李 炯，顧海濤，孫 勇

(1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院外科 401120；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科 400010； 3.重慶市巴南區(qū)中醫(yī)院 401320)

攜目的基因的靶向超聲微泡對肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性的影響

李 炯1，顧海濤2△，孫 勇3▲

(1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院外科 401120；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科 400010； 3.重慶市巴南區(qū)中醫(yī)院 401320)

目的 制備一種靶向肝癌HepG2細(xì)胞的載單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)基因超聲微泡，并考察其體外尋靶能力及對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。方法 用機(jī)械振蕩法制備超聲微泡，生物素-親和素橋連方式構(gòu)建靶向載HSV-TK超聲微泡。檢測其一般特性，并進(jìn)行體外實驗檢測其對HepG2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 靶向載HSV-TK超聲微泡可較多地聚集在HepG2細(xì)胞表面，通過檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)及噻唑藍(lán)(MTT)法，發(fā)現(xiàn)載基因靶向微泡組的增殖能力明顯下降，細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞侵襲實驗表明載基因靶向微泡組(22.18±2.01)較對照組及載基因非靶向微泡組明顯減少，對HepG2細(xì)胞增殖及侵襲能力有較好的抑制作用。結(jié)論 攜目的基因靶向超聲微泡對肝癌HepG2細(xì)胞在體外有較好抑制效果。

肝腫瘤；細(xì)胞增殖；超聲微泡；GPC3；HepG2細(xì)胞

肝癌在全球發(fā)病率呈逐年上升趨勢，并逐步年輕化，其危害性大，治愈率低，病情進(jìn)展較快，被稱為“癌中之王”。外科手術(shù)雖然能夠提供較好的治療效果，但受制于較多其他因素，適合并接受手術(shù)者僅為20%。隨著超聲分子顯像技術(shù)的不斷發(fā)展，靶向超聲造影劑的設(shè)計及制備已得到極大的進(jìn)步。靶向超聲造影劑可以作為治療藥物或基因的載體，通過血液循環(huán)特異性地聚集于靶組織，從而達(dá)到靶向治療的目的。已有研究發(fā)現(xiàn)，脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)特異性地在肝癌細(xì)胞中表達(dá)，以此作為靶點進(jìn)行載藥或載基因靶向治療有較好的臨床應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 抗人GPC-3單克隆抗體(美國R&D systems)；二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)(2000)Biotin(美國Avanti)；二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、疊氮磷酸二苯酯(DPPA)(德國Lipoid)；單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)質(zhì)粒(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲影像研究所惠贈)；鏈酶親和素(美國Sigma)；N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯(美國Sigma)；熒光染料DiI(美國Sigma)；THZ-C恒溫振蕩器(江蘇太倉實驗設(shè)備廠)；高速離心機(jī)(德國Eppendorf)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)；肝癌HepG2細(xì)胞株(重慶醫(yī)科大學(xué)生物工程研究所惠贈)。

1.2 方法

1.2.1 超聲微泡的制備 稱量成膜磷脂材料DSPE-PEG(2000)Biotin、DPPC、DPPE、DPPA，按一定比例混合，加入少量熒光染料，溶于定量的甲醛和三氯甲烷混合溶液中，甲醛和三氯甲烷揮發(fā)完全后，加入甘油和磷酸鹽緩沖液(PBS)，在45 ℃水浴箱中孵育30 min，再次使用氟碳?xì)怏w置換空氣，在振蕩器中振蕩50 s得到脂質(zhì)超聲微泡。

1.2.2 攜帶GPC-3抗體及HSV-TK基因的靶向超聲微泡的制備 取適量(約含3.0×108微泡)已制備好的微泡，將其加入2 mL EP管中；加入90 μg 鏈霉親和素，輕輕反復(fù)顛倒搖勻，置于4 ℃冰箱，孵育30 min；然后在4 ℃環(huán)境下離心，棄下清液，PBS輕輕漂洗后離心2次，棄下清液、去除過量的鏈霉親和素；加入20 μg 生物素化GPC-3抗體輕輕顛倒搖勻，4 ℃孵育30 min；4 ℃ 500 r/min離心4 min，PBS漂洗離心2次，棄下清液，去除過量的GPC-3抗體，即可得到攜GPC-3抗體的靶向超聲微泡。取適量異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗，攜GPC-3抗體的超聲微泡中，4 ℃孵育30 min；4 ℃ 500 r/min離心4 min，棄下清液，PBS漂洗離心2次，棄下清液，去除過量的二抗；取出提取的HSV-TK質(zhì)粒20 μg，加入上述已連接GPC-3抗體的微泡溶液共孵育，去除下清液得到靶向攜基因超聲微泡。將微泡涂片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 熒光顯微鏡下觀察靶向載基因超聲微泡對肝癌HepG2細(xì)胞的結(jié)合情況 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，在6孔板底部以1×104/孔進(jìn)行接種，細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)，制備細(xì)胞爬片，設(shè)置對照組和靶向微泡組，每組各5張，對照組加入非靶向微泡200 μL，靶向組加入靶向載基因超聲微泡200 μL，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中共孵育2 h，取出爬片，PBS反復(fù)沖洗5次，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)合情況。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及Western blot 檢測肝癌HepG2細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)情況 將靶向超聲微泡與對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中共孵育30 min，給予超聲輻射(1 MHz,2 W/cm2,間隔30 s，持續(xù)5 min)，基因轉(zhuǎn)染完成后，加入羥甲基無環(huán)鳥苷(GCV)溶液100 μL(濃度為10 mg/L)。超聲輻照后，再次孵育48 h，收集細(xì)胞，分別提取總RNA和蛋白，RT-PCR及Western blot 檢測肝癌HepG2細(xì)胞中PCNA表達(dá)情況。

1.2.5 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測各組細(xì)胞凋亡 HSV-TK質(zhì)粒在超聲作用下轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后，加入GCV，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，進(jìn)行MTT實驗，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸取上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使晶體充分降解，然后進(jìn)行比色，在490 nm波長下測定各組細(xì)胞光吸收值并記錄實驗結(jié)果。

1.2.6 細(xì)胞侵襲實驗 將冰凍BD matrigel置于4 ℃，待其變成液體后，將其與無血清1640培養(yǎng)基按1∶2比例稀釋，transwell置于24孔板中，加入稀釋后的matrigel(每孔100 μL)于transwell上室，置于37 ℃孵箱中4 h；HepG2細(xì)胞重懸于含1%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度為5×105/mL，每孔200 μL接種于預(yù)先鋪好matrigel的transwell上室中；HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72 h，收集各組培養(yǎng)液，按照分組以每孔600 μL加入transwell下室中，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h；棉簽拭去上室殘留未侵襲細(xì)胞，transwell小室中加入0.1%結(jié)晶紫，置于37 ℃孵箱中30 min，倒置顯微鏡下(200×)觀察腫瘤細(xì)胞侵襲能力，隨機(jī)選擇5個視野進(jìn)行計數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 超聲微泡特征 白光下觀察超聲微泡大小均一，分布均勻，見圖1。

圖1 微泡在激光共聚焦顯微鏡下成像特征(白光，×1 000)

2.2 微泡造影劑粒徑及表面電位特征 微泡造影劑粒徑(Diameter)為(512.57±25.18)nm，其表面電位(Zeta-potential)為(-2.54±0.75)mV。

2.3 超聲微泡與GPC-3抗體連接情況 超聲微泡與GPC-3抗體結(jié)合后在激光共聚焦顯微鏡下成像情況，白光下觀察大小一致，分布均勻，激光激發(fā)后，周圍呈現(xiàn)綠色熒光，表明靶向載基因微泡成功構(gòu)建(圖2)。

A：MB的白光圖像;B：MB-GPC-3與二抗連接后在激光激發(fā)下呈現(xiàn)綠色熒光。

圖2 超聲微泡在激光共聚焦顯微鏡下成像(×1 000)

2.4 靶向載基因超聲微泡體外尋靶 400倍光鏡下觀察到：(1)載基因靶向微泡組(MB-GPC-3組)，較多量載基因靶向微泡造影劑與肝癌HepG2細(xì)胞緊密結(jié)合，主要分布在細(xì)胞周邊及細(xì)胞壁游離面上(圖3B)；(2)載基因非靶向微泡組(MB組)，在PBS 的反復(fù)沖洗下，細(xì)胞周圍觀察不到或僅見少量造影劑黏附(圖3A)。

A：MB組；B：MB-GPC-3組。

圖3 體外尋靶實驗(白光,×400)

2.5 攜HSV-TK質(zhì)粒的不同微泡的轉(zhuǎn)染效率 由于構(gòu)建質(zhì)粒是已將綠色熒光蛋白(GFP)連接進(jìn)入質(zhì)粒，因此當(dāng)HSV-TK質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后，熒光顯微鏡下會見到綠色熒光，此時就可表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察見對照組無熒光表達(dá)，MB組和MB-GPC-3組熒光表達(dá)較多，其中MB-GPC3組表達(dá)最高。各組轉(zhuǎn)染效率分別為(0.26±0.05)%、(2.73±0.34)%、(20.53±2.15)%，MB-GPC3組轉(zhuǎn)染效率最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后各組細(xì)胞熒光表達(dá)(×400)

2.6 RT-PCR及Western blot 檢測靶向轉(zhuǎn)染HSV-TK質(zhì)粒后HepG2細(xì)胞中PCNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h測PCNA mRNA和蛋白表達(dá)情況，對照組mRNA和蛋白表達(dá)最高，MB組和MB-GPC3組表達(dá)水平降低，其中MB-GPC3組表達(dá)水平最低，見圖5、6。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.01，與對照組和MB組比較。

圖5 PCNA mRNA表達(dá)情況

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.01，與對照組和MB組比較。

圖6 PCNA蛋白表達(dá)情況

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.01，與對照組和MB組比較。

圖7 細(xì)胞增殖抑制率

2.7 MTT檢測細(xì)胞增殖抑制 MTT法檢測轉(zhuǎn)染HSV-TK質(zhì)粒對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示，各實驗組對HepG2細(xì)胞均有不同抑制，MB組和MB-GPC-3組抑制最為明顯，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖7。

2.8 Transwell法檢測轉(zhuǎn)染HSV-TK質(zhì)粒后對HepG2細(xì)胞侵襲力的影響 各組經(jīng)過相應(yīng)處理的HepG2細(xì)胞穿過transwell上下室之間聚碳酸酯膜的結(jié)果如下，對照組(57.63±4.61)及MB組(49.16±3.89)穿過室膜的細(xì)胞數(shù)量較多，而MB組和MB-GPC-3組穿過的細(xì)胞數(shù)量較少，其中MB-GPC-3組穿過的細(xì)胞數(shù)最少(22.18±2.01)。兩組與對照組相比,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而MB-GPC-3組侵襲細(xì)胞數(shù)量最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖8。

A:對照組；B:MB組；C:MB-GPC-3組。

圖8 Transwell法檢測HepG2細(xì)胞侵襲力(伊紅染色×400)

3 討 論

隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展，人們對腫瘤研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)從分子水平對腫瘤進(jìn)行特異性殺傷成為新的治療策略[1]，但如何將用于治療的基因高效、安全地轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞是目前研究的熱點和難點。就目前而言，病毒載體是最高效的轉(zhuǎn)染方式，但其本身會引起機(jī)體的免疫反應(yīng)及不確定的致瘤性也限制了它的發(fā)展和應(yīng)用。于是結(jié)合當(dāng)前研究熱點，選擇非病毒載體來攜帶目的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但它們普遍存在攜載率低等缺陷[2]。超聲微泡靶向破壞技術(shù)是利用超聲輻照破壞微泡時產(chǎn)生的空化效應(yīng)及聲孔效應(yīng)使內(nèi)皮細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆性的小孔，有利于胞外的物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，由此提供新的思路[3-6]。

超聲微泡作為超聲造影劑被廣泛應(yīng)用于超聲診斷[7]，其同時也具備攜載基因及藥物的功能，因其具備安全、高效、簡單便捷等優(yōu)點[8]，已被眾多研究者用于體內(nèi)、體外靶向轉(zhuǎn)染，并在多種疾病的診斷及治療方面展現(xiàn)出極好的優(yōu)勢[9-10]。超聲微泡是有被膜及核心氣體構(gòu)成小的氣泡[11]，目前以脂質(zhì)微泡為主，脂質(zhì)微泡較其他微泡比較具有穩(wěn)定性好、持續(xù)時間長、制備工藝簡單等優(yōu)勢，但也存在攜載率低、靶向性差等缺點[12-14]。因此如何提高其攜載率及改變其靶向性成為研究目標(biāo)。普通超聲微泡由DSPE-PEG(2000)、DPPC、DPPE及DPPA等按一定比例混合后，在機(jī)械振蕩作用下構(gòu)建而成[15]。由于其膜性成分決定了其表面為負(fù)電荷或中性，多肽、抗體等有機(jī)成分均為負(fù)電荷，因此二者之間結(jié)合較為困難，目前最常用的連接方法為通過多聚賴氨酸轉(zhuǎn)化電荷進(jìn)行橋連。攜載質(zhì)粒的靶向微泡在體外可順利達(dá)到靶標(biāo)，并與靶標(biāo)通過抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性結(jié)合，然后在超聲作用下爆破微泡釋放HSV-TK質(zhì)粒，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)染。

本實驗中證實轉(zhuǎn)染后有TK蛋白表達(dá)，在MB-GPC3組呈現(xiàn)高表達(dá)，高于其他各組，說明靶向微泡可以明顯地促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染。HSV-TK質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后并沒有直接殺傷腫瘤細(xì)胞作用，在給予前藥GCV后，HSV-TK可以將無毒的GCV轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性藥物從而進(jìn)行殺傷。MTT實驗證實MB及MB-GPC3組細(xì)胞凋亡較多，其中MB-GPC3組凋亡細(xì)胞最多，高達(dá)49%；與此同時細(xì)胞的侵襲能力得以降低。

綜上所述，本研究成功制備了可以攜帶目的基因的靶向超聲微泡，并在體外可特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合，在超聲輻射下靶向釋放目的基因，從而提高了轉(zhuǎn)染效率，為腫瘤靶向治療提供了新思路。

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Effect of targeted ultrasound microbubble carrying target gene on the proliferation of HepG2 cells in human hepatocellular carcinoma

LiJiong1，GuHaitao2△，SunYong3▲

(1.DepartmentofSurgery,thePeople′sHospitalofYubeiDistrict,Chongqing401120,China; 2.DepartmentofSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China; 3.TranditionalChineseMedicineHospitalofBananDistrict,Chongqing401320,China)

Objective To prepare a targeted ultrasound micro bubble,which carried the HSV-TK gene,and investigate the in vitro target searching ability of the micro bubbles and inhibitory effect on the proliferation of HepG2 cells.Methods Ultrasonic micro bubbles were prepared by mechanical vibration method,construction of targeted HSV-TK ultrasound micro bubbles by biotin affinity bridge construction.To detect the general characteristics of ultrasound micro bubbles,and to test its effect on the proliferation of HepG2 cells in vitro.Results HSV-TK targeted ultrasound microbubbles more gathered on the surface of HepG2 cells,through detection of PCNA and MTT,it was found that the proliferation of gene targeting microbubble group was obviously decreased,cell apoptosis increased significantly,Cells invade experiments showed that the number of cells in genetic microbubble group (22.18±2.01)decreased significantly compared with the control group and the nontargeted group,can effectively inhibit the proliferation and invasive ability of HepG2 cells.Conclusion Targeted ultrasound microbubble carrying target gene have better inhibitory effect on HepG2 cells in vitro.

liver neoplasms;cell proliferation;ultrasound micro bubble;GPC3;HepG2 cell

李炯(1981-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事肝膽胸外科的研究?！?/p>

，E-mail:664186632@qq.com。▲共同通信作者，E-mail:404818126@qq.com。

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.008

R735.7

A

1671-8348(2017)05-0600-04

2016-07-09

2016-09-07)