 劉建軍， 田延軍， 范宜曉

（1.山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013；2.山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東 濟(jì)南 250013）

發(fā)酵法生產(chǎn)DHA過(guò)程中油脂及DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的快速定量測(cè)定

趙祥穎1，2， 趙 晨1，2， 張家祥1，2， 楊麗萍1，2， 劉建軍1，2， 田延軍1，2， 范宜曉1，2

（1.山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013；2.山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東 濟(jì)南 250013）

針對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)DHA生產(chǎn)過(guò)程實(shí)時(shí)監(jiān)控的需求，建立了一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)菌體細(xì)胞中油脂及DHA含量的方法。主要考察了菌體干燥，菌體細(xì)胞破壁方法、油脂抽提溶劑、油脂甲酯化方法以及內(nèi)標(biāo)選擇等對(duì)菌體內(nèi)油脂及DHA含量測(cè)定的影響等，確定了以濕菌體為分析樣本，采用酸熱法細(xì)胞破壁、正己烷抽提油脂、十九烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)、堿催化甲酯化測(cè)定發(fā)酵液中油脂及DHA含量方法，整個(gè)分析過(guò)程可在1~2 h內(nèi)完成，特別適合DHA發(fā)酵過(guò)程的中間分析化驗(yàn)。

DHA；油脂分析；發(fā)酵控制；海洋真菌

二十二碳六烯酸 （Docosahexaenoic acid，簡(jiǎn)稱DHA）是一種無(wú)毒副作用、食用安全的ω-3型多不飽和脂肪酸[1-3]。目前，DHA產(chǎn)品主要來(lái)源于深海魚油，但產(chǎn)品質(zhì)量會(huì)隨魚種類、捕撈季節(jié)、地點(diǎn)的差異而不同，且易受環(huán)境污染。研究表明魚類體內(nèi)的DHA成分是通過(guò)食物鏈蓄積獲得，主要來(lái)源于海洋微生物[4-5]。以微生物發(fā)酵法制備DHA，具有生長(zhǎng)周期短，易于大規(guī)模培養(yǎng)[6]，不飽和脂肪酸成分單一，分離純化簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，有望替代魚油成為DHA主要來(lái)源。胞內(nèi)油脂含量及DHA占總油脂的比例是利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA過(guò)程控制的重要技術(shù)參數(shù)和指標(biāo)，快速、準(zhǔn)確地測(cè)定DHA對(duì)生產(chǎn)調(diào)控具有重要意義。有關(guān)DHA生產(chǎn)菌種選育及發(fā)酵工藝研究的文獻(xiàn)中所采用的DHA測(cè)定方法基本相同，具體為：離心收集的菌體細(xì)胞，冷凍干燥，凍干菌粉采用超聲波進(jìn)行細(xì)胞破壁，再用溶劑萃取油脂[7-8]進(jìn)行甲酯化，或破壁細(xì)胞直接進(jìn)行甲酯化。甲酯化方法主要有乙酰氯甲醇甲酯化和三氟化硼催化甲酯化，內(nèi)標(biāo)多以奇數(shù)碳游離脂肪酸或脂肪酸甲酯[9]進(jìn)行氣相色譜測(cè)定。上述方法由于菌體細(xì)胞凍干所需時(shí)間較長(zhǎng)，甲酯化步驟較繁瑣，整個(gè)測(cè)定耗時(shí)較長(zhǎng)，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)中間過(guò)程控制對(duì)于發(fā)酵參數(shù)需實(shí)時(shí)反饋的需求。為此，作者將針對(duì)目前海洋真菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的實(shí)際需求，開發(fā)建立一種適用于工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程控制的快速、準(zhǔn)確測(cè)定DHA含量方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

十九烷酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%、十九烷酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%、正己烷為色譜純、甲醇、氫氧化鉀、鹽酸、氯化鈉為分析純。

1.2 菌體細(xì)胞培養(yǎng)、收集、干燥

采用裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA，發(fā)酵結(jié)束后，準(zhǔn)確量取發(fā)酵液5 mL，6 000 r/min離心5 min，棄去上清，菌體用去離子水洗滌2次，收集菌體細(xì)胞直接或凍干后用于油脂含量和DHA比例的測(cè)定。

1.3 細(xì)胞破壁和油脂抽提

1.3.1 研磨破壁和油脂抽提 將收集的5 mL發(fā)酵液濕菌體或凍干菌體，置于研缽中充分研磨，加入10mL正己烷轉(zhuǎn)移至刻度試管中，充分震蕩萃取1 min，靜置分層后，取上層清液1mL于用于甲酯化。1.3.2 酸熱破壁和油脂抽提 將收集的5 mL發(fā)酵液濕菌體或凍干菌體，加入4 moL/L鹽酸溶液4 mL，混勻后沸水浴10min，流水冷卻至室溫冰浴15 min，加入正己烷10 mL，充分震蕩萃取1 min，靜置分層后，取上層清液1mL于用于甲酯化。

1.3.3 超聲破壁和油脂抽提 將收集的5 mL發(fā)酵液濕菌體或凍干菌體，加入蒸餾水4mL，混勻后超聲處理20min，加入10mL正己烷轉(zhuǎn)移至刻度試管中，充分震蕩萃取1min，靜置分層后，取上層清液1 mL于用于甲酯化[10]。

1.4 油脂甲酯化方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液配制 十九烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液：稱取十九烷酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品0.04 g（精確至0.000 1 g），于 10 mL容量瓶中，加入適量正己烷使溶解，然后稀釋至刻度，搖勻備用。

十九烷酸標(biāo)準(zhǔn)液：稱取十九烷酸標(biāo)準(zhǔn)品0.04 g（精確至 0.000 1 g），于10 mL容量瓶中，加入適量正己烷使溶解，然后稀釋至刻度，搖勻備用。

二十二碳六烯甲酯酸標(biāo)準(zhǔn)液：稱取二十二碳六烯甲酯標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g（精確至 0.000 1 g），于 10 mL容量瓶中，加入適量正己烷使溶解，然后稀釋至刻度，搖勻備用。

1.4.2 三氟化硼-甲醇甲酯化 取上述1 mL待測(cè)樣品中加入內(nèi)標(biāo)液1mL、0.5moL/L KOH-甲醇溶液1 mL，混勻后，置65℃水浴15 min，冷卻至室溫，加入三氟化硼乙醚-甲醇溶液（三氟化硼乙醚）與甲醇體積比為3∶7）3mL，65℃水浴5min，冷卻至室溫，加入飽和氯化鈉溶液2mL、正己烷1 mL，充分震蕩，離心分層取上層有機(jī)相用于氣相色譜分析[9]。

1.4.3 KOH-甲醇甲酯化 向1 mL待測(cè)試樣中加入內(nèi)標(biāo)液1 mL、0.5 mol/L KOH-甲醇溶液0.2 mL，劇烈震蕩5 min（或向1 mL待測(cè)試樣中加入內(nèi)標(biāo)液1 mL、4 mol/L KOH-甲醇溶液0.2 mL，劇烈震蕩1min），靜置或離心分層，取上層有機(jī)相用于氣相色譜分析。

1.5 菌體細(xì)胞油脂含量測(cè)定

1.5.1 正己烷萃取法 將收集的5 mL發(fā)酵液濕菌體或凍干菌體，置于研缽中充分研磨，加入10 mL正己烷轉(zhuǎn)移至刻度試管中，充分震蕩萃取1min，1 000 r/min離心，取上層清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中出去有機(jī)溶劑，用精密天平秤重，得到油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.5.2 氯仿甲醇萃取法 將收集的5mL發(fā)酵液濕菌體或凍干菌體，置于研缽中充分研磨，并加入1.5mL蒸餾水，以及5.7 mL氯仿和甲醇體積比為1∶2的混合液，震蕩混勻后，加入1.875mL氯仿，震蕩混勻，后加入1.875 mL蒸餾水，充分混勻，1 000 r/min離心，取上層清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中出去有機(jī)溶劑，用精密天平秤重，得到油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)[7]。

1.6 油脂組成分析測(cè)定

1.6.1 氣相色譜分析 采用安捷倫GC-7890B氣相色譜儀，DB-23（60 mm×0.25 mm×0.25 mm）毛細(xì)管柱用于油脂氣相色譜分析。選用高純氮?dú)庾鳛檩d氣，柱流量3.0 mL/min，尾吹流量30 mL/min，氣化室溫度250℃；檢測(cè)器為FID檢測(cè)器，溫度280℃，氫氣流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min；柱箱初始溫度100℃，之后以25℃/min升至200℃，再以4℃/min升至230℃，保持9 min；進(jìn)樣量為1μL，分流比為30∶1。

1.6.2 DHA及油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算 采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定。式中，Ai為DHA甲酯峰面積；As為內(nèi)標(biāo)峰面積；fis為脂肪酸甲酯i相對(duì)于內(nèi)標(biāo)的相對(duì)校正因子；Mi為脂肪酸i的相對(duì)分子質(zhì)量；M甲酯為脂肪酸i甲酯的相對(duì)分子質(zhì)量；m為待測(cè)試樣質(zhì)量；ms為內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量。

式中，MDHA為DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)；SDHA為DHA占總脂肪酸的比例；fi為相對(duì)校正因子（數(shù)值為1.04）。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌體干燥對(duì)細(xì)胞內(nèi)油脂分析的影響

有關(guān)裂殖壺菌等海洋真菌生產(chǎn)DHA文獻(xiàn)報(bào)道中，細(xì)胞內(nèi)油脂及DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定通常使用冷凍干燥后的菌體，而在工業(yè)生產(chǎn)中，為了對(duì)生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，需要快速獲得檢測(cè)結(jié)果，而將菌體細(xì)胞冷凍干燥所需時(shí)間比較長(zhǎng)，不能滿足中間控制要求，因此本文研究探討直接采用濕菌體進(jìn)行油脂和DHA含量的可行性。

將離心收集的濕菌體和經(jīng)冷凍干燥后的菌體分別進(jìn)行研磨破壁，采用正己烷進(jìn)行油脂抽提和油脂含量測(cè)定，同時(shí)采用三氟化硼-甲醇法對(duì)所提油脂甲酯化進(jìn)行色譜分析，計(jì)算油脂和DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表1。

表1 菌體干燥對(duì)菌體細(xì)胞油脂分析的影響Table 1 Effects of cell freeze-drying on the analysis of lipids and DHA contents

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用濕菌體和凍干菌體測(cè)定的數(shù)據(jù)差別不顯著，說(shuō)明采用濕菌體進(jìn)行油脂及DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析是可行的。另，表中數(shù)據(jù)顯示油脂質(zhì)量濃度的計(jì)算值比實(shí)測(cè)值差別明顯，這是因?yàn)樵谟椭治鲞^(guò)程中，油脂中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低或未被甲酯化的成分出峰峰面積小或沒(méi)有出峰，計(jì)算過(guò)程中這些成分就不會(huì)計(jì)算在內(nèi)，造成計(jì)算值比實(shí)測(cè)值偏低。這種誤差屬于系統(tǒng)誤差，對(duì)于發(fā)酵過(guò)程數(shù)據(jù)的監(jiān)測(cè)、比對(duì)影響不大。

2.2 抽提溶劑對(duì)破壁細(xì)胞油脂抽提的影響

一是培養(yǎng)員工愛崗敬業(yè)精神。工作中要思想統(tǒng)一，為了共同的工作目標(biāo)能互不拆臺(tái)、互相補(bǔ)臺(tái)，人人都以工作為重。

魚肉等動(dòng)物組織中脂肪酸的抽提及含量測(cè)定比較經(jīng)典的方法是Bligh-Dyer法[7]，該方法是以氯仿-甲醇為萃取劑萃取樣品中的脂肪和脂肪酸，對(duì)游離脂肪酸和極性油脂等有較好的抽提效果，油脂提取率比較高。正己烷也是油脂測(cè)定中最常用的萃取溶劑，其毒性小，易分離。比較了氯仿-甲醇和正己烷兩種萃取劑對(duì)濕菌體破壁細(xì)胞油脂的抽提效果，DHA含量用三氟化硼-甲醇甲酯化測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 抽提溶劑對(duì)破壁菌體油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)及DHA比例分析的影響Table 2 Effects of extraction agent on the analysis of lipids and DHA contents

由表2可見，兩種萃取劑對(duì)裂殖壺菌破壁細(xì)胞油脂含量測(cè)定結(jié)果差別不明顯。兩種萃取劑抽提的油脂氣相分析表明其油脂組成也基本一致，說(shuō)明菌體細(xì)胞中游離脂肪酸和極性脂肪酸含量較低，采用正己烷萃取完全可以滿足細(xì)胞油脂分析測(cè)定要求。

2.3 細(xì)胞破壁方法的選擇

利用裂殖壺菌等海洋真菌生產(chǎn)DHA，油脂存在于細(xì)胞內(nèi)，必須對(duì)菌體破壁后才能進(jìn)行油脂抽提。菌體破壁常用的方法主要有超聲波破壁和研磨破壁，超聲破壁過(guò)程會(huì)產(chǎn)生機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)，尤其是熱效應(yīng)會(huì)使體系溫度升高，加之超聲破壁所需時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)對(duì)油脂中的DHA造成一定的破壞。機(jī)械研磨也是油脂測(cè)定常用的方法，一般使用研缽或玻璃研磨器，因?yàn)榉椒ㄏ拗?，過(guò)程不易標(biāo)準(zhǔn)化，會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。在微生物油脂的研究中，通常采用酸熱法[10-11]裂解細(xì)胞壁，然后抽提油脂測(cè)定其油脂含量和組成。作者考察了上述3種細(xì)胞破壁方法對(duì)發(fā)酵進(jìn)程中裂殖壺菌濕菌體內(nèi)油脂和DHA測(cè)定的影響，結(jié)果見表3。

表3 破壁方法對(duì)菌體細(xì)胞油脂及DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析的影響Table 3 Effects of cell wall-breaking technologies on the analysis of lipid and DNA contents

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，超聲破壁所測(cè)數(shù)據(jù)明顯偏低，酸熱破壁與研磨破壁結(jié)果相似。經(jīng)對(duì)破壁效果觀察發(fā)現(xiàn)，超聲破壁所測(cè)油脂含量低主要是因?yàn)槌暺票诓煌耆M(jìn)一步延長(zhǎng)破壁時(shí)間可以提高油脂實(shí)測(cè)值，但延長(zhǎng)時(shí)間也會(huì)造成油脂中DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。研磨破壁由于研缽粗糙度、研磨力度較難量化，測(cè)定數(shù)據(jù)平行性較差；酸熱破壁過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化程度高數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好，過(guò)程簡(jiǎn)單時(shí)間短，是過(guò)程控制理想的選擇。

不同菌種的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組成不同，導(dǎo)致破壁難易程度差異。作者又考察了酸熱法處理時(shí)間對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵濕菌體油脂和DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定的影響，結(jié)果（表4）顯示，酸解時(shí)間10min即可達(dá)到理想的破壁效果，油脂釋放完全。

表4 酸熱法處理時(shí)間對(duì)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)及DHA比例分析的影響Table 4 Effects of the duration of acid-heating methods on the analysis of lipids and DHA contents

脂肪酸測(cè)定通常采用甲酯化方法將脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅峒柞?，再通過(guò)氣相色譜儀進(jìn)行定性定量分析。脂肪酸甲酯化方法有酸催化法和堿催化法[12]，其中酸催化又包括鹽酸催化、硫酸催化、三氟化硼催化等，堿催化有氫氧化鉀-甲醇和氫氧化鈉-甲醇等方法。酸法催化法步驟繁瑣，反應(yīng)溫度高、時(shí)間長(zhǎng)，但酸催化對(duì)游離脂肪酸催化效果好，堿催化可以在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間短，但其主要催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，對(duì)游離脂肪酸酯化效果差。作者選擇十九烷酸和十九烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，比較了三氟化硼催化和氫氧化鉀-甲醇催化甲酯化對(duì)發(fā)酵濕菌體中油脂和DHA含量測(cè)定的影響。

表5 甲酯化方法對(duì)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)及DHA比例分析的影響Table 5 Effects of methyl esterification methods on the analysis of lipids and DHA contents

分析結(jié)果（表5）顯示，以十九烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，兩種甲酯化方法樣品的測(cè)定結(jié)果基本一致，而以十九烷酸為內(nèi)標(biāo)，堿催化甲酯化色譜圖內(nèi)標(biāo)物沒(méi)有檢出，說(shuō)明堿催化不能使十九烷酸甲酯化，不能選用游離脂肪酸作為內(nèi)標(biāo)物。比較兩種甲酯化方法的分析結(jié)果，油脂中DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒(méi)有明顯的區(qū)別，說(shuō)明兩種甲酯化方法都適合發(fā)酵濕菌體油脂和DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定。但三氟化硼催化甲酯化方法，步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)，且三氟化硼為劇毒緩化合物，操作危險(xiǎn)性較大；相反堿催化可在室溫下進(jìn)行，僅需一步反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間短，非常適合發(fā)酵過(guò)程中間化驗(yàn)。裂殖壺菌發(fā)酵油脂分析選擇十九烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物，可以很好的適應(yīng)堿催化甲酯化方法，且平行性較高，同時(shí)相對(duì)于國(guó)標(biāo)中采用的內(nèi)標(biāo)十三烷酸甘油三酯價(jià)格低廉，易于采購(gòu)，適用于規(guī)模發(fā)酵過(guò)程中的數(shù)據(jù)分析。

2.5 堿催化甲酯化條件的優(yōu)化

選用的堿催化甲酯化方法，操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)時(shí)間短，國(guó)標(biāo)GB 26400-2011和GB 28404-2012均采用此法，但兩標(biāo)準(zhǔn)中采用堿的濃度和反應(yīng)時(shí)間各不相同，比較了這兩種甲酯化條件對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵濕菌體油脂分析結(jié)果影響。分析結(jié)果表明兩種國(guó)標(biāo)方法測(cè)定的油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)及DHA比例的結(jié)果基本一致，說(shuō)明此兩種方法均可適用于裂殖壺菌指標(biāo)的測(cè)定。為縮短分析時(shí)間，選擇甲酯化時(shí)間相對(duì)較短的方法。

3 結(jié)語(yǔ)

針對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA生產(chǎn)過(guò)程監(jiān)控需要，建立了一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的用于發(fā)酵液中油脂和DHA含量的測(cè)定方法。具體為：取發(fā)酵液5~ 10mL，離心收集菌體，洗滌2次，棄去上清，然后加入4moL/L鹽酸溶液4mL，混勻后沸水浴10min，冷水冷卻至室溫，冰浴10 min，加入正己烷10mL，充分震蕩1 min，靜置分層后，取上層清液1 mL，加入內(nèi)標(biāo)液1 mL，4 moL/L KOH-甲醇溶液0.2 mL，劇烈震蕩1 min，離心分層，取上層有機(jī)相用于氣相色譜分析，然后根據(jù)內(nèi)標(biāo)計(jì)算油脂和DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

作者結(jié)合現(xiàn)有的脂肪酸分析方法和微生物菌體油脂測(cè)定方法，研究確定了一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定菌體細(xì)胞中的油脂和DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析方法，整個(gè)分析過(guò)程可在1~2 h完成，方便了對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的優(yōu)化控制，特別適合DHA發(fā)酵過(guò)程的中間分析化驗(yàn)。

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Fast Quantitative Analysis of Lipids and DHA Contents During Fermentation Process for DHA Production

ZHAO Xiangying1，2， ZHAO Chen1，2， ZHANG Jiaxiang1，2， YANG Liping1，2，LIU Jianjun1，2， TIAN Yanjun1，2， FAN Yixiao1，2
（1.Shandong Provincial Key Laboratory of Food and Fermentation Engineering，Jinan 250013，China；2.Shandong Food Ferment Industry Research&Design Institute，Jinan 250013，China）

A simple，fast and accurate method was established to determ ine the composition and contents of lipids and docosa-hexaenoic acid （DHA）during fermentation process for DHA production.The detection for lipids and DHA contents in Schizochytrium was optim ized by drying methods，cell disruptionmethods，theways of lipid extraction，themethods ofmethyl esterification and the selection of internal standards.The optimal analysis used an acid-heating method for cell disruption，n-hexane for lipid extraction，nonadecanoic acidmethylester as the internal standard and methyl esterification catalyzed by alkali catalyst.It was particularly suitable for the intermediate analysisduring fermentationprocessforDNAproductionwhichcouldbeaccomplishedw ithin1-2hours. Keywords：DHA，lipidsanalysis，fermentation control，marine fungi

TS 222

A

1673—1689（2017）04—0405—05

2015-05-29

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2014GSF121038）。

趙祥穎（1968—），女，江蘇沛縣人，理學(xué)碩士，研究員，主要從事工業(yè)微生物研究。E-mail：xyzhao68@126.com

趙祥穎，趙晨，張家祥，等.發(fā)酵法生產(chǎn)DHA過(guò)程中油脂及DHA含量的快速定量測(cè)定[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（04）：405-409.