李小倫

（山東省博興縣畜牧獸醫(yī)局 山東濱州 256500）

豬病毒性腹瀉是豬群各種腹瀉中造成危害最為嚴(yán)重的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，可導(dǎo)致仔豬高死亡率以及耐過豬生長(zhǎng)緩慢、飼料報(bào)酬降低、養(yǎng)殖成本增加等[1]，是危害仔豬健康的主要傳染病之一。2017年4月，山東博興某豬場(chǎng)發(fā)生腹瀉疫情，主要表現(xiàn)為7日齡仔豬突然發(fā)病，體溫升高，食欲減退，咳嗽，嘔吐，嚴(yán)重腹瀉，脫水，全身淋巴結(jié)腫大，腸壁變薄，呈透明狀，腸道中夾雜黃色稀糞及未消化凝乳塊。通過臨床特征初步判斷為仔豬病毒性腹瀉，為進(jìn)一步確定致病原，采集病死豬病料樣品并進(jìn)行了豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（RV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒 2型（PCV-2）、豬瘟病毒（CSFV）和偽狂犬病毒（PRV）7種可導(dǎo)致仔豬腹瀉的致病原的實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與試劑盒

DL 2,000 DNA Marker、One Step RT-PCR Kit、Premix Taq均購自寶生物（大連）工程有限公司；病毒基因組RNA提取試劑盒、病毒基因組DNA提取試劑盒均購自北京百泰克生物科技有限公司。

1.2 病料樣品的采集與處理

無菌采集病死豬的腸道組織，將其加入5倍體積滅菌生理鹽水中，組織搗碎機(jī)搗碎后，經(jīng)“-20℃～室溫”反復(fù)凍融三次后，12,000rpm離心10min，吸取上清液即為處理后的臨床病料樣品。

1.3 病毒基因組的提取

按照病毒基因組RNA提取試劑盒的操作步驟提取臨床病料樣品的RNA，按照病毒基因組DNA提取試劑盒的操作步驟提取臨床病料樣品的DNA。

1.4 RT-PCR/PCR檢測(cè)

根據(jù)于新友等[2]建立的PEDV、RV、TGEV一步法三重RT-PCR檢測(cè)方法，李圣等[3]建立的PRRSV、CSFV一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法，郭曉秋等[4]建立的PRV、PCV-2雙重PCR檢測(cè)方法分別合成PEDV、RV、TGEV、PRRSV、CSFV、PRV、PCV-2 特異性檢測(cè)引物（引物信息如表1所示）。分別利用PEDV、RV、TGEV一步法三重RT-PCR檢測(cè)方法，PRRSV、CSFV一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)病料樣品的RNA進(jìn)行檢測(cè)，利用PRV、PCV-2雙重PCR檢測(cè)方法對(duì)病料樣品的DNA進(jìn)行檢測(cè)。各種RT-PCR/PCR擴(kuò)增體系與擴(kuò)增程序如表1所示。

1.5 擴(kuò)增結(jié)果的檢測(cè)

RT-PCR/PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)電泳中特異性擴(kuò)增片段的大小判定檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

如圖 1 所示，PEDV、RV、TGEV 一步法三重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)病料樣品擴(kuò)增出1條約450bp特異性條帶，與預(yù)期PEDV擴(kuò)增片段的大小相符；PRRSV、CSFV一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)病料樣品擴(kuò)增出1條約350bp特異性條帶，與預(yù)期PRRSV擴(kuò)增片段的大小相符；PRV、PCV-2雙重PCR檢測(cè)方法對(duì)病料樣品擴(kuò)增出1條189bp的特異性條帶，與預(yù)期PCV-2擴(kuò)增片段的大小相符。該結(jié)果表明此次仔豬發(fā)生的腹瀉疫情主要由PEDV、PRRSV、PCV-2的混合感染所致。

3 討論

近年來，隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；焖侔l(fā)展，仔豬病毒性腹瀉的發(fā)病率明顯增加，尤其是2010年以來我國(guó)豬場(chǎng)從南到北，從東到西陸續(xù)暴發(fā)PEDV變異毒株感染疫情，霍翠梅等[1]對(duì)濟(jì)寧地區(qū)21個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)58份腹瀉仔豬樣品進(jìn)行PEDV、TGEV、RV、CSFV、PCV-2、PRRSV 和 PRV 的檢測(cè)，陽性感染率依次為 75.0%、0、13.6%、40.9%、36.4%和77.3%，PEDV與 CSFV、PRRSV、PCV-2混合感染率分別為45.6%、31.8%、59.1%，表明PEDV成為目前仔豬病毒性腹瀉的主要致病原，且與CSFV、PRRSV、PCV-2的混合感染率增高，混合感染情況較嚴(yán)重。多種致病原的混合感染給疫病的診斷與防治增加了難度，PCR方法因其操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、敏感性高，且能夠擴(kuò)增致病原的特異性核苷酸序列，為疫病混合感染的確診提供了有效的檢測(cè)技術(shù)手段。本病例通過PCR方法確診致病原為PEDV、PRRSV、PCV-2混合感染，為發(fā)病豬場(chǎng)找到了致病原，也為其它病例的診斷提供了參考與借鑒，臨床中發(fā)現(xiàn)病毒性腹瀉時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)考慮是否存在混合感染，做到及時(shí)、準(zhǔn)確的確診致病原?！?/p>

表1 7種病毒RT-PCR/PCR擴(kuò)增信息匯總表

圖1 RT-PCR/PCR擴(kuò)增結(jié)果

[1] 霍翠梅,郝晴晴,呂玉星.2015年-2016年濟(jì)寧地區(qū)導(dǎo)致豬腹瀉的病毒性病原調(diào)查報(bào)告[J].當(dāng)代畜牧,2016(5)：38.

[2] 于新友,李天芝,沈志強(qiáng).一步法多重RT-PCR檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬A群輪狀病毒方法的建立和應(yīng)用[J].養(yǎng)豬,2016(2)：105-107.

[3] 李圣,鄭歡莉,李紅炳,等.一步法RT-PCR同時(shí)檢測(cè)CSFV和PRRSV方法的建立及應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,32(6)：40-44.

[4] 郭曉秋,曲哲會(huì),劉濤.豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用 [J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2015,51(10)：34-37.