■冀勇良 劉麗英 朱傳合

（1.山東農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東泰安271018；2.山東農業(yè)大學生命科學學院，山東泰安271018)

角蛋白酶是一種具有將羽毛等角蛋白物質酶解為短肽和氨基酸的特殊蛋白酶，在飼料[1]、醫(yī)藥[2]、制革[3]、肥料、環(huán)保、食品以及洗滌劑等行業(yè)具有十分重要的應用[4]，近年成為研究的熱點。然而目前，國內外尚沒有統(tǒng)一的角蛋白酶活測定標準，很多研究者采用不同的測定方法、條件和酶活單位，造成不同研究結果之間很難進行比較和交流。雖然有相當一部分研究者喜歡采用以Gradisar[5]為代表的測定方法。但該方法在測定條件的適用范圍、表述的詳實上也存在一定的不完善甚至錯誤。例如對體系振蕩頻率只是含糊的表述為“定時取出用力振蕩”，對選用羽毛粉粒度的大小、底物濃度是否飽和以及酶活測定時不同試劑的添加順序也沒作具體說明，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)這些因素對酶活測定的結果都有著很大的影響，這樣會使同一酶樣的測定結果相差過大而難以比較。鑒于上述出現(xiàn)的實際問題，本研究以Gradisar等[5]的方法為基礎，系統(tǒng)地研究了多種因素對一株短小芽孢桿菌所產(chǎn)角蛋白酶酶活測定的影響，以期建立一種準確、簡便、快速的角蛋白酶酶活測定方法，為從事該領域研究的人員提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 羽毛及羽毛粉

菜市場家禽屠宰點收集生雞毛，用自來水洗凈后80℃烘干，用于發(fā)酵產(chǎn)酶。烘干后的生雞毛再用粉碎機粉碎后過篩即制成羽毛粉，用于測定酶活。

1.1.2 菌種

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus，JYL），從堆積腐爛羽毛的土壤中分離篩選。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、水1 000 ml，pH值7.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 0.5 g、KH2PO40.35 g、K2HPO40.7 g、MgSO40.2 g、CaCl20.02 g、羽毛5 g、水1 000 ml，121℃高壓滅菌20 min，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備

取一環(huán)斜面活化的菌種，接入到含50 ml種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，37℃、160 r/min培養(yǎng)24 h即為種子液。

1.2.2 液體發(fā)酵及粗酶液制備

取2 ml上述種子液接于含100 ml初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，37℃，160 r/min培養(yǎng)36 h。發(fā)酵液4℃、10 000 r/min離心15 min,上清液即為粗酶液。

1.2.3 角蛋白酶酶活測定的基本方法

以Gradisar等（2000）[5]的方法為基礎。取1 ml粗酶液，加入2.0 ml 0.05 mol/l Tris-HCl緩沖液(pH值7.5)，然后加入10 mg羽毛粉，在40℃恒溫水浴鍋中反應1 h（定時取出用力振蕩），加入2.0 ml 10%的三氯乙酸（TCA）終止反應。6 000 r/min離心20 min，取上清液于OD280nm下測定吸光值。采用保溫前添加TCA的反應管作為對照。一個酶活單位U定義為在特定反應條件下OD280nm吸光值升高0.01為1unit(U)。

1.2.4 角蛋白酶酶活測定條件的研究

以測定波長（取260～300 nm的范圍，每隔2 nm作為一個水平）、物質添加順序(以底物S、酶E、三氯乙酸TCA、Tris-HCl緩沖液的不同排列設置6個不同處理)、底物粒度（0、20、40、60、80目）、底物添加量（5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg）、振蕩頻率（30、20、15、10、5 min）、緩沖液pH值（在6～10的pH值范圍取不同值）、酶促反應溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）、酶促反應時間（15、30、45、60、75、90、105、120 min）、酶液的制備方式（濾紙過濾后離心、直接離心、超聲破碎處理）等9個因素作為研究對象，分別進行試驗，測定各因素條件下的角蛋白酶酶活。

1.3 原始方法測定蛋白酶酶活值

試驗前期以Gradisar等[5]的方法為原始方法，測得蛋白酶酶活值為16.5 U，與本研究結論做比照。

2 結果與分析

2.1 測定波長的選擇

目前角蛋白酶酶活測定中，出現(xiàn)許多同波長不同底物，同底物不同波長等混亂現(xiàn)象[6-9]。這是造成不同結果之間難以進行比較的原因之一。本試驗以10 mg 20目的羽毛粉為底物，在260～300 nm的波長范圍內，按1.2.3中的方法測定同一酶液酶活，繪制波長對吸光度的曲線，結果如圖1。由圖1可知，酶活測定的吸光值隨著測定波長的增加先增加后逐漸變小，在280 nm時有最大吸收，因此選定280 nm作為角蛋白酶酶活測定的波長。

圖1 波長對酶活測定的影響

2.2 試劑添加順序對酶活測定的影響

將底物（S）、酶（E）、Tris-HCl緩沖液（T）按不同的排列順序（ETS代表先添加酶，再向酶液中加Tris-HCl緩沖液，最后向反應體系中加入底物，其他依次類推）組成酶活測定體系，按1.2.3中的方法測定酶活，結果見圖2。

由圖2可知，不同的試劑添加順序對酶活測定結果有較明顯影響，按TSE的順序，即先向反應體系中加入Tris-HCl緩沖液，再將底物加入到緩沖液中，最后加入酶的順序測得酶活最高。這可能是受酶和底物空間臨近效應的影響，緩沖液可以有效的保持酶空間結構不被破壞，從而保持酶的催化活性[10]。羽毛粉底物或反應容器直接與酶接觸都會在一定程度上影響和破壞酶分子的空間結構，從而使酶的活性下降。ETS酶活很低可能由于在緩沖液加入前，容器壁與酶長時間接觸影響了酶的活性，EST和SET則可能是表面粗糙的羽毛粉底物與酶直接作用，影響或破壞了酶的空間結構。只有先讓緩沖液將底物以及反應容器接觸面充分浸潤后再加入酶，酶才能保持和發(fā)揮最大的催化活性。

圖2 試劑添加順序對酶活的影響

2.3 底物粒度對酶活測定的影響

以未經(jīng)粉碎處理的羽毛做對照，用20、40、60、80目的羽毛粉做底物，試劑添加順序為TSE，按1.2.3中的方法測定不同粒度下角蛋白酶酶活，結果如圖3所示。

圖3 羽毛粉粒度對酶活的影響

粒度不同的物質其表面積大小也不同，粒度通過影響底物與酶分子作用的表面積，從而影響酶的催化效率。由圖3可以看出，未經(jīng)處理的羽毛由于粒度較大，酶作用的有效表面積較小，加之羽毛的空間結構未被破壞所以酶很難發(fā)揮作用。相比之下羽毛粉的粒度小，相對表面積大，可以有效地被酶降解，但粒度過小（超過40目），雖然表面積增大，但由于羽毛粉的沉積與漂浮作用加強，反而使有效作用的底物離子數(shù)目減少。

2.4 底物添加量對酶活測定的影響

米氏方程表達了酶反應速度與底物濃度之間的定量關系。在測定酶活時，一般選擇底物飽和以滿足酶活測定的零級動力學條件[11]。在底物飽和的條件下，酶活才正比于酶的濃度，而與底物濃度無關，此時酶促反應的速度達到最大，為零級反應。用同一酶液，按TSE的試劑添加順序，分別向反應體系中加入不同重量粒度為40目的羽毛粉進行反應，研究底物添加量對酶活測定的影響，結果如圖4所示。

圖4 底物添加量對酶活的影響

由圖4可知，在底物量低于45 mg時，測得的酶活值隨底物添加量的增加而增大，此時酶沒有被底物所飽和，反應速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級反應；當?shù)孜锾砑恿窟_到45 mg時，酶活不再增加，表明酶已被底物飽和，反應速度達到最大，表現(xiàn)為零級反應，酶活趨于極限值。所以45 mg羽毛粉是準確測定角蛋白酶酶活的適宜底物濃度。

2.5 振蕩對酶活測定的影響

在測定角蛋白酶酶活時，究竟以間隔多長時間進行振蕩最適合酶活測定未見報道。為此，本試驗設置了不同的振蕩間隔時間以代表不同的振蕩反應體系，并以不振蕩的處理做對照，代表靜止反應體系來研究振蕩對酶活測定的影響，結果見圖5。

振蕩可以使羽毛粉底物均勻地分散在反應體系中，便于酶分子與底物的充分結合，從而在一定程度上利于酶促反應的進行。由圖5可知，與靜止體系相比，振蕩反應體系確實有利于酶促反應的進行，但不同振蕩頻率之間所測酶活大小并無太顯著的差別，說明振蕩頻率不是影響角蛋白酶酶活測定的顯著因素，在沒有振蕩設備提供下，可以將反應容器定時取出，人工振蕩即可滿足酶活測定的要求。本試驗中每隔15 min進行振蕩酶活最高，故選擇間隔15 min作為最適振蕩頻率。

圖5 振蕩次數(shù)對酶活的影響

2.6 緩沖液pH值對酶活測定的影響

角蛋白酶的最適反應pH值以中性到堿性居多，一般為7～10之間，酸性角蛋白酶比較少。本試驗在6～10的pH值范圍取不同值，以45 mg過40目篩的羽毛粉做底物，按TSE的順序添加試劑，每隔15 min進行振蕩，在40℃下分別測定不同pH值下的角蛋白酶酶活，結果見圖6。

反應體系的pH值可以影響底物、酶分子的活性部位以及中間絡合物（ES）等相關集團的解離狀態(tài)，進而對酶的催化反應產(chǎn)生影響，反應體系過酸或過堿可以使酶的空間結構破壞，引起酶構象的改變和酶活性的喪失。由圖6可知，pH值在8.5～9.1間酶活較高，而在酸性范圍內酶活較低。緩沖液的最適pH值為8.8。

圖6 緩沖液pH值對酶活的影響

2.7 反應溫度對酶活的影響

不同來源的角蛋白酶其作用的最適溫度存在較大的差異，一般都在40～60℃間，目前測定時采用的溫度有37、40、50、55 ℃等。本試驗以45 mg過40目篩的羽毛粉做底物，緩沖液pH值為8.8，按TSE的順序添加試劑，每隔15 min進行振蕩，分別在不同溫度條件下反應1 h，測其酶活結果如圖7。

由圖7可知，開始時隨著反應溫度的上升酶活性值也在不斷增大，45℃時酶活達到最大值，之后，隨著溫度上升酶活迅速下降，因此酶的最適溫度為45℃。

圖7 溫度對酶活的影響

2.8 反應時間對酶活的影響

本試驗測定了不同反應時間下的酶活值，繪成曲線，結果如圖8所示。

圖8 反應時間對酶活的影響

由圖8可以看出，在15～60 min內曲線基本為一條直線，其斜率代表初速度，按理論可以取15～60 min之內的任何時間[12]，但如果時間過短，則誤差比較大，且根據(jù)酶活測定的一般原則，測酶活時除了選擇底物飽和以消除底物濃度對分析結果的影響外，還應盡可能地延長線性反應的時間[11]，但反應時間過長，經(jīng)濟性較差。因此綜合考慮選擇60 min作為酶活測定的最適反應時間。

2.9 酶液的制備方式對酶活測定的影響

2.9.1 過濾與離心對酶活測定的影響

用直接離心、直接濾紙過濾、過濾后再離心三種方法制備粗酶液，并分別測其酶活，每個處理3個平行，研究不同酶液制備方法對酶活的影響，結果如圖9所示。

圖9 酶制備方式對酶活的影響

由圖9可知，直接離心制備的酶液活性相對較高，這是因為高速離心不但可以將酶從含羽毛殘渣和細菌菌體的發(fā)酵液中有效分離出來，而且離心是在4℃相對較低的溫度下快速進行，使酶的活性得以很好保持；濾紙過濾或過濾后再離心制得的酶活性要低于直接離心制備的酶，原因可能是，一方面濾紙過濾是在室溫下進行，且由于發(fā)酵液中殘渣物的阻礙，過濾需要相對較長的時間才能完成，使酶長時間暴露在不適的溫度下對酶活造成影響；另一方面，濾紙過濾效果不佳，制得的酶液中可能含有相對較多的菌體細胞及其它雜質，影響酶的純度。所以就方便性和效果而言，采用直接高速離心制備酶液的方法最好。

2.9.2 超聲處理對酶活的影響

本試驗設置不同的超聲功率，分別處理30 s,以無超聲處理的做對照，測定直接離心制備的粗酶液酶活，結果如圖10所示。

圖10 超聲功率對酶活的影響

由圖10可知，用40、80、120 W的超聲波處理發(fā)酵液制得酶液的酶活均比未經(jīng)過超聲處理的對照組高，這說明該菌株所產(chǎn)的酶屬于胞內胞外混合型酶，40 W時酶活最高，之后隨著超聲功率的增大酶活性反而降低，超過160 W時酶活已低于對照，這主要因為隨著超聲功率的增大，超聲對酶分子的破壞力也在增大。

3 結論

①試劑添加順序、底物粒度大小、底物添加量、反應溫度、pH值以及超聲處理等因素對酶活測定結果具有較大影響，振蕩頻率和粗酶液制備方式對測定結果影響不大。

②以羽毛粉為底物，測定角蛋白酶酶活的最佳測定條件和步驟為：發(fā)酵液用40 W的超聲波處理30 s后直接在4℃下，10 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液；按順序依次向反應容器內加入2 ml pH值8.8的Tris-HCl緩沖液、45 mg粒度為40目的羽毛粉底物和1 ml酶液，混合均勻后在45℃恒溫水浴鍋中反應1 h（每隔15 min取出用力振蕩），加入2.0 ml 10%的三氯乙酸（TCA）終止反應。6 000 r/min離心20 min，取上清液于OD280nm下測定吸光值。采用保溫前添加TCA的反應管作為對照。經(jīng)驗證此方法測得的酶活值為34.8 U，而原始方法測得的酶活值為16.5 U，約是原始方法測定值的2.1倍。