秦艷杰，王文文，王艷楓，李霞

（1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源與生境修復(fù)重點實驗室，遼寧大連116023；2.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023）

仿刺參體壁再生過程中兩個核糖體蛋白基因的表達差異

秦艷杰1，2，王文文1，王艷楓2，李霞1，2

（1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源與生境修復(fù)重點實驗室，遼寧大連116023；2.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023）

本研究首次從仿刺參（Apostichopus japonicus）體壁中克隆得到核糖體蛋白L30（ribosomal protein L30，RPL30）的cDNA全長序列（GenBank：JQ770165），該序列包括56 bp的5′-UTR，162 bp的3′-UTR和339b p的開放閱讀框，共編碼112個氨基酸；Blast比對分析結(jié)果顯示該序列的核苷酸序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列與其他物種的同源性均在75%以上；RPL30基因在仿刺參各組織中均有表達，其中腸、體腔細胞、縱肌、體壁中表達量分別為呼吸樹的7.24倍（P<0.01）、4.47倍（P<0.01）、3.12倍（P<0.05）、1.35倍（P>0.05）；仿刺參體壁再生不同階段核糖體蛋白基因RPL30和RPL17的表達存在差異，體壁再生第7 d時RPL30基因的表達出現(xiàn)峰值，為對照組的2.13倍（P>0.05），其余天數(shù)的相對表達量均低于對照組，其中第1、5、6d的表達量與對照組差異均顯著（P<0.05）；RPL17基因在再生第2、5d分別出現(xiàn)峰值，分別為對照組的7.47倍和5.60倍（P< 0.05），其余各天的表達量與對照組差異不顯著（P>0.05）。研究結(jié)果表明核糖體蛋白基因除構(gòu)成核糖體參與蛋白質(zhì)合成外，還有著各自的核糖體外功能。本研究結(jié)果將為進一步研究仿刺參蛋白質(zhì)合成、再生及多種生理活動的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

仿刺參；核糖體蛋白L30；基因克??；核糖體蛋白L17；再生

仿刺參又稱刺參，屬棘皮動物門（Echinodermata），海參綱（Holothuroidea），楯手目（Aspidochirotida），刺參科（Stichopodidae），是我國北方沿海重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟種類，其營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值均較高（姜健等，2004；趙鵬等，2013）。除此之外，仿刺參較強的再生能力也是眾多學(xué)者關(guān)注的熱點（聶竹蘭等，2006），國內(nèi)外學(xué)者對其再生的組織學(xué)和細胞學(xué)過程進行了大量研究（聶竹蘭等，2006；Garcia-arraras et al，2001；李霞等，2007），成果顯著，而對再生的分子生物學(xué)研究相對較少，主要集中在對再生相關(guān)基因的挖掘上（Santiago et al，2000；Zheng et al，2006；陳秋實等，2008；秦艷杰等，2013；趙祥吉等，2013）。

一般認為核糖體蛋白主要負責(zé)組成核糖體，參與蛋白質(zhì)的合成。近年來也有研究表面核糖體蛋白還參與細胞的分裂、增殖、分化、凋亡、發(fā)育調(diào)控等過程（侯怡鈴等，2010；Vilardell et al，2010）。真核生物約有80種核糖體蛋白，分別組成核糖體的大亞基（RPL）和小亞基（RPS）。核糖體蛋白L17（ribosomal protein L17，RPL17）和L30（ribosomal protein L30，RPL30）都是大亞基的組成部分，位于細胞質(zhì)中。RPL17和核糖體蛋白L22家族，是核糖體蛋白大亞家族的核心成員。RPL30屬于核糖體蛋白L30e家族成員，是實現(xiàn)核糖體的裝配以及保證核糖體功能作用發(fā)揮的關(guān)鍵成分，它不僅能獨立地與RNA相互作用，又能與自身的前體mRNA 5′端前導(dǎo)序列結(jié)合調(diào)節(jié)其蛋白質(zhì)的合成（王艷楓等，2013）。GenBank數(shù)據(jù)庫顯示很多水產(chǎn)動物中已克隆出該基因，但尚未見仿刺參RPL30基因的報道。關(guān)于RPL30、RPL17基因功能的研究報道較少，有學(xué)者利用消減差異技術(shù)發(fā)現(xiàn)RPL30基因在肝癌組織中過表達（Kondoh et al，2001），并認為生長相關(guān)蛋白GABP可能是RPL30基因的正調(diào)節(jié)物（Lü et al，2007）。本研究以前期仿刺參體壁再生差減文庫構(gòu)建過程中篩選到的一個高表達的EST序列（秦艷杰等，2013）為中間序列，采用SMART-RACE法，克隆獲得仿刺參的RPL30基因的全長cDNA序列，并利用Real-time PCR技術(shù)檢測了RPL30基因在仿刺參各組織中的表達差異，分析了RPL30和RPL17兩個核糖體基因在仿刺參再生過程中的表達模式。旨在為進一步研究核糖體蛋白基因在仿刺參組織發(fā)育、再生修復(fù)及其他生理活動中的調(diào)控機制提供資料。

1 材料與方法

1.1實驗材料

試驗用刺參取自旅順龍王塘海區(qū)，為1-2齡個體，麻醉狀態(tài)下體長為10～14 cm。室溫暫養(yǎng)于大連海洋大學(xué)重點開放實驗室，每天半量換水1次，投喂人工配制餌料。

不同組織的取材：隨機挑選5頭生長狀況良好的刺參，分別采集它們的體壁、腸、呼吸樹、縱肌、體腔細胞（體腔液3 000 rpm/min離心5 min后收集體腔細胞），每種組織混合于1個凍存管中，液氮保存。再生不同階段的取材：取正常健康的刺參45頭，冰上麻醉15~30 min，于其背部無脊處切取體壁組織約100 μg，形成人工創(chuàng)傷，創(chuàng)傷后正常飼養(yǎng)。實驗組：分別取創(chuàng)傷后1~8 d再生出的體壁組織，每個時間段各取3頭刺參；對照組：正常即無創(chuàng)傷的體壁組織。將取得的體壁組織置于凍存管迅速投入液氮中保存。

1.2總RNA提取及純化

將液氮凍存的正常仿刺參各組織及再生不同階段的體壁組織，采用TRIZOL一步法分別提取總RNA，獲得的總RNA經(jīng)RNase-Free DNase和RNasin Plus RNase Inhibitor處理，再經(jīng)酚氯仿抽提、糖原和醋酸鉀溶液沉淀、乙醇洗滌、0.1% DEPC處理水定容獲得純化的RNA，-80℃保存?zhèn)溆?。?.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，以28S和18S組分的比率為參考，判斷RNA樣品的降解程度；核酸蛋白檢測儀檢測總RNA的濃度和純度。

1.3引物設(shè)計

利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計RPL30基因RACE引物：L303S、L305A1、L305A2和Realtime PCR特異性引物：L30F和L30R，內(nèi)參引物為Cytb F和Cytb R。實驗中所用到引物均由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 實驗用引物序列

1.4 RPL30的cDNA序列克隆

1.4.1 中間序列的獲得

本實驗室先期構(gòu)建了仿刺參體壁再生消減cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)一段長為253bp的EST序列與核糖體蛋白基因RPL30具有較高同源性。以此序列為中間序列設(shè)計引物進行cDNA全長克隆。

1.4.2 3′RACE擴增

3′RACE采用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech，美國）試劑盒進行。3′RACE擴增體系（25μL）：ddH2O，13.5μL；10×PCRBuffer，2.5 μL；dNTP，2.0 μL；Mg2+，2.0 μL；3'RACEReady cDNA，1.25 μL；UPM，2.5 μL；L303S，1.0 μL；rTaq酶，0.25μL。3′RACE擴增程序：94℃，5 min；94℃，30 s；60℃，30 s；72℃，2 min；共35個循環(huán)，72℃，10 min。

1.4.3 5′RACE擴增

5′RACE擴增也采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，美國）試劑盒進行。5′RACE1stPCR反應(yīng)體系（25μL）：滅菌水，13.75 μL；10×PCRBuffer，2.5μL；dNTP，2.0μL；Mg2+，2.0μL；5'RACE–Ready cDNA，1.0 μL；UPM，2.5 μL；L305A1，1.0 μL；rTaq酶，0.25 μL。5′RACE 1st PCR反應(yīng)程序：94℃，5 min；94℃，30 s，72℃，2 min，5個循環(huán)；94℃，30 s，68℃，30 s，72℃，2 min，5個循環(huán)；94℃，30 s，66℃，30 s，72℃，2 min，5個循環(huán)；94℃，30 s，64℃，30 s，72℃，2 min，5個循環(huán)；94℃，30 s，62℃，30 s，72℃，2 min，25個循環(huán)；72℃，10 min。

5′RACE 2nd PCR反應(yīng)體系（25 μL）：ddH2O，13.75 μL；10×PCR Buffer，2.5 μL；dNTP，2.0 μL；Mg2+，2.0 μL；模板（稀釋100倍的1st PCR產(chǎn)物），1.0 μL；NUP，2.5 μL；L305A2，1.0 μL；rTaq酶，0.25μL。5′RACE2ndPCR反應(yīng)程序：94℃，5 min；94℃，30 s；60℃，30 s；72℃，2 min；共35個循環(huán)，72℃，10 min。

1.4.4 PCR產(chǎn)物的克隆測序

分別取5 ul 3′RACE/5′RACE PCR最終產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將獲得的PCR產(chǎn)物回收并與PMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)細胞進行藍白斑篩選，菌落PCR檢測獲得的陽性克隆送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.5生物信息學(xué)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用BLAST程序?qū)@得的仿刺參RPL30序列與其他物種進行同源性比對和相似性搜索；ORF Finder軟件確定正確的開放閱讀框，并翻譯成氨基酸序列；使用Expasy網(wǎng)站中的Proparam功能（http：//web.expasy.org/protparam/）進行氨基酸序列分析；運用SOPMA在線工具（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）進行二級結(jié)構(gòu)分析；用Predict Protein在線工具（https：//www.predictprotein.org/）進行蛋白功能位點預(yù)測；利用Expasy網(wǎng)站中ProtScale在線工具（http：//web.expasy.org/protscale/）進行親水性/疏水性分析；利用ClustalX2.0軟件和MEGA4.0軟件采用鄰位相連法（Neighbor-Joining,NJ）在Bootstrap置信值為1 000的條件下構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6 Real-timePCR定量分析

1.6.1 cDNA序列的合成

分別取10 μL仿刺參體壁、腸、呼吸樹、縱肌、體腔細胞5種組織及體壁再生8個時間段的總RNA，按照反應(yīng)體系：PCR Bμffer（5×）4μL，隨機引物2μL，RT Enzyme 1μL，總RNA 10μL，滅菌水3μL，反應(yīng)程序：42℃60 min，85℃10 min，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.6.2 Real-time PCR反應(yīng)

根據(jù)已獲得的RPL30全長序列和已報道的RPL17全長序列（GenBank NO：JQ922561），設(shè)計合成Real-time PCR特異性引物L(fēng)30F/L30R和L17F/L17R（表1）和內(nèi)參引物Cytb F/Cytb R（表1）。熒光定量PCR反應(yīng)體系：GreenqPCRMix（2×）10μL，F(xiàn)orward/ReversePrimer（10μM）各0.4μL，ROX0.4μL，cDNA模板1.0 μL，滅菌水定容至20 μL。反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃15 s，60/55℃60 s，40個循環(huán)；之后進行融解曲線繪制，反應(yīng)條件：95℃ 15 s，60℃30 s，95℃15 s。熒光定量反應(yīng)在StepOnePLUS（ABI,USA）PCR儀上進行，每個反應(yīng)重復(fù)3次，2-△△CT法分析目的基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1序列分析

最終獲得長度為557bp的cDNA序列（圖1），已提交到GenBank,登錄號為JQ770165。該序列包括56bp的5′-UTR，162bp的3′-UTR，開放閱讀框339bp，起始密碼子為ATG，編碼氨基酸為甲硫氨酸，終止密碼子為TAG，共編碼112個氨基酸（圖1），預(yù)測該蛋白相對分子質(zhì)量為12.469 5 Kd，等電點為9.57，總平均親水性為-0.326，定位于細胞質(zhì)中（RI=1；Expected Accurcy=56%）。除起始密碼子編碼的甲硫氨酸外的111個氨基酸中，有9個帶負電荷的氨基酸（天冬氨酸D和谷氨酸E），17個帶正電荷的氨基酸（精氨酸R和賴氨酸K），其余氨基酸為非極性、疏水性氨基酸和極性、中性氨基酸。疏水性分析結(jié)果表明該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示37個氨基酸屬于α螺旋，占33.04%，35個氨基酸屬于延伸鏈，占31.25%，17個氨基酸屬于β折疊，占15.18%，23個氨基酸屬于無規(guī)卷曲，占20.54%。α螺旋和延伸鏈這兩類結(jié)構(gòu)元件在RPL30中所占比例較大,而β折疊和無規(guī)則卷曲則散布于整個蛋白質(zhì)中。對核糖體蛋白RPL30的功能位點進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)刺參RPL30共有6種功能位點，包括：蛋白激酶C磷酸化位點（SKK、SGK、TLK、SLR）4個；酪蛋白激酶II磷酸化位點（SEIE）1個；酪氨酸激酶磷酸化位點（RKSEIEYY）1個；N-豆蔻?；稽c（GIKQTL、GTACGK）2個；核糖體蛋白L30e信號1位點（SGKYILGIKQTLKSLRQGKAKLIIL）1個；核糖體蛋白L30e信號2位點（ELGTACGKYFRVCTLCVTDPG）1個。

圖1 仿刺參RPL30 cDNA序列和氨基酸序列分析

2.2同源性比對與系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

將序列在NCBI上進行Blastn比對，發(fā)現(xiàn)該序列與其他生物的RPL30基因相似性在75%以上，其中與紫海膽（Strongylocentrotus Purpuratus，XM_778057）的相似性最高為80%，E值為6e-79；與文昌魚（Branchiostoma belcheri，AF420432）的相似性為79%，E值為6e-66；與黃島長吻蟲（Saccoglossus kowalevskii，XM_002732441）的相似性為78%，E值為1e-67。

Blastx比對分析結(jié)果顯示該序列與其他生物的RPL30相似性在80%以上，其中與紫海膽（S. purpuratus，XP_783150）的相似性最高為88%，E值為7e-67；與沙蠶（Eurythoe complanata， ABW23229）相似性為83%，E值為4e-61；與非洲爪蟾蜍（Xenopus laevis，NP_001080621）的相似性為83%，E值為4e-61；與斑馬魚（Danio rerio，NP_956322）的相似性為81%，E值為3e-59；與家鼠（Mus musculus，AAI00609）的相似性為80%，E值為8e-60。

利用NCBI網(wǎng)站的BlastX功能在GenBank中搜尋和篩選到19個物種（圖2）的RPL30的氨基酸序，應(yīng)用軟件ClustalX2.0、MEGA4.0，采用鄰位相連法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap置信值為1 000。結(jié)果顯示仿刺參與同為棘皮動物的紫海膽聚為一支，親緣關(guān)系最近，尾索動物海鞘、半索動物黃島長吻蟲的聚類順序與仿刺參也較近。脊椎動物單獨聚為一支，其中魚類和哺乳動物分別各自聚為一個分支。

2.3 RPL30基因在仿刺參不同組織中的表達

RPL30基因在仿刺參5種組織中的表達情況如圖3所示，各組織表達量在顯著性水平為0.05時表現(xiàn)為腸>體腔>縱肌>體壁≈呼吸樹，其中腸、體腔細胞中的表達量分別為呼吸樹的7.24、4.47倍，與呼吸樹的差異均極顯著（P<0.01），腸與體腔細胞中的表達量差異極顯著（P<0.01）；縱肌中表達量為呼吸樹的3.12倍，差異顯著（P<0.05）；體壁為呼吸樹的1.35倍，差異不顯著（P>0.05）。

圖3 仿刺參各組織中RPL30基因的相對表達量（以Cytb基因為內(nèi)參，標注不同字母代表差異顯著）

2.4 RPL30基因在刺參體壁再生不同階段的表達

RPL30基因在仿刺參再生不同階段的表達量變化如圖4所示，結(jié)果顯示：仿刺參體壁再生8d過程中RPL30基因的表達量呈現(xiàn)先下降再升高的趨勢，其中僅在第7 d高于對照組，為對照組的2.13倍，差異顯著（P<0.05）；其余天數(shù)的相對表達量均低于對照組，其中第1、5、6 d的表達量分別為對照組的0.32、0.26和0.16倍，差異均顯著（P< 0.05），第2、3、4、8 d的相對表達量為對照組的0.53、0.42、0.54和0.39倍，差異不顯著（P>0.05）。

圖4 仿刺參體壁再生不同時期RPL30基因的相對表達量

2.5 RPL17基因在刺參體壁再生不同階段的表達

正常和創(chuàng)傷后1-8 d的體壁組織中RPL17基因的表達變化情況如圖5，結(jié)果顯示：創(chuàng)傷8 d過程中RPL17基因的表達量在第2和第5 d時顯著高于對照組，分別為對照組的7.47倍（P<0.01）和5.60倍（P<0.05），且第2 d和第5 d的差異不顯著（P>0.05）；其余第1、3、4、6、7、8 d的表達量與對照組之間不存在顯著差異（P>0.05），可見該基因在刺參體壁創(chuàng)傷后第2 d和第5 d分別出現(xiàn)表達高峰。

圖5 刺參體壁再生不同時期RPL17基因的相對表達量（以Cytb為參照）

圖6 臺灣島西南反氣旋渦隨時間演變過程

3 討論

本研究通過SMART-RACE法，首次克隆得到仿刺參核糖體蛋白RPL30基因的全長cDNA序列。對已經(jīng)克隆得到的不同物種的RPL30的基因序列及其編碼的氨基酸序列進行BLAST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從無脊椎動物的軟體動物鮑、環(huán)節(jié)動物沙蠶、棘皮動物海膽、尾索動物海鞘到脊椎動物魚類斑馬魚、兩棲類非洲爪蟾蜍、哺乳動物鼠和人等這樣的進化跨度內(nèi)該核糖體蛋白基因均保持有70%以上的同源性，由此可說明RPL30基因在生物進化中相對保守，這種高度的遺傳穩(wěn)定性對維持相關(guān)的功能具有很重要的作用。另外，對仿刺參、紫海膽、斑馬魚、非洲爪蟾蜍、人的RPL30二級結(jié)構(gòu)進行比較，發(fā)現(xiàn)這些物種二級結(jié)構(gòu)組成元件基本相同，只是每個組成元件所占比例不同；蛋白功能位點分析表明紫海膽和人的RPL30蛋白同樣含有6種功能位點，推測此蛋白功能較為保守。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，以RPL30為分子進化標準得到的物種間親緣關(guān)系與它們在生物學(xué)分類上的關(guān)系是一致的。

本研究中通過Real-time PCR分析了RPL30基因在仿刺參中的表達模式。結(jié)果顯示RPL30基因在仿刺參各組織中都有表達，表明該基因?qū)Ψ麓虆⒔M織生長發(fā)育起到一定的調(diào)控作用。其中，RPL30基因在腸和體腔中的表達量顯著高于其他組織，推測這可能與仿刺參自身的組織結(jié)構(gòu)特征相關(guān)。腸組織是仿刺參主要的消化道，含有消化酶在內(nèi)的多種酶類，需進行大量的物質(zhì)代謝和能量代謝（李霞等，2012），因此該組織的生理活動相對活躍，RPL30基因在腸組織中的表達量也相對較高。仿刺參體腔液中存在多種類型的體腔細胞，體腔細胞的功能類似于脊椎動物的血細胞，除參與物質(zhì)運輸外，也是仿刺參體內(nèi)主要的免疫防線，體腔細胞會通過包裹、吞噬或釋放具有殺菌作用的細胞因子的方式對抗外來物質(zhì)，由于仿刺參缺乏特異性免疫組織和器官，其免疫系統(tǒng)主要是由細胞免疫和體液免疫組成的非特異性免疫系統(tǒng)（王淑嫻等，2012），因此為了隨時抵抗外源細菌的侵蝕以及完成自身的新陳代謝，體腔中該類細胞通常會處于增殖活躍期，因此RPL30基因在體腔細胞中表達量也較高；體壁、呼吸樹、縱肌中兩個基因的表達量相對較低，推測與本研究中所取的仿刺參為健康狀態(tài)良好的成體，未經(jīng)任何生理或人為因素刺激，因此這些組織的結(jié)構(gòu)和功能相對穩(wěn)定有關(guān)（王艷楓等，2013）。

本實驗中RPL30基因在再生8 d時間內(nèi)只有第7 d時基因的表達量才顯著高于對照正常體壁中的表達量，前6 d的表達量均低于正常體壁組織中的表達量。推測是由于仿刺參在手術(shù)創(chuàng)傷前期出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)，手術(shù)創(chuàng)傷后某些致炎因子作用于機體造成細胞的損壞，使細胞顯現(xiàn)變性、壞死，因此前6 d為機體對抗炎癥反應(yīng)的階段，此階段損傷細胞的速度遠大于細胞增殖的速度，表現(xiàn)為基因表達量較正常體壁的表達量出現(xiàn)下降。第7 d，炎癥反應(yīng)得到控制，細胞損壞速度下降，細胞增殖活動顯現(xiàn)出來，因此此時基因的表達出現(xiàn)顯著升高的趨勢。隨后第8 d表達量下降，分析出現(xiàn)下降的原因可能是再生過程是一個細胞分化、增殖、遷移的過程（聶竹蘭等，2006；Garcia-arraras et al.2001；李霞等，2007），再生前期細胞需要大量增殖來啟動組織的再生，積累到一定量后，RPL30基因可能會通過某些信號途徑阻止細胞的增殖活動（Sara et al，2005；朱可可等，2009），細胞活動開始變?yōu)橐赃w移為主，因此再生后期基因的表達量出現(xiàn)下降。

同為組成核糖體大亞基的RPL17基因在仿刺參中已有克隆和組織表達的報道（王艷楓等，2013），本研究中發(fā)現(xiàn)RPL17基因在仿刺參體壁再生過程中的表達趨勢為先上升后下降，再上升再下降，共出現(xiàn)兩個峰值，再生前8 d的表達量較之對照組呈現(xiàn)高表達的趨勢。推測出現(xiàn)第1個峰值是對抗創(chuàng)傷刺激的結(jié)果，手術(shù)創(chuàng)傷初期免疫防御系統(tǒng)被激活，核糖體也必須大量合成以保證細胞增殖的需要，因此創(chuàng)傷后第2 d出現(xiàn)第一個表達量峰值。核糖體的生物合成是一個高度動態(tài)的過程，其合成速率受到外界環(huán)境的影響（Kara et al，2006）。目前已知RAS/蛋白激酶A（Toda et al，1987）、TOR（Michael et al，1999）等一些保守的信號途徑調(diào)節(jié)了核糖體的生物合成速率。核糖體達到一定量時，推測RPL17基因可能會通過降低表達量啟動某些信號途徑，從而阻止核糖體的進一步合成，因此RPL17基因的表達量會出現(xiàn)第1次峰值后的下降。經(jīng)過第1個階段表達量的變化，刺參適應(yīng)了創(chuàng)傷刺激，體壁開始出現(xiàn)再生，RPL17基因又開始大量表達，第5 d時該基因的表達量出現(xiàn)第2個峰值。此后表達量又開始下降，可能是因為細胞增殖積累一定量，細胞活動由增殖變?yōu)殚_始遷移，這與體壁再生的組織學(xué)研究結(jié)果（李霞等，2007；Qin et al，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)RPL17和RPL30在仿刺參體壁再生過程中的表達存在一定差異，推測RPL30基因在仿刺參體壁再生過程中主要參與細胞增殖和蛋白質(zhì)合成，而RPL17在再生階段的作用可能包括免疫反應(yīng)和細胞增殖等多種作用。此結(jié)果也說明兩個核糖體基因在刺參的生理活動中起著不同的作用，這也從側(cè)面證明核糖體蛋白基因除構(gòu)成核糖體參與蛋白質(zhì)合成外，還有著各自的核糖體外功能。徐存栓的研究（徐存栓等，2008）也發(fā)現(xiàn)肝再生的過程中核糖體蛋白基因也出現(xiàn)差異表達；一些特殊的生理狀況如腫瘤中也發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白基因包括RPL30基因差異表達（王輝等，2007；閆揚等，2007），有研究認為核糖體蛋白可能是細胞增生調(diào)節(jié)因子的一個新家族，通過作用于細胞周期的某一點，直接影響腫瘤的發(fā)展（Shriver et al，1998）。因此推斷RPL17、RPL30基因參與了仿刺參的組織生長以及體壁的再生，但是它們是分別還是協(xié)同調(diào)控仿刺參的再生過程還有待進一步研究。

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（本文編輯：袁澤軼）

Expression of two ribosomal protein genes in body wall regeneration in sea cucumber(Apostichopus japonicus)

QIN Yan-jie1,2,WANG Wen-wen1,WANG Yan-feng2,LI Xia1,2
（1.Key Laboratory of MarineBio-resources Restoration and Habitat Reparation of Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China 2.Ministry of Agriculture Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Dalian Ocean University,Dalian116023,China)

cDNA full-length sequence of ribosomal protein L30(RPL30)gene was cloned in the body wall of sea cucumber(Apostichopus japonicus).In this study,the results showed that the cDNA of RPL30(GenBank accession No. JQ770165)length was 557 bp,including the 56 bp of the 5'-UTR and 162 bp of the 3'-UTR.The open reading frame was 339 bp,encoding polypeptides of 112 amino acids.Real-time PCR was performed to analyze the expression profiling of RPL30.The results showed that the relative expression levels of RPL30 in intestine,coelomocytes,longitudinal muscle,and body wall were 7.24(P<0.01),4.47(P<0.01),3.12(P<0.05)and 1.35(P>0.05)fold of those in the respiratory tree. The expression values of RPL30 gene decreased and then rose during body wall regeneration in A.japonicus,and the peak value,2.13(P<0.05)fold of the control group,occurred at 7d regeneration,and the levels of 1d,5d and 6d were significantly lower than those in the control group.The RPL17 expression level showed two peaks at 2d and 5d regeneration were 7.47(P<0.01)and 5.60(P<0.05)fold of those values in the control group,respectively.The different expressionlevels of RPL17 and RPL30 showed that they would play important,but different roles in the immune response,cell proliferation,protein synthesis and some kinds of regulation.These results would be the necessary basis for mechanism study of protein synthesis,regeneration and other physiological regulation in sea cucumber.

sea cucumber(Apostichopus japonicas);ribosomal protein L30;cloning;ribosomal protein L17;regeneration

S917.4

A

1001-6932（2017）02-0174-08

10.11840/j.issn.1001-6392.2017.02.008

2015-12-25；

2016-02-17

國家自然科學(xué)基金（30371099）；遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊（2007T015）；遼寧省教育廳實驗室專項（2008S064）。

秦艷杰（1977-），博士，副教授，主要從事海洋生物學(xué)研究。電子郵箱：qinyanjie@dlou.edu.cn。

李霞，碩士，教授。電子郵箱：qin_tina@163.com。