王介剛

（山東省慶云縣畜牧獸醫(yī)局 山東德州 253700）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起豬的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。該病感染后的主要特征為嘔吐、腹瀉和脫水，各種年齡的豬都能感染發(fā)病，仔豬感染后危害最嚴(yán)重，死亡率最高。目前該病在我國豬場中的感染非常普遍，是危害仔豬健康的重要病毒性腸道傳染病，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PEDV感染在臨床癥狀和病理變化上與豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）感染均十分相似，且常常存在混合感染，在臨床病例的診斷中要注意二者之間的鑒別診斷。本文通過對臨床發(fā)病的疑似PEDV感染的仔豬病毒性腹瀉病例進(jìn)行了診斷，通過發(fā)病豬的臨床癥狀、解剖病理變化、實驗室PCR檢測與序列測定，最終確診該豬場感染了PEDV，現(xiàn)將診斷過程介紹如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與試劑盒

一步法RT-PCR檢測試劑盒、DL 2000Marker、pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；病毒基因組RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 臨床診斷及病料樣品的采集和處理

觀察發(fā)病豬的臨床癥狀及剖檢病理變化。取發(fā)病死亡仔豬的腸系膜淋巴結(jié)、腸黏膜等病變組織剪碎，按1∶3比例加入滅菌生理鹽水，用研磨器研磨呈組織勻漿，12,000r/min離心15min，吸取上清液，-20℃保存待用。

1.3 病料樣品RT-PCR檢測

根據(jù) Genebank中 PEDV、TGEV的 N基因序列，分別設(shè)計特異性檢測引物（PEDV上游引物F1：5'-AGGATCGTGGCCGCAAAC-3'，下游引物 R1：5'-TGAATTACCGCGGGACTG-3'；TGEV 上 游 引 物F2：5'-TGAAGGGCCAACGTAAAG-3'， 下 游 引 物R2：5'-GGGCGAGCATAGGCATTA-3'），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用病毒基因組RNA提取試劑盒提取處理后病料樣品的病毒基因組RNA，利用一步法RT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)體系為：2×Mix Buffer12.5μL，酶 0.5μL，上、下游引物各 0.5μL，RNA2.0μL，補(bǔ)水至25μL。RT-PCR反應(yīng)程序為：50℃ 60min，94℃ 5min，94℃ 45s，54℃ 45s，72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察結(jié)果，PEDV的預(yù)期擴(kuò)增片段大小為506bp，TGEV的預(yù)期擴(kuò)增片段大小為760bp。

1.4 測序鑒定

將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結(jié)果與GenBank中登錄的序列進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 臨床癥狀

豬場發(fā)病仔豬1月齡左右，臨床表現(xiàn)為精神沉郁，消瘦，很少進(jìn)食或拒絕進(jìn)食，進(jìn)食后嘔吐，嘔吐物中含未消化的凝乳塊，酸臭，急性腹瀉，排黃綠色水樣糞便，糞便中有氣泡和未消化的凝乳塊，機(jī)體嚴(yán)重脫水，消瘦明顯，體溫正常，一般發(fā)病后3～5d死亡，同圈仔豬發(fā)病率達(dá)80%左右，死亡率在20%左右。發(fā)病后豬場曾用抗生素進(jìn)行治療，無顯著效果，該豬場未進(jìn)行過PEDV、TGEV相關(guān)疫苗的免疫。

2.2 解剖病理變化

對病死仔豬解剖可見腸道病變明顯，腸系膜淋巴結(jié)水腫，腸擴(kuò)張，腸壁變薄，小腸內(nèi)有大量黃色黏稠液體，含有未消化的凝乳塊，胃黏膜出血。

2.3 臨床診斷結(jié)果

根據(jù)臨床癥狀和解剖病理變化初步懷疑致病原為PEDV、TGEV、或PEDV和TGEV混合感染。

2.4 病料樣品RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，PEDV擴(kuò)增產(chǎn)物在506bp的位置處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小相一致；而TGEV擴(kuò)增產(chǎn)物無任何擴(kuò)增條帶。即RT-PCR檢測結(jié)果為PRDV陽性，TGEV陰性。

2.5 測序鑒定結(jié)果

測序結(jié)果經(jīng)過與GenBank中登錄的序列比對分析顯示為PEDV的特異性序列，從核苷酸序列水平證實說明該豬場發(fā)生了PEDV感染。

3 討論

PEDV與TGEV同屬于冠狀病毒，都只有一種血清型，兩者之間沒有交叉保護(hù)，所以規(guī)模豬場要同時做好兩種疾病的疫苗免疫接種。PEDV與TGEV感染在臨床癥狀上無明顯差別，病豬和帶毒豬都是主要的傳染源。TGEV感染發(fā)生有明顯的季節(jié)性，一般多發(fā)于冬季和春季，仔豬感染后表現(xiàn)為嚴(yán)重腹瀉，脫水，2月齡以內(nèi)仔豬的發(fā)病率和死亡率都很高。PEDV感染后病死率比TGEV感染病死率稍低，PEDV感染可引起急性腹瀉，嘔吐，持續(xù)數(shù)天，新生仔豬的病死率達(dá)到50%以上，病變主要集中在小腸部位，呈現(xiàn)急性炎癥變化。

規(guī)模化豬場發(fā)生病毒性腹瀉很普遍，在臨床上很難實現(xiàn)PEDV與TGEV的鑒別診斷。為了確診可以通過實驗室檢測方法，PEDV與TGEV的鑒別檢測方法有很多種，RT-PCR方法操作簡單、檢測快速，可以準(zhǔn)確、快速的確診病原，是最常用的鑒別檢測方法。除了RT-PCR方法以外，還可以用膠體金試紙條、cDNA芯片、熒光定量RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增和ELISA方法等，各種檢測方法均具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)實驗條件選擇應(yīng)用。豬群一旦發(fā)生PEDV感染后要對病豬立即隔離飼養(yǎng)，密切觀察，可以應(yīng)用康復(fù)豬血清或PEDV高免卵黃抗體進(jìn)行治療。病豬康復(fù)后也要隔離觀察一段時間，因為在病豬康復(fù)后也有可能向外排毒。為預(yù)防本病，應(yīng)該制定合理的疫苗免疫接種計劃，目前PEDV商品化的疫苗包括弱毒疫苗和滅活疫苗，由于PEDV的免疫以黏膜免疫為主，高水平的母源抗體可以保護(hù)新生仔豬免受感染。如何獲得高水平的母源抗體是新生仔豬免受感染的關(guān)鍵，通常選擇PEDV與TGEV二聯(lián)疫苗在母豬產(chǎn)前2周進(jìn)行進(jìn)行免疫，新生仔豬通過母乳獲得高水平的母源抗體。有條件的豬場可以將發(fā)生PEDV感染死亡的仔豬腸道組織制備滅活疫苗，對全群母豬進(jìn)行免疫接種。發(fā)病的仔豬在緊急接種高免血清或卵黃抗體的同時還應(yīng)采用對癥療法，給予生理鹽水和葡萄糖溶液口服，防止仔豬因脫水而導(dǎo)致死亡。平時，豬場要加強(qiáng)飼養(yǎng)場的衛(wèi)生管理，發(fā)病后豬場內(nèi)的豬舍、環(huán)境、用具和運(yùn)輸工具等均要進(jìn)行徹底消毒，防止病毒再次感染?！?/p>