魏春杰 王增冕 李桂蘭 盛寶英 齊志國

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)三科，黑龍江 佳木斯 154002)

阿爾茨海默病模型大鼠海馬組織可塑性變化及其對谷氨酸受體與相關(guān)蛋白的影響

魏春杰 王增冕 李桂蘭 盛寶英 齊志國

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)三科，黑龍江 佳木斯 154002)

目的 探討阿爾茨海默病(AD)大鼠海馬組織可塑性的變化及對谷氨酸受體與相關(guān)蛋白的影響。方法 50只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為AD模型組和對照組，每組25只。AD模型組雙側(cè)海馬注射Aβ1～42，利用水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行入組鼠篩選，建立AD大鼠模型，在基線記錄維持40 min后給予能誘發(fā)長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的高頻刺激，記錄f EPSP，采用經(jīng)典的蔗糖密度梯度離心來提取突觸小體、支架蛋白和CaMKIIα，分析AD模型大鼠海馬組織可塑性變化及對谷氨酸受體與相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果 高頻刺激能誘導(dǎo)LTP持續(xù)數(shù)小時(shí)之久。實(shí)驗(yàn)中通過刺激海馬區(qū)側(cè)支旁通路，在CA1區(qū)輻射層記錄興奮性突出后場電位，結(jié)果顯示：海馬區(qū)組織可塑性變化產(chǎn)生LTP并不依賴于NRB2活性；AD模型組海馬區(qū)內(nèi)谷氨酸受體及相關(guān)蛋白水平含量顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)論 采用水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)艹晒⒋笫驛D模型，且海馬組織可塑性變化對谷氨酸受體與相關(guān)蛋白能產(chǎn)生明顯的影響，海馬學(xué)習(xí)記憶機(jī)制參與成癮和戒斷引起的行為適應(yīng)性變化。

阿爾茨海默病(AD)；大鼠海馬組織；谷氨酸受體

阿爾茨海默病(AD)屬于是一種多因素疾病，涉及多種病理機(jī)制，并形成神經(jīng)細(xì)胞凋亡理論。長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)是一種簡單的高頻刺激興奮性輸入端引起的突出強(qiáng)度的持續(xù)增加，能反映突出可塑性變化中的神經(jīng)電生理活動(dòng)的改變〔1〕。本文擬探討AD模型大鼠海馬組織可塑性的變化及對谷氨酸受體與相關(guān)蛋白的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年5月至2016年5月健康SPF級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量102～200 g，平均(153±15)g，周齡6～10 w，動(dòng)物由醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，實(shí)驗(yàn)過程中對SD大鼠飼養(yǎng)、處理均符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)下意見》〔2〕相關(guān)規(guī)則，許可證號：SCXK 2007-0010。本次臨床診斷試驗(yàn)均經(jīng)醫(yī)院倫理會批準(zhǔn)，大鼠一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。將大鼠隨機(jī)分為AD模型組和對照組，每組25只。

1.2 AD模型鼠的制備 選擇雙側(cè)海馬CA1區(qū)作為注射靶點(diǎn)，一次性注射凝聚態(tài)Aβ1～42制備AD模型。大鼠腹腔注射濃度為10%水合氯醛(3.5 ml/kg)溶液進(jìn)行局部麻醉，將大鼠固定在立體定位儀上。采用牙科鉆鉆開顱骨，利用微量注射器自硬腦膜垂直進(jìn)針2.8 mm，緩慢注射10 min，留針5 min，每側(cè)注射5 μl，利用水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行入組鼠篩選。利用定位航行實(shí)驗(yàn)測量大鼠對水迷宮的學(xué)習(xí)記憶能力〔3〕。第1天讓大鼠自由游泳，上、下午各1次；第2天進(jìn)行Morris水迷宮測試，將大鼠放置在水迷宮中固定象限，距離池壁20 cm，測試前在大鼠頭部涂抹苦味酸標(biāo)記，并向水池中加入適量的二氧化鈦粉，保持安靜，室內(nèi)以恒定日光燈照射，保持水迷宮實(shí)驗(yàn)幾天位置、環(huán)境不變，將大鼠放入池壁水中，1次/d，每次測試120 s，連續(xù)測試5 d，對于測試大鼠在120 s內(nèi)找到平臺，則讓其停留在平臺上15 s完成測試〔4〕。

1.3 LTP記錄和LTP誘導(dǎo) 在基線記錄維持40 min后采用能誘發(fā)LTP的高頻刺激：將10個(gè)連續(xù)的、間隔時(shí)間為25的刺激串，每個(gè)刺激串包含20個(gè)200 Hz的脈沖。記錄神經(jīng)元白發(fā)快興奮性突觸后電位(fEPSP)。

1.4 海馬組織的勻漿、突觸小體的提取和總蛋白濃度測定 采用經(jīng)典的蔗糖密度梯度離心來提取突觸小體。梯度離心主要是指等分離的物質(zhì)在具備密度階梯的介質(zhì)中完成，依靠不同物質(zhì)不同的密度完成分離。采用蔗糖作為介質(zhì)，在離心管內(nèi)形成一個(gè)不連續(xù)的密度梯度，從上到下依次為0.8 mol/L和1.2 mol/L，將粗提到的組織樣本置于蔗糖梯度的頂部〔5〕。在梯度介質(zhì)中，當(dāng)被分離的物質(zhì)分別達(dá)到與其密度相同的介質(zhì)部位時(shí)就不再移動(dòng)，達(dá)到分離的目的〔6〕。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 海馬CA1區(qū)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的LTP不依賴于小鼠單克隆抗體(NR2B)的活性 高頻刺激能誘導(dǎo)LTP持續(xù)數(shù)小時(shí)之久。實(shí)驗(yàn)中通過刺激海馬區(qū)側(cè)支旁通路，在CA1區(qū)輻射層記錄興奮性突出后場電位，結(jié)果顯示海馬區(qū)組織可塑性變化產(chǎn)生LTP并不依賴于NRB2活性，提示大鼠體內(nèi)長期的海馬組織可塑性變化會伴有相關(guān)蛋白的表達(dá)改變。見圖1。

a、b圖為基線記錄40 min后電刺激興奮性場電位變化；c圖為0.033 Hz測試刺激下的基線40～180 min 圖1 海馬CA1區(qū)NMDA受體介導(dǎo)的LTP不依賴于NR2B的活性

2.2 兩組大鼠海馬區(qū)內(nèi)谷氨酸受體及相關(guān)蛋白比較 AD模型組海馬區(qū)內(nèi)谷氨酸受體〔(7.4±0.3)μmol/g〕及相關(guān)蛋白CaMK Ⅱα含量(5.31±0.85)顯著高于對照組〔(2.1±0.1)μmol/g、1.02±0.23〕(P<0.05)。

3 討 論

細(xì)胞凋亡途徑主要有線粒體途徑和非線粒體途徑〔7〕。在線粒體途徑中，細(xì)胞內(nèi)的死亡細(xì)胞(如DNA、毒素和ATP耗竭等)均容易引起線粒體釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。而在非線粒體途徑中，死亡信號主要依賴于死亡配體和受體的相互結(jié)合，從而誘導(dǎo)死亡受體的死亡結(jié)構(gòu)及相關(guān)信號分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)〔8〕。

腦變化涉及內(nèi)容相對較多，遍及生命，包括記憶、熟練、情緒及精神疾病和藥物的成癮。這些變化在大腦中是長期的、永久的，部分行為甚至對人能產(chǎn)生較遠(yuǎn)的影響，臨床上將向大腦這樣長期的變化稱之為神經(jīng)可塑性。大腦是一個(gè)巨大的網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由1 101神經(jīng)元組成，承受104輸入并發(fā)出接近104的信息的輸出。而神經(jīng)元之間的接觸或突出的變化更加接近1 015。因此，突觸數(shù)目的變化及突出效能的變化均會引起神經(jīng)元可塑性的變化。而LTP是由一種簡單的高頻刺激興奮性輸入端引起突出強(qiáng)度的持續(xù)增強(qiáng)〔9〕。谷氨酸受體在人體海馬區(qū)中發(fā)揮了重要的作用，它屬于神經(jīng)遞質(zhì)受體，興奮性突出的谷氨酸能與NMDA受體、AMP A受體相互接觸。而在突觸上，NMDA受體能與多種蛋白復(fù)合物形式相互作用，包括神經(jīng)遞質(zhì)受體、細(xì)胞薪附蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、支架蛋白、信號分子等，NMDA受體能與多種信號通路形成一種復(fù)合物共存的NMDA，并且在突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮了重要的作用。受體在突觸上的數(shù)目、種類、組成、與不同蛋白間的相互作用以及下游的信號傳導(dǎo)通路的改變都組成了神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)活動(dòng)的改變，從而參與了突觸可塑性的改變。本研究臨床上對于AD的發(fā)病機(jī)制、治療方法及藥物的選擇等均需要進(jìn)一步研究和探討。

本研究采用水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)艹晒⒋笫驛D模型，且海馬組織可塑性變化對谷氨酸受體與相關(guān)蛋白能產(chǎn)生明顯的影響，海馬學(xué)習(xí)記憶機(jī)制參與成癮和戒斷引起的行為適應(yīng)性變化。

1 吳紅彥，李海龍，張 云，等.黑逍遙散對東莨菪堿致癡呆小鼠模型的影響〔J〕. 中國中醫(yī)藥信息雜志，2013；20(10)：35-7.

2 Wu J，Bie B，Yang H，etal.Activation of the CB2 receptor system reverses amyloid-induced memory deficiency〔J〕.Neurobiol Aging,2013;34(3)：791-804.

3 亓 珅，杜怡峰.炎性反應(yīng)在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中作用的研究進(jìn)展〔J〕.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2013；20(4)：278-80.

4 宋春未，戴雪伶，姜招峰.阿爾茨海默病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究進(jìn)展〔J〕.生物學(xué)雜志，2013；30(5)：85-8.

5 徐 琴，竺智偉，趙正言.Drebrins 和 Icam-5 在 Fmr-1 基因敲除鼠大腦皮層的表達(dá)和意義〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2012；11(7)：658-62.

6 陳奕晨，徐紅波，胡子成，等.首發(fā)未用藥抑都癥患者血漿氨基酸檢測分析及其臨床意義〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012；34 (14)：1442-5.

7 Sarabdjitsingh RA，Kofink D，Karst H，etal.Stress-induced enhancement of mouse amygdalar synaptic plasticity depends on glucocorticoid and beta-adrenergic activity〔J〕.PLoS One，2012；7(8)：e42143.

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〔2016-10-25修回〕

(編輯 袁左鳴)

黑龍江省教育廳課題(12531699)

齊志國(1972-)，男，主任醫(yī)師，碩士，主要從事神病學(xué)相關(guān)臨床和基礎(chǔ)研究。

魏春杰(1980-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事神經(jīng)內(nèi)科臨床與基礎(chǔ)研究。

R741.02

A

1005-9202(2017)05-1073-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.015