張亮，石宇杰，高鵬，張淑麗，王中魯，董紅玲，張健

· 論著 ·

基因表達(dá)評分（GES）對非糖尿病人群冠狀動(dòng)脈狹窄程度的預(yù)測價(jià)值

張亮1，石宇杰2，高鵬3，張淑麗3，王中魯2，董紅玲2，張健1

目的 探討和評價(jià)外周血基因表達(dá)評分對非糖尿病人群冠狀動(dòng)脈狹窄程度的預(yù)測價(jià)值。方法 連續(xù)入選2015年11月～2016年4月于陸軍總醫(yī)院心血管病研究所住院的146例非糖尿病可疑胸痛患者，其中男性92例，女性54例。對146例患者行冠狀動(dòng)脈造影檢查，并使用Lepcare檢測方法測定基因表達(dá)評分（分值范圍-30～30分），使用統(tǒng)計(jì)方法驗(yàn)證基因表達(dá)評分作為新的檢測方法評估冠狀動(dòng)脈狹窄程度的可行性，并分析基因表達(dá)評分與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性。結(jié)果 以冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，基因表達(dá)評分閾值設(shè)為6分時(shí)，LepCare評分預(yù)測冠狀動(dòng)脈狹窄程度≥50%的患者的ROC曲線下面積（AUC）為0.869±0.033（95%CI：0.803～0.934，P＜0.01），其靈敏度為91.8%，特異性為70.8%。冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%的患者在-30到-1、-10到10、11到30組中的比例分別為0（0%）、20（43%）、78（88%），且隨基因表達(dá)評分愈高，冠狀動(dòng)脈狹窄程度愈高。結(jié)論 基因表達(dá)評分作為無創(chuàng)性檢查，在預(yù)測非糖尿病人群冠狀動(dòng)脈狹窄程度中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

基因檢測；基因表達(dá)評分；非糖尿病人群；冠心?。活A(yù)測價(jià)值

近年來，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心病，CHD）發(fā)病率顯著上升，冠心病的早期診斷亦成為了重中之重。現(xiàn)有的診斷手段眾多，冠狀動(dòng)脈造影是公認(rèn)的冠心病診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但其是有創(chuàng)性的檢查且花費(fèi)較高，不宜作為初診患者的首選檢查項(xiàng)目。基因表達(dá)評分（LepCare檢測）是基于患者年齡、性別以及通過qRT-PCR的方法熒光定量檢測患者外周血中23個(gè)冠心病基因表達(dá)量的綜合評分，國外研究已經(jīng)證實(shí)基因表達(dá)評分可有效的評估冠狀動(dòng)脈狹窄程度。本研究選擇陸軍總醫(yī)院心血管疾病研究所進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影的非糖尿病的可疑胸痛患者，檢測其外周血基因表達(dá)評分，通過統(tǒng)計(jì)分析探討基因表達(dá)評分在非糖尿病可疑胸痛患者中的診斷價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 研究對象 連續(xù)入選2015年11月～2016年4月于陸軍總醫(yī)院心血管病研究所住院的146例非糖尿病可疑胸痛患者，其中男性92例，女性54例，合并有高血壓77例，合并高脂血癥85例。入選標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2013年ESC穩(wěn)定性冠狀動(dòng)脈疾病治療指南，有臨床癥狀（包括典型心絞痛，胸悶，氣短，心悸，喉嚨發(fā)緊等）或無癥狀的高風(fēng)險(xiǎn)患者及臨床檢查異常，包括心電圖ST-T改變、心臟超聲室壁運(yùn)動(dòng)異常、運(yùn)動(dòng)平板試驗(yàn)陽性、冠狀動(dòng)脈CTA提示冠狀動(dòng)脈異常；且同意接受冠狀動(dòng)脈造影檢查（CAG）及LepCare檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：急診血運(yùn)重建或既往血運(yùn)重建患者；由于自身原因如碘造影劑過敏無法行冠狀動(dòng)脈造影檢查；糖尿病患者；全身性炎癥患者；全身性感染患者；近一年內(nèi)服用類固醇、免疫抑制劑及接受放化療患者。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 統(tǒng)計(jì)患者年齡，性別，基本病史（高血壓，高血脂，穩(wěn)定性心絞痛，不穩(wěn)定性心絞痛），家族史（家族中是否有人患冠心病，與患者關(guān)系等），個(gè)人生活史（吸煙、酗酒），腎小球?yàn)V過率（eGFR），藥物使用等。

1.2.2 外周血基因表達(dá)評分（LepCare檢測）

LepCare檢測通過熒光定量PCR測定22個(gè)冠心病相關(guān)基因的表達(dá)量，與患者年齡性別結(jié)合得到的評分。本臨床試驗(yàn)采用受試者外周血，采血管為Tempus? Blood RNA Tube管，每管至少3 ml，樣本放置冰箱4℃進(jìn)行保存，使用康為世紀(jì)CW0538血液RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提純，后續(xù)進(jìn)一步法QRT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，通過檢測各基因熒光表達(dá)值確定基因表達(dá)水平，由系統(tǒng)將22個(gè)基因進(jìn)行匯總質(zhì)控分析進(jìn)而生成報(bào)告。

1.2.3 冠狀動(dòng)脈造影檢查 所有患者均在本院導(dǎo)管室使用GE血管造影機(jī)，采用Judkins法冠狀動(dòng)脈造影，經(jīng)橈動(dòng)脈、肱動(dòng)脈或股動(dòng)脈途徑選擇性冠狀動(dòng)脈造影（穿刺后經(jīng)穿刺通道給予肝素100U/ Kg），多個(gè)體位投照（左冠狀動(dòng)脈：RAO30° +CRA20°、RAO30°+CRU20°、LAO30° +CRA20°、LAO30°+CRU20°；右冠狀動(dòng)脈：LAO45°、LAO20°+CRA20°），對于直徑1.5 mm以上的病變血管至少采用兩個(gè)垂直體位進(jìn)行觀察，結(jié)果通過同一術(shù)者目測判定狹窄程度，對于多支病變，以狹窄程度最為嚴(yán)重的一支病變血管為準(zhǔn)，造影結(jié)果分為冠狀動(dòng)脈正常，冠狀動(dòng)脈狹窄＜50%，冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示。應(yīng)用ROC曲線（受試者工作特征曲線）評價(jià)LepCare測試評分對于冠狀動(dòng)脈狹窄程度診斷的臨床價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般臨床資料 本研究最終入組146例非糖尿病可疑胸痛患者，年齡31～89（61.8± 12.4）歲，其中男性92例，女性54例，合并有高血壓77例，合并高脂血癥85例（表1）。

2.2 外周血基因表達(dá)評分與冠狀動(dòng)脈狹窄程度關(guān)系 通過統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)制作百分比堆積柱形圖，冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%的患者在-30到-1、-10到10、11到30組中的比例分別為0（0%）、20（43%）、78（88%），且隨基因表達(dá)評分愈高，冠狀動(dòng)脈狹窄程度愈高（圖1）。

2.3 外周血基因表達(dá)評分預(yù)測冠狀動(dòng)脈狹窄程度的診斷價(jià)值 以冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果為依據(jù)，LepCare評分預(yù)測冠狀動(dòng)脈狹窄程度≥50%的患者的ROC曲線下面積（AUC）為（0.869±0.033）（95%CI：0.803～0.934，P＜0.01）（圖2）。當(dāng)LepCare評分選定6分為切點(diǎn)，其靈敏度為91.8%，特異性為70.8%。

表1 研究對象一般臨床資料

圖1 冠狀動(dòng)脈狹窄程度與基因表達(dá)評分分值的關(guān)系

3 討論

圖2 外周血基因表達(dá)評分預(yù)測冠狀動(dòng)脈狹窄程度≥50%的患者的ROC曲線

臨床實(shí)踐中，對于冠心病的診斷通常是根據(jù)臨床癥狀、危險(xiǎn)因素、家族史進(jìn)行綜合評估，指導(dǎo)下一步檢查方案，如心電圖、心臟超聲、平板運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)。如果上述檢查結(jié)果支持冠心病診斷，通常建議行冠狀動(dòng)脈造影或冠狀動(dòng)脈CTA，但有研究[1]表明冠狀動(dòng)脈造影最終證實(shí)超過60%患者狹窄程度未達(dá)到50%，為了更好的鑒別出該類患者，臨床上需要一種有效的，陰性預(yù)測價(jià)值高的無創(chuàng)性檢查。

冠心病主要發(fā)病機(jī)制為冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊的形成及不斷進(jìn)展最終導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈狹窄影響心肌供血。首先低密度脂蛋白（LDL）沉積到血管內(nèi)皮下，激發(fā)局部炎癥反應(yīng)[2]，進(jìn)而釋放炎癥趨化因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞定位，巨噬細(xì)胞吞噬脂滴后形成泡沫細(xì)胞，與T淋巴細(xì)胞、壞死細(xì)胞形成脂質(zhì)池。由于血液循環(huán)，動(dòng)脈粥樣硬化的先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性相關(guān)的循環(huán)血細(xì)胞包括嗜中粒細(xì)胞，NK細(xì)胞，B、T淋巴細(xì)胞特異性表達(dá)相關(guān)的基因間接的表現(xiàn)在外周血中，LepCare檢測通過抽取外周血分析與冠狀動(dòng)脈粥樣進(jìn)程中炎癥反應(yīng)相關(guān)的23個(gè)基因表達(dá)水平，經(jīng)過特定算法得出評分。將23個(gè)基因分為6大類，（Ⅰ）類基因與先天免疫相關(guān)，在中性粒細(xì)胞激活和細(xì)胞凋亡過程中顯示出特異性，其CASP5[3]在脂核進(jìn)展的過程中表達(dá)水平明顯上調(diào)。TLR4表達(dá)的巨噬細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵組件。（Ⅱ）類基因中的（S100A8、S100A12）、CLEC4E分別與慢性炎癥過程中的中性粒細(xì)胞激活、細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。（Ⅲ）類基因中的KLRC4[4]通過激活NK細(xì)胞進(jìn)而減少動(dòng)脈粥樣硬化過程中的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。（Ⅴ）、（Ⅵ）類中基因的功能尚不知曉，有待進(jìn)一步研究。

國外通過兩項(xiàng)大型研究（CATHGEN研究[5]和PREDICT研究[6]）確定了23個(gè)冠心病相關(guān)基因，并設(shè)計(jì)出算法。后序眾多研究[7-9]證實(shí)基因表達(dá)評分在冠心病診斷中具有高靈敏度和高陰性預(yù)測值，可有效評估冠狀動(dòng)脈狹窄程度及鈣化程度。在臨床實(shí)踐應(yīng)用中，國外目前已將基因表達(dá)評分作為排除可疑胸痛患者的一項(xiàng)有效的無創(chuàng)檢查手段，經(jīng)過多中心臨床驗(yàn)證[10,11]，基因表達(dá)評分可以最大程度的避免患者接受過度檢查，并且有效的指導(dǎo)醫(yī)師進(jìn)行臨床診斷。目前與LepCare檢測相同的美國Corus@CAD檢測（分值范圍1-40分）已被納入美國商業(yè)保險(xiǎn)。

本研究中，基因表達(dá)評分閾值設(shè)為6分時(shí)，LepCare評分預(yù)測冠狀動(dòng)脈狹窄程度≥50%的患者的ROC曲線下面積（AUC）為0.869（95%CI：0.803～0.934，P＜0.01），其靈敏度、特異性分別可達(dá)到91.8%和70.8%，兩者間具有良好的相關(guān)性。另外，通過統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈狹窄程度與基因表達(dá)評分并不存在完全相關(guān)，分析可能由于樣本量少或變量因素過多導(dǎo)致，查閱國外相關(guān)研究文獻(xiàn)亦有此類結(jié)論。在分析異常數(shù)據(jù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)2例高齡患者檢測評分雖滿分，但冠狀動(dòng)脈造影無狹窄，推論可能為Glagov現(xiàn)象，國外一項(xiàng)使用IVUS研究冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊的研究[9]中亦闡述了這一現(xiàn)象。

在研究過程中我們亦發(fā)現(xiàn)了一些不足：①總體樣本量和陰性樣本較少，因?yàn)樽鳛橐环N新近引入的檢測方法，僅在單中心開展研究，且研究入組的患者多為高?；颊?，隨著進(jìn)一步樣本量及陰性樣本的擴(kuò)大，試驗(yàn)結(jié)果所設(shè)閾值亦將更趨于準(zhǔn)確。②基因表達(dá)評分與冠狀動(dòng)脈狹窄程度并不完全呈正相關(guān)，在臨床應(yīng)用中不推薦單純參考基因表達(dá)評分。③在納入研究人群時(shí)，研究組將糖尿病人群排除，因?yàn)闄z測所采用的基因及算法僅適用于非糖尿病人群。④對于急慢性炎癥，或服用類固醇、免疫抑制類藥物的患者，由于上述因素可影響基因表達(dá)評分，不建議進(jìn)行此項(xiàng)檢查。最后，基因表達(dá)評分僅反映當(dāng)前的冠狀動(dòng)脈粥樣病變程度，隨著粥樣硬化不斷進(jìn)展，其是否能夠有效預(yù)測遠(yuǎn)期心臟不良事件仍需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，基因表達(dá)評分作為無創(chuàng)性檢查，在非糖尿病人群中預(yù)測冠狀動(dòng)脈狹窄程度中，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，未來臨床中對于可疑胸痛首診患者，可有效的指導(dǎo)臨床醫(yī)師避免進(jìn)行過多的檢查及有創(chuàng)操作。國外研究人群大多數(shù)為白種人，若在臨床推廣應(yīng)用仍需要大樣本的亞洲人群臨床研究來進(jìn)行驗(yàn)證。

[1] Patel MR,Peterson ED,Dai D,et al. Low diagnostic yield of elective coronary angiography[J]. N Engl J Med,2010,362(10):886-95.

[2] Libby P,RidkerPM,MaseriA,et al. Inflammation and atherosclerosis[J]. Circulation,2002,105(9):1135-43.

[3] Martinon F,Tschopp J. Inflammatory caspases and inflammasomes: master switches of inflammation[J]. Cell Death Differ,2007,14(1):10-22.

[4] Braun NA,Covarrubias R,Major AS,et al. Natural killer T cells and atherosclerosis: form and function meet pathogenesis[J]. J Innate Immun,2010,2(4):316-24.

[5] Wang L,Hauser ER,Shah SH,et al. Peakwide mapping on chromosome 3q13 identifies the kalirin gene as a novel candidate gene for coronary artery disease[J]. Am J Hum Gener,2007,80(4):650-63.

[6] Elashoff MR,Wingrove JA,Beineke P,et al. Development of a bloodbased gene expression algorithm for assessment of obstructive coronary artery disease in non-diabetic patients[J]. BMC Medical Genomics,2011,4(2):1-14.

[7] Thomas GS,Voros S,McPherson JA,et al. A blood-based gene expression test for obstructive coronary artery disease tested in symptomatic nondiabetic patients referred for myocardial perfusion imaging : The COMPASS Study[J]. CircCardiovasc Genet, 2013,6(2):154-62.

[8] Szilard Voros,Michael R. Elashoff,James A. Wingrove,et al. A peripheral blood gene expression score is associated with atherosclerotic plaque burden and stenosis by cardiovascular CT-angiography:Results from the PREDICT and COMPASS studies[J]. Atherosclerosis, 2014,233(1):284-90.

[9] Joshi PH,Rinehart S,Vazquez G,et al. A peripheral blood gene expression score is associated with plaque volume and phenotype by intravascular ultrasound with radiofrequency backscatter analysis: results from the ATLANTA study[J]. Cardiovascular Diagnosis and Therapy,2013,3(1):5-14.

[10] Herman L,Froelich J,Kanelos D,et al. Utility of a genomic-based, personalized medicine test in patients presenting with symptoms suggesting coronary artery disease[J]. J Am Board FamMed,2014,27 (2):258-67.

[11] McPherson JA,Davis K,Yau M,et al. The Clinical Utility of Gene Expression Testing on the Diagnostic Evaluation of Patients Presenting to the Cardiologist with symptoms of suspected obstructive coronary artery disease: Results from the IMPACT(Investigation of a Molecular Personalized Coronary Gene Expression Test on Cardiology Practice Pattern ) Trial[J]. CritPathw Cardiol,2013,12(2):37-42.

本文編輯：楊新穎，姚雪莉

Predictive value of gene expression score (GES) on the degree of coronary artery stenosis in non-diabeticpatients

ZHANG Liang*, SHI Yu-jie, GAO Peng, ZHANG Shu-li, WANG Zhong-lu, DONG Hong-ling, ZHANG Jian.*Department of Cardiology, Clinical College of PLA Army General Hospital of Anhui Medical University, Beijing, 100700, China.

ZHANG Jian, E-mail: menciuszhang@sina.com

Objective To explore and evaluate the value of peripheral blood gene expression score in predicting the degree of coronary artery stenosis in nondiabetic patients. Methods The in-hospital patients (n=146, including 92 males and 54 females) were chosen from Nov.2015 to Apr.2016. All patients were given examinations of coronary angiography (CAG) and LepCare to validate gene expression score (GES) feasibility (score range -30 to 30) as a new method to evaluate the degree of coronary stenosis and analyze the correlation between a peripheral GES and coronary artery stenosis degree. Results Based on the results of coronary angiography as the gold standard, and when the GES threshold was set at 6 points, the area under the ROC curve (AUC) in patients with coronary artery stenosis ≥50% predicted by LepCare score was 0.869±0.033 (95%CI: 0.803～0.934, P＜0.01). The sensitivity was 91.8% and the specificity was 70.8%. The proportion of patients with coronary artery stenosis ≥50% was 0 (0%), 20 (43%), 78 (88%) in the range of -30 to -1, -10 to 10, and the higher the gene expression score, the higher the degree of coronary artery stenosis. Conclusions As a noninvasive method, GES has a high clinical value in predicting the degree of coronary artery stenosis in nondiabetic patients.

Genetic testing; Gene expression scores; Non-diabetic population; Coronary heart disease; Predictive value

R541.4

A

1674-4055(2017)03-0314-03

1100700 北京,安徽醫(yī)科大學(xué)陸軍總醫(yī)院臨床學(xué)院心內(nèi)科;2100700 北京,中國人民解放軍陸軍總醫(yī)院心內(nèi)科;3100700北京,北京愛普益醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司

張健,E-mail:menciuszhang@sina.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.03.16