楊曉珍，藍海

（大理大學 藥學與化學學院，云南 大理 671000）

不同提取方法的紫地榆提取物對常駐口腔細菌的研究*

楊曉珍，藍海

（大理大學 藥學與化學學院，云南 大理 671000）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.004

目的研究不同方法提取紫地榆正丁醇部分和乙酸乙酯部分對變形鏈球菌、黏性放線菌和血鏈球菌生長及產酸的影響。方法首先分別測定不同方法提取的紫地榆正丁醇部分和乙酸乙酯部分對變形鏈球菌、黏性放線菌及血鏈球菌的最低抑菌濃度（M IC）和最低殺菌濃度（M BC），再以低于M IC的4個濃度配制含藥的胰酶解酪蛋白-植物蛋白胨-酵母提取物液體培養(yǎng)基，測定紫地榆正丁醇部分和乙酸乙酯部分對3種常駐口腔細菌產酸的影響。結果熱提的紫地榆正丁醇部分對變形鏈球菌、黏性放線菌及血鏈球菌的M IC分別為3.0、3.0和6.0 g/L，M BC分別為6.0、6.0和12.0 g/L。熱提的紫地榆乙酸乙酯部分對變形鏈球菌、黏性放線菌及血鏈球菌的M IC均為6.0g/L，M BC均為12.0g/L。冷提的紫地榆正丁醇部分對變形鏈球菌、黏性放線菌及血鏈球菌的M IC均為6.0 g/L，M BC均為12.0 g/L。冷提的紫地榆乙酸乙酯部分對變形鏈球菌、黏性放線菌及血鏈球菌的M IC均為6.0 g/L，M BC均為12.0 g/L。一定濃度的紫地榆正丁醇部分和乙酸乙酯部分對3種常駐口腔細菌的產酸有一定的抑制作用，但提取方法的不同對其抑制產酸的能力差異無統(tǒng)計學意義。結論紫地榆正丁醇部分和乙酸乙酯部分能有效抑制口腔致齲菌的生長和產酸，可能是一種潛在的天然防齲藥物。

紫地榆；變形鏈球菌；粘性放線菌；血鏈球菌；產酸

紫地榆是牻牛兒苗科老鸛草屬植物的根，在云南的白族、彝族等少數(shù)民族地區(qū)長期用作厭食癥的治療，具有消炎、止痢和收斂的功效。有研究證明，紫地榆有良好的抗體外常見胃腸道細菌的作用，并能降低被痢疾志賀菌感染的小鼠死亡率[1-3]。此外，紫地榆不同溶劑提取物有抑制釉質脫礦和促進再礦化的作用，且其水提物能有效抑制口腔致齲菌變形鏈球菌和血鏈球菌的生長和產酸[4-12]。本實驗旨在比較研究紫地榆不同提取方法的正丁醇部分和乙酸乙酯部分對3種常駐口腔細菌產酸的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

紫地榆購于大理藥材市場，由大理大學藥學與化學院鑒定為紫地榆的根。變形鏈球菌（st rept ococcus m ut ans，ATCC25175）、血鏈球菌（act i nom yces vi scosus，ATCC9246）、黏性放線菌（st rept ococcus sangui s，ATCC27044）均購自廣東微生物菌種保藏中心。胰酶解酪蛋白-植物蛋白胨-酵母提取物（t rypt i casephyt one-yeast ext ract m edi um，TPY）固體及液體培養(yǎng)基，0.5和 0.1 m ol/L氫氧化鈉，0.05%洗必泰（chl orhexi di ne acet at e，CA），0.5 m ol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphat e buf f er sal i ne，PBS）、蔗糖、無水乙醇、葡萄糖、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純。

1.2 紫地榆粗提物的提取

1.2.1 冷提 95%乙醇常溫浸泡粉碎的原藥材24 h，抽濾，把濾液旋轉蒸發(fā)成浸膏后加適量蒸餾水溶解，分別用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得石油醚和三氯甲烷部分多為色素且提取物含量較少故舍去，其余部分冷凍干燥后得粉末備用。

1.2.1 熱提 95%乙醇50℃回流提取，提取6次，2 h/次，抽濾，把濾液旋轉蒸發(fā)成浸膏后加適量蒸餾水溶解，分別用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得石油醚和三氯甲烷部分多為色素且提取物含量較少故舍去，其余部分冷凍干燥后得粉末備用。

1.3 菌液的制備

將3株凍干菌株復蘇48h后接種于TPY液體培養(yǎng)基中厭氧條件下（37℃、80%氮氣N2，20%二氧化碳CO2）培養(yǎng)18 h。經生化鑒定及涂片檢查為純培養(yǎng)后，3 000 r/m i n離心15 m i n，棄上清液，菌細胞用無菌生理鹽水洗滌。再次離心，重復離心洗菌3次。分別將洗凈的3種菌細胞用無菌生理鹽水稀釋，用0.5麥氏單位標準比濁管調菌懸液的濃度約5×107CFU/m l。

1.4 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定

將紫地榆各萃取物按2倍稀釋法分別溶于含1%葡萄糖的TPY液體培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為48.000、24.000、12.000、6.000、3.000、1.500、0.750 和0.375 g/L。將菌懸液與含藥液的培養(yǎng)基按1∶10（V/ V）比例，加入96孔板后置37℃、80%N2，20%CO2下厭氧培養(yǎng)48 h。肉眼觀察是否有菌生長，以無菌生長的紫地榆萃取物濃度為其最低抑菌濃度（m i ni m um i nhi bi t ory concent rat i on，M IC）。選擇大于M IC濃度的各孔，分別取20μl涂布于TPY固體培養(yǎng)基上，在相同條件下培養(yǎng)48 h，肉眼觀察菌落數(shù)少于5～6個的最低萃取物濃度為最低殺菌濃度（m i ni m um bact erici dal concent rat i on，M BC），實驗重復3次。

1.5 紫地榆提取物對3種常駐口腔細菌產酸能力影響的測定

根據(jù)紫地榆各萃取部分對上述3種常駐口腔細菌的M IC測定結果，將含1%葡萄糖和紫地榆萃取物的TPY液體培養(yǎng)基配成M IC以下濃度梯度的4個實驗組，另設1個含0.05%洗必泰的陽性對照組、1個不含藥物的陰性對照組，共6組，每組設3個平行管，實驗重復2次。調定初始pH值為7.4并按菌懸液∶TPY液體培養(yǎng)基為1∶10（V/V）的比例接種細菌后置于37℃、80%N2，20%CO2厭氧條件下培養(yǎng)48h。用pH酸度計測定培養(yǎng)物上清液的pH值并計算其變化值△pH，△pH=初始pH值-終末pH值[13-14]。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析（anal ysi s of vari ance，ANOV），若方差齊，則兩兩比較用Dunnet t-t檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫地榆各提取物部分對3種常駐口腔細菌生長的影響

紫地榆各提取物對3種常駐口腔細菌均有生長抑制和殺菌作用，熱提的紫地榆正丁醇部分的抑菌與殺菌效果最好，而用不同方法提取的紫地榆乙酸乙酯部分抑菌與殺菌效果相近。見表1。

表1 紫地榆各提取部分對3種口腔常駐細菌的影響（g/L）

2.2 紫地榆各提取部分對3種常駐口腔細菌產酸的影響

各組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F= 280.121，P=0.000），熱提的紫地榆正丁醇提取物濃度（C≥1.500 g/L）對血鏈球菌產酸的抑制效果與洗必泰的相近（P=0.664）；熱提的紫地榆乙酸乙酯部分，較高質量濃度組（C≥3.000 g/L）與陽性對照組抑制口腔細菌產酸的效果相近（P＞0.05）。冷提的紫地榆正丁醇部分濃度（C≥3.000 g/L）對變形鏈球菌產酸的抑制效果與洗必泰的相近（P=0.012）；冷提的紫地榆乙酸乙酯濃度（C≥3.000 g/L）對變形鏈球菌產酸的抑制效果與洗必泰的相近（P=0.149）。見表2。

表2 紫地榆各提取物部分對3種常駐口腔細菌產酸的影響 （n=6，±s）

表2 紫地榆各提取物部分對3種常駐口腔細菌產酸的影響 （n=6，±s）

注：1）與陰性對照組比較，P＜0.05；2）與陽性對照組比較，P＜0.05

組別變形鏈球菌ΔpH黏性放線菌ΔpH血鏈球菌ΔpH熱提正丁醇1.500 g/L0.983±0.05851）2）0.9733±0.06291）2）0.5500±0.04511）0.750 g/L 1.1200±0.03741）2） 1.0650±0.05681）2） 0.6533±0.07041）0.375 g/L 1.9083±0.04751）2） 1.3600±0.07571）2） 0.9650±0.06211）2）0.187 g/L 1.9800±0.06631）2） 1.4917±0.07031）2） 1.0700±0.06271）2）陽性對照組 0.7583±0.0319 0.6633±0.0453 0.5650±0.03641）2）陰性對照組 3.0717±0.0343 2.8483±0.0414 1.6667±0.0632乙酸乙酯3.000 g/L0.6767±0.05341）0.8833±0.06291）2）0.6800±0.06401）2）1.500 g/L 0.9933±0.07481）2） 0.9967±0.05651）2） 0.7917±0.02971）2）0.750 g/L 1.3883±0.08531）2） 1.3567±0.11161）2） 1.1600±0.06301）2）0.375 g/L 1.7183±0.05961）2） 1.5267±0.05821）2） 1.3983±0.06411）2）陽性對照組 0.7517±0.0430 0.6900±0.0513 0.5633±0.0382陰性對照組 3.0683±0.0393 2.8467±0.0591 1.6567±0.0415冷提正丁醇3.000 g/L0.6533±0.07651）0.6383±0.04951）0.6333±0.05911）1.500 g/L 0.9667±0.05191）2） 0.9150±0.06781）2） 0.7900±0.05131）2）0.750 g/L 1.3483±0.07511）2） 1.1900±0.04431）2） 0.9683±0.06721）2）0.375 g/L 2.0700±0.06561）2） 1.3483±0.04301）2） 1.2767±0.05471）2）陽性對照組 0.7650±0.0496 0.6433±0.0464 0.5833±0.0534陰性對照組 3.0533±0.0471 2.8400±0.0497 1.6583±0.0471乙酸乙酯3.000 g/L0.8567±0.07481）0.8933±0.03501）2）0.7800±0.05571）2）1.500 g/L 1.1017±0.05241）2） 1.0533±0.04921）2） 0.8567±0.03541）2）0.750 g/L 1.4517±0.07901）2） 1.3750±0.05851）2） 1.2083±0.06361）2）0.375 g/L 1.8533±0.07591）2） 1.5167±0.04991）2） 1.5150±0.06211）2）陽性對照組 0.7750±0.0427 0.6567±0.03941）2） 0.5250±0.0535陰性對照組 3.0683±0.0393 2.8650±0.0435 1.6683±0.0334

3 討論

齲病是口腔常見病、多發(fā)病，其實質是牙菌斑內細菌酵解碳水化合物產生有機酸，引起牙體無機物脫礦，有機質崩解，最終導致齲損形成的慢性進行性疾病。本實驗選用的變形鏈球菌、血液鏈球菌及黏性放線菌是口腔常駐細菌。這3種細菌都能發(fā)酵多種碳水化合物產酸，使菌斑pH值降到＜5，因此其生長、產酸代謝與齲病的發(fā)生密切相關[15]。本實驗結果顯示，紫地榆正丁醇和乙酸乙酯提取物對口腔3種常見菌均有顯著的產酸抑制作用，但提取方法的不同對其抑制產酸的能力差異無統(tǒng)計學意義。

在對口腔細菌產酸影響的實驗中，為排除藥物本身因抑制菌細胞生長而產生的對產酸的抑制表現(xiàn)，采用在M IC濃度以下的4個濃度梯度。而實驗中所用的洗必泰是一種廣譜抗生素，臨床上主要用于飲水消毒，角膜潰瘍、菌痢、牙周病、狐臭、凍傷、陰道炎及宮頸糜爛的治療，能減少牙周病和齲病的發(fā)生[16]。在臨床上通常首選0.05%洗必泰漱口水治療各種致齲菌引起的各型口腔疾病，故用含0.05%洗必泰作為陽性對照組。有研究顯示，紫地榆乙酸乙酯部分、正丁醇萃取部位及水部分對致齲菌的生長、產酸有一定的抑制作用，但其水部分效果相對較差[17-18]。

綜上所述，一定濃度的紫地榆正丁醇與乙酸乙酯萃取物可抑制3種常駐口腔細菌的生長及產酸，其中熱提的紫地榆正丁醇部分的抑菌與殺菌效果最好，用不同方法提取的紫地榆乙酸乙酯部分抑菌與殺菌效果相近，抑酸作用方面，差異無統(tǒng)計學意義。其原因可能是提取方法的改變只是引起其有效成分含量的改變，并未導致其有效成分數(shù)量的改變；熱提法提取紫地榆會使其各浸膏的提取率分別有所提高。天然藥物紫地榆對常駐口腔細菌的生長及產酸有一定的影響，可考慮開發(fā)成牙膏、漱口水等應用形式，但同時天然藥物活性成分比較復雜，其具體有效成分目前尚不明確，故有待進一步研究。

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（童穎丹 編輯）

Effect ofGeranium Strictipesextracts extracted by different methods on acid production of three strains of oral bacteria*

Xiao-zhen Yang,Hai Lan
(College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China)

ObjectiveTo inquire into the effect of N-butyl alcohol and ethyl acetate extracts ofGeranium Strictipesextracted by different methods on growth and acid production ofStreptococcus mutans,Streptococcus sanguisandActinomyces viscosus.MethodsFirstly,minimum bacteriostatic concentration (MIC)and minimum bactericidal concentration(MBC)of N-butyl alcohol and ethyl acetate extracts ofGeranium Strictipesextracted by different methods onStreptococcus mutans,Streptococcus sanguisandActinomyces viscosuswere respectively determined and then the effect of theseGeranium Strictipesextracts on the acid production was determined.ResultsThe MIC of N-butyl alcohol extract ofGeranium Strictipesextracted reflux onStreptococcus mutans,Streptococcus sanguisandActinomyces viscosuswere 3.0,3.0 and 6.0 g/L respectively,while the MBC were 6.0,6.0 and 12.0 g/L respectively.The MIC of ethyl acetate extract ofGeranium Strictipesextracted reflux on the three bacteria strains were all 6.0 g/L,and the MBC were all 12.0 g/L.The MIC of N-butyl alcohol extract ofGeranium Strictipesextracted maceration on the three bacteria strains were all 6.0 g/L,the MBC were all 12.0 g/L.The MIC of ethyl acetate extract ofGeranium Strictipesextracted maceration on the three bacteria strains were all 6.0 g/L,the MBC were all 12.0 g/L.A certain concentration of N-butyl alcohol and ethyl acetate extracts ofGeranium Strictipescould inhibit acid production of the three bacteria strains, but there was no significant difference in the inhibition of acid production by different extraction methods.ConclusionsN-butyl alcohol and ethyl acetate extracts ofGeranium Strictipescan effectively inhibit the growth and acid production of oral bacteria,may be effective anti-caries agents.

Geranium Strictipes;Streptococcus mutans;Streptococcus sanguis;Actinomyces viscosus;acid production

1005-8982（2017）03-0018-04

R 781.1

A

2016-03-25

國家自然科學基金（No：81260512）；云南省大理學院應用開發(fā)研究基金（No：Kyyy201102）

藍海，E-m ai l：l anhai 8696@126.com；Tel：13769225179