孟青，高海軍

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京，100081）

多因素與大腸桿菌蛋氨酸合成代徑的關(guān)系

孟青，高海軍

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京，100081）

蛋氨酸是人體必需的8種基本氨基酸之一。蛋氨酸生物合成途徑受多因素作用，包括水解酶，維生素B12，硫供應(yīng)平衡的調(diào)控，末端代謝產(chǎn)物對(duì)合成關(guān)鍵基因的阻遏及抑制，阻遏蛋白MetJ和乳酸對(duì)蛋氨酸代謝合成的阻遏及抑制，及蛋氨酸在菌體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)等。本文介紹了與蛋氨酸生物合成相關(guān)的影響因素。

蛋氨酸；生物合成；調(diào)控機(jī)制；硫平衡；轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

蛋氨酸又名甲硫氨酸，是8種必需氨基酸中的唯一含硫氨基酸。它在代謝過(guò)程中能維持機(jī)體氮平衡，促進(jìn)肝內(nèi)脂肪代謝，臨床被用于脂肪肝、慢性肝炎的預(yù)防和治療，還用于砷、苯中毒的輔助治療。蛋氨酸是家禽玉米一豆粕型飼糧中限制性氨基酸[1]，添加適當(dāng)?shù)鞍彼?，能有效改善家禽的免疫狀況、生長(zhǎng)性能、血液生化指標(biāo)狀況及繁殖性能[2,3]。蛋氨酸被推廣了到飼料生產(chǎn)、食品、醫(yī)療、保健等多個(gè)行業(yè)。近年來(lái)，全球市場(chǎng)對(duì)蛋氨酸的需求量不斷增長(zhǎng)。

蛋氨酸的主要生產(chǎn)方法為化學(xué)法：一是海因法，為日本曹達(dá)公司、住友化學(xué)公司、德國(guó)的迪高沙公司采用，產(chǎn)品為固態(tài)DL-氨基酸；另一種是氰醇法，為美國(guó)的NOVUS國(guó)際公司采用，產(chǎn)品為液體蛋氨酸羥基類(lèi)似物（Methionine hydroxyl analogue，MHA）[4]?；瘜W(xué)法生產(chǎn)蛋氨酸經(jīng)濟(jì)指標(biāo)低，排污大。微生物發(fā)酵法已廉價(jià)獲得了許多氨基酸，但蛋氨酸難以大量發(fā)酵合成，故研究微生物發(fā)酵法合成蛋氨酸具有巨大意義[5, 6, 7]。

1 蛋氨酸生物合成的基本途徑

蛋氨酸屬于天冬族氨基酸，它以草酰乙酸或天冬氨酸為原料（如圖1）合成。蛋氨酸的直接合成途徑涉及到的合成酶有MetL、MetA、MetB、MetC、MetE、MetH等，蛋氨酸合成的分支途徑賴氨酸合成途徑涉及的酶包括DapA、DapB、LysA，另一個(gè)分支途徑蘇氨酸合成途徑涉及的酶為T(mén)hrB、ThrC、IlvA、IlvB、IlvC、IlvD、IlvE，蛋氨酸合成的硫底物賴氨酸到胱硫醚涉及的酶為CysE、CysK、CysM。合成的蛋氨酸可經(jīng)蛋氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（MetK）催化生成S-腺苷甲硫氨酸。

圖1 蛋氨酸合成途徑及相關(guān)基因

2 大腸桿菌中影響蛋氨酸合成的因素

2.1 蛋氨酸合成酶的穩(wěn)定性

在大腸桿菌中，蛋氨酸生物合成途徑中發(fā)揮作用的第一個(gè)酶是高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶（MetA)[8]。它不同于大多數(shù)穩(wěn)定的細(xì)菌蛋白，對(duì)許多極端條件（高溫、強(qiáng)氧化、過(guò)酸）都很敏感[9,10]。溫度高于25℃時(shí)，MetA活性降低且蛋白結(jié)構(gòu)趨向展開(kāi)，大腸桿菌出現(xiàn)蛋氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)。溫度超過(guò)44℃時(shí)，MetA發(fā)生完全不可逆的聚集沉淀，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受限[11]。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是由N端殘基決定的（即N端法則）[12]。Dvora Biran以纈氨酸代替MetA的N端殘基脯氨酸后，發(fā)現(xiàn)MetA的穩(wěn)定性并無(wú)改變，證明了MetA的穩(wěn)定性并不遵循N端法則[12]。Mordukhova報(bào)道了MetA蛋白的穩(wěn)定性與它的兩個(gè)殘基——異亮氨酸299和天冬氨酸267有關(guān)，將這兩個(gè)殘基替換以后，MetA穩(wěn)性增加[13]。化學(xué)分子伴侶氧化三甲胺也可增加MetA的穩(wěn)定性并使菌體在較高的溫度下正常生長(zhǎng)[14]。由于MetA極易傾向于聚集狀態(tài)，有學(xué)者建議將其歸納為分子伴侶的第三類(lèi)底物，Mordukhova發(fā)現(xiàn)大腸桿菌突變菌株在去除分子伴侶或是ATP依賴蛋白后，其MetA在37℃（正常生理溫度條件下）出現(xiàn)異常構(gòu)象而影響菌體生長(zhǎng)，在突變菌株的培養(yǎng)基中加入蛋氨酸后，菌株恢復(fù)正常生長(zhǎng)[15]。

2.2 蛋氨酸合成酶的分子的調(diào)控

MetJ是屬于ribbon-helix-helix家族蛋氨酸合成阻遏蛋白。它通過(guò)兩股反向β折疊與DNA的大溝結(jié)合[16]，兩個(gè)外部的α螺旋和與DNA鄰近的蛋白質(zhì)相互作用。MetJ以二聚體的形式識(shí)別并綁定到DNA上一段共有的8bp的DNA回文序列上[17]，這段序列被稱為met-box。MetJ能通過(guò)協(xié)助擴(kuò)散作用迅速找到作用靶位點(diǎn)[18]，而S-腺苷蛋氨酸是蛋氨酸代謝途徑的最終產(chǎn)物，它作為MetJ的輔阻遏物能增強(qiáng)這種識(shí)別作用。S-腺苷蛋氨酸在與MetJ的結(jié)合過(guò)程中，能與DNA的磷酸骨架產(chǎn)生很強(qiáng)的靜電作用，從而使MetJ與DNA的作用增強(qiáng)100倍[19]。受MetJ調(diào)控的基因在自身的調(diào)控序列中一般含有2-5個(gè)連續(xù)的可與MetJ相互作用的met-box[20]。在蛋氨酸合成途徑中，受到MetJ調(diào)控作用的基因有ahpC, ahpF, folE, metA, metB, metC, metE, metF, metI, metK, metL, metN, metQ, metR, yeiB，另外，metJ基因自身也受到MetJ的阻遏作用。

MetR是蛋氨酸合成中的激活調(diào)節(jié)蛋白。Urbanowski1986年提出了MetR作為反式激活因子對(duì)MetE和MetH都具有調(diào)控作用[21]。在大腸桿菌中，metR經(jīng)測(cè)序確定有317個(gè)氨基酸[22]，包含一個(gè)與真核生物DNA結(jié)合蛋白特征相同的亮氨酸拉鏈。Maxon將MetR蛋白中亮氨酸拉鏈區(qū)域的兩個(gè)亮氨酸替換或是把其中一個(gè)用脯氨酸代替時(shí)MetR失去生物活性，并確定了MetR的一個(gè)區(qū)域與同型半胱氨酸共激活metE相關(guān)[23]，在metE和metH轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，需要依靠MetR激活蛋白的作用。MetR在溶解狀態(tài)下是一個(gè)二聚體，綁定DNA到共有序列5’-TGAANNTNNTTCA-3’上[24]。MetR以同型半胱氨酸作為共激活劑，可以使metE表達(dá)提高200倍。而metH的表達(dá)則不需要同型半胱氨酸的共激活作用。

2.3 維生素B12和鋅指在甲基轉(zhuǎn)移過(guò)程的作用

蛋氨酸的生物合成主要涉及兩條途徑，一條途徑形成同型半胱氨酸，另一條則形成甲基供體-N5-甲基四氫葉酸。蛋氨酸合成的最后一步是由N5-甲基四氫葉酸提供一碳單位轉(zhuǎn)移到同型半胱氨酸的甲基轉(zhuǎn)移作用[25]。在大腸桿菌中，存在兩種酶催化此反應(yīng)，一種酶是metH的基因產(chǎn)物，被稱為B12依賴型的甲基轉(zhuǎn)移酶，包含一個(gè)與甲基轉(zhuǎn)移相關(guān)的鈷胺酰胺輔基；另一種酶是metE的基因產(chǎn)物，是一種B12非依賴型的甲基轉(zhuǎn)移酶，它主要是大腸桿菌在脫阻遏條件下表達(dá)[26]。metE基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程非常復(fù)雜，像其他met基因（除metH外)一樣，它也被生長(zhǎng)培養(yǎng)基中高水平的蛋氨酸濃度抑制[27,28,29,]。編碼甲基四氫葉酸的基因metF間接調(diào)控metE，在維生素B12及其派生物存在時(shí)，metE和metF的基因表達(dá)受到抑制。B12抑制metE的原理是損耗了共激活劑同型半胱氨酸而降低了MetR的激活作用。在MetH全酶形成甲基-B12酶時(shí)，甲基四氫葉酸對(duì)于甲基轉(zhuǎn)移到B12是必須的，催化甲基化這一過(guò)程發(fā)生的MetH蛋白對(duì)metE的表達(dá)具有調(diào)控作用[30] 。YagD是鋅指依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶，其催化機(jī)制與MetH相似，它催化S-甲基蛋氨酸或S-腺苷蛋氨酸與同型半胱氨酸合成蛋氨酸，YagD由MetJ-S-腺苷蛋氨酸系統(tǒng)調(diào)控[31]。

2.4 硫平衡

硫元素廣泛存在于蛋白質(zhì)和其他重要的生物分子中，對(duì)生物機(jī)體非常重要。蛋氨酸作為甲基供體s-腺苷甲硫氨酸的前體，是生物體重要的含硫氨基酸。細(xì)菌、真菌和植物可以利用無(wú)機(jī)硫（SO4、H2S等）合成半胱氨酸進(jìn)而合成蛋氨酸[32,33]。從化學(xué)基礎(chǔ)的角度分析，天冬氨酸直接合成蛋氨酸需要消耗1個(gè)ATP和2個(gè)NADPH，再結(jié)合被氧化的無(wú)機(jī)硫，需要另外消耗2個(gè)ATP,一個(gè)GTP和4個(gè)NADPH，由此可見(jiàn)硫底物影響很大。如果減少硫底物同化作用的耗能（如以氣態(tài)甲硫醇或是液態(tài)二甲基-二硫醚代替無(wú)機(jī)硫），極有可能提高蛋氨酸的產(chǎn)量[34]。同化硫的途徑和與之相關(guān)的酶已經(jīng)在大腸桿菌中研究的較為清楚，其中CysZ是大腸桿菌內(nèi)膜蛋白，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)用于合成半胱氨酸的硫酸鹽[35]，在硫酸鹽濃度較低的條件下,菌體尤其依賴cysZ基因。另外，CysZ與半胱氨酸生物合成的中間物亞硫酸鹽的相互作用比它與硫酸鹽的相互作用更為密切，當(dāng)亞硫酸鹽存在時(shí)會(huì)抑制硫酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)，說(shuō)明亞硫酸鹽可通過(guò)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制通過(guò)CysZ調(diào)控硫酸鹽的攝入。硫酸鹽的攝入過(guò)程依靠質(zhì)子梯度[36]。大多數(shù)與硫同化途徑相關(guān)的基因都被轉(zhuǎn)錄因子CysB調(diào)控，在細(xì)胞缺乏半胱氨酸時(shí)，該轉(zhuǎn)錄因子激活調(diào)節(jié)子使細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答[37]。YciW是cysB的調(diào)節(jié)子，近年來(lái)，有研究通過(guò)在大腸桿菌中對(duì)yciW過(guò)表達(dá)，成功的積累了同型半胱氨酸，也表明了yciW與蛋氨酸的生物合成途徑相關(guān)[38]。

2.5 蛋氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)

盡管野生型大腸桿菌能從頭合成蛋氨酸，仍需要額外的蛋氨酸或是蛋氨酸類(lèi)似物來(lái)滿足細(xì)胞生長(zhǎng)。大腸桿菌的蛋氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)與蛋氨酸機(jī)體內(nèi)部與外部的濃度有關(guān)[39]。細(xì)胞內(nèi)部蛋氨酸聚集或是外部濃度偏高會(huì)使蛋氨酸攝取比率降低，相反，蛋氨酸匱乏的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌會(huì)增加對(duì)外部蛋氨酸的運(yùn)輸[39]。研究表明蛋氨酸進(jìn)入大腸桿菌涉及兩種特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-高親和力的MetD轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和低親和力的MetP轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[40]（如圖2），他們都受到細(xì)胞內(nèi)部蛋氨酸濃度的調(diào)控。D-蛋氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)既依賴ATP又對(duì)滲透

圖2[57]蛋氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到大腸桿菌模式圖

壓敏感，對(duì)滲透壓的敏感與周質(zhì)蛋白有關(guān)[41]，這些屬性是典型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的特征。盡管MetD和MetP都能轉(zhuǎn)運(yùn)L-蛋氨酸，但只有MetD能轉(zhuǎn)運(yùn)D-蛋氨酸[57]。MetD包括ATP酶、透性酶YaeE、底物結(jié)合蛋白YaeC，它的表達(dá)受L-蛋氨酸和MetJ的抑制作用。L型蛋氨酸阻遏D型的攝取，而D型對(duì)L型異構(gòu)體的攝取無(wú)影響[42]。根據(jù)Kadner的實(shí)驗(yàn)，MetD對(duì)于兩種蛋氨酸異構(gòu)體擁有不同的基質(zhì)綁定位點(diǎn)。蛋氨酸可在MetD的協(xié)助下，利用濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)（吸收過(guò)程屬于溫度敏感型)，蛋氨酸的濃度梯度及溫度對(duì)蛋氨酸攝取的影響表明蛋氨酸進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的過(guò)程是需能的激活轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。攝取系統(tǒng)均由菌體內(nèi)蛋氨酸水平調(diào)控，不同情況下在親和力上至少相差400倍[40,42]。在大腸桿菌中，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的蛋氨酸以s-腺苷蛋氨酸的形式積累，主動(dòng)運(yùn)輸會(huì)在添加疊氮化物或氟化物時(shí)會(huì)受到抑制[40]。在L-蛋氨酸攝取初始時(shí)期，培養(yǎng)基中加入α-酮基-λ-甲基丁酸、D-蛋氨酸，或蛋氨酸亞砜時(shí)對(duì)L-蛋氨酸的攝入并無(wú)影響，而加入蛋氨酸類(lèi)似物或蛋氨酸合成前體物質(zhì)時(shí)，L-蛋氨酸的攝入量減少[39]。

2.6 蛋氨酸生物合成分支代謝產(chǎn)物的調(diào)控

蛋氨酸生物合成的分支代謝途徑主要終產(chǎn)物是賴氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸。因此，賴氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型、蘇氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型和異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型都可使蛋氨酸合成途徑去阻遏，并使碳流向蛋氨酸，有利于蛋氨酸的過(guò)表達(dá)[43]。天冬氨酸激酶是天冬氨酸族氨基酸合成代謝途徑的第一個(gè)酶，存在三個(gè)不同的天冬氨酸激酶，天冬氨酸激酶Ⅰ(ThrA) 受到蘇氨酸和異亮氨酸的阻遏和抑制作用；天冬氨酸激酶Ⅱ(MetL)受到蛋氨酸的阻遏和抑制作用而天冬氨酸激酶Ⅲ(LysC) 受到賴氨酸的阻遏和抑制作用。另外，高絲氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶（MetA）同時(shí)受到蛋氨酸及S-腺苷蛋氨酸的抑制作用。

2.7 其他分子對(duì)蛋氨酸合成的影響

弱酸能抑制蛋氨酸的合成。幾千年前人們就開(kāi)發(fā)利用了弱酸的防腐作用，其機(jī)理為：未解離的酸能自由穿過(guò)磷脂雙分子層，在胞質(zhì)中釋放質(zhì)子并積累，降低pH[44],從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞對(duì)弱酸的應(yīng)答非常復(fù)雜。Pomposiello等用5 mM的水楊酸鹽處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄受到影響[45]。Han在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)蛋氨酸能解除乙酸對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用[46]。Roe 對(duì)此做了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)在乙酸環(huán)境中生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞體內(nèi)的蛋氨酸生物合成代謝中間產(chǎn)物同型半胱氨酸含量大大增加，說(shuō)明弱酸抑制了此中間產(chǎn)物的下游代謝過(guò)程，進(jìn)而抑制了蛋氨酸合成,中間代謝物堆積造成的毒性及低pH也導(dǎo)致了細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制[47]。

3 蛋氨酸生產(chǎn)中相關(guān)問(wèn)題的研究及展望

自然界中可以在植物或動(dòng)物中存在少量L-蛋氨酸，高水平蛋氨酸在蛋（卵清蛋白，5%）和種子（巴西堅(jiān)果，12%）中存在，動(dòng)物蛋白如昆蟲(chóng)及其幼蟲(chóng)中也含較多蛋氨酸，但通過(guò)加工動(dòng)物殘余物（肉粉、魚(yú)粉、骨粉、羽毛粉）來(lái)獲得蛋氨酸因安全原因（瘋牛病、禽流感）在許多國(guó)家是被嚴(yán)格控制的。1970年科研人員對(duì)利用單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)蛋氨酸進(jìn)行了廣泛的研究，研究的菌體大部分為酵母、藻類(lèi)、甲基營(yíng)養(yǎng)菌等，但是存在如一些污染物產(chǎn)生霉毒素，酵母中蛋氨酸含量不足等問(wèn)題?？紤]到環(huán)境及經(jīng)濟(jì)原因，植物作為研究對(duì)象更加適合。葡萄糖胺也是一種非常有潛能的蛋氨酸發(fā)酵原材料，它是幾丁質(zhì)（地球生最豐富的生物高聚物）的降解物[48]。還有許多出版物及專(zhuān)利嘗試?yán)么x工程改造菌體，優(yōu)化能量和氧化還原平衡、硫供應(yīng)平衡，使用特殊的前體細(xì)胞，增加向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)物或向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)基質(zhì)產(chǎn)物的效率等辦法提高蛋氨酸的產(chǎn)量[49-53]。通過(guò)基因操作技術(shù)來(lái)改造蛋氨酸合成的途徑是一個(gè)非常熱門(mén)的課題，第一次嘗試是在植物中進(jìn)行基因操作以提高種子蛋白中蛋氨酸含量[54]。在80年代中期開(kāi)始對(duì)細(xì)菌和酵母菌實(shí)施改造，同時(shí)也出現(xiàn)了許多針對(duì)在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中蛋氨酸生物合成相關(guān)的綜述[50,55]。Figge持有的許多專(zhuān)利成為法國(guó)邁陀保利克公司改造大腸桿菌發(fā)酵L-蛋氨酸的依據(jù)[52,56]。隨著生物工程代謝研究的深入，有望通過(guò)構(gòu)建蛋氨酸的高產(chǎn)菌株實(shí)現(xiàn)普遍的蛋氨酸發(fā)酵的工業(yè)化。

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考慮到錫石多金屬硫化礦中黃鐵礦含量較高，下面以黃鐵礦與脈石為例分析微波加熱預(yù)處理微波選擇性加熱過(guò)程應(yīng)力的產(chǎn)生機(jī)理，以及如何對(duì)微波助磨產(chǎn)生影響。

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Relationship Between Multifactors and Metabolism of Methionine Synthesis in Escherichia Coli

Meng Qing, Gao Haijun
(School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081)

methionine is one of the eight basic amino acids necessary for human body. Methionine biosynthesis pathway is a ff ected by many factors including hydrolase, vitamin B12, regulation of sulfur supply balance, repression and inhibition of key metabolites by synthetic metabolites, repression and inhibition of methionine metabolism by MetJ and lactate, and methionine transport in bacteria. The factors associated with methionine biosynthesis is des cribed in this paper.

methionine; biosynthesis; regulation mechanism; Sulfur balance; transport mechanism

Q815

A

10. 11967/2017150102

Q815

A DOI：10. 11967/201715010102

孟青，女，理學(xué)碩士，Email：wanyanhaianxian@163.com

高海軍，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，Email：hj_gao@bit.edu.cn