楊柳，李勝友，黃宏靚

(廣東藥科大學(xué) 1.中藥學(xué)院； 2.生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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防癌茶方3種中藥多糖及其復(fù)合多糖的抗氧化活性研究

楊柳1，李勝友2，黃宏靚2

(廣東藥科大學(xué) 1.中藥學(xué)院； 2.生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的 提取枸杞多糖(LBP)、黃芪多糖(APS)、紅棗多糖(ZJP)，混合制成復(fù)合多糖(PM)，研究3種多糖及復(fù)合多糖的抗氧化作用。方法 進行DPPH 自由基清除、超氧陰離子自由基清除、羥基自由基清除能力檢測。建立H2O2氧化損傷的人正常肝細胞(L-O2)和人肝癌細胞(HepG2)模型，多糖與損傷細胞共孵育后使用MTT法檢測細胞活力，評價多糖對細胞抗氧化損傷活性。H2O2氧化損傷L-O2和HepG2細胞后檢測丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)活性。結(jié)果 4種多糖均具有一定的抗氧化活性，但弱于相同濃度的抗壞血酸(VC)。在H2O2氧化損傷的細胞模型中，復(fù)合多糖顯示了在較低濃度即具有良好的保護作用，在質(zhì)量濃度分別為80 μg/mL和160 μg/mL時，L-O2細胞和HepG2細胞存活率最高。4種多糖均能顯著降低氧化損傷細胞的MDA水平，細胞SOD和GSH-Px活力均顯著升高。結(jié)論 枸杞多糖、黃芪多糖、紅棗多糖及其復(fù)合多糖均具有一定的抗氧化作用，較低濃度的復(fù)合多糖對氧化損傷的細胞有更好的保護作用。

多糖；復(fù)合多糖；抗氧化活性

中藥活性多糖(polysacharide) 是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高分子化合物，可清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化的活性，具有保護生物膜和延緩衰老等作用[1]。研究表明，多種中藥多糖復(fù)合作用時，抗氧化效果比單種中藥多糖更佳，藥理作用呈現(xiàn)協(xié)同性[2]。肝臟是人體重要的代謝器官，活性氧自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激是多種肝病發(fā)病的共同病理生理基礎(chǔ),在各種慢性肝病的形成和發(fā)展過程中起重要作用[3]。因此，建立一種可靠的肝細胞損傷模型，有助于評價中藥活性成分的抗氧化活性[4]。

由黃芪、枸杞、紅棗組成的茶方是傳統(tǒng)的防癌茶方，具有增強和調(diào)節(jié)免疫力之功效[5]。其中黃芪味甘性微溫、益氣固表、補氣養(yǎng)血。枸杞味甘性平、補腎益精、補血安神。紅棗味甘性溫、補中益氣、養(yǎng)血安神。實驗室在前期不同種類中藥多糖及其復(fù)方多糖的抗氧化研究基礎(chǔ)上，按照傳統(tǒng)防癌茶方的組成，選擇了枸杞多糖(LBP)、黃芪多糖(APS,)、紅棗多糖(ZJP)及前述3種多糖的復(fù)合多糖(PM)，進行體外抗氧化活性評價。同時，選擇人正常肝細胞L-O2及人肝癌細胞HepG2這兩種細胞模型進行抗氧化評價，比較單種中藥多糖和復(fù)合多糖的抗氧化活性，為中藥復(fù)合多糖的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞(產(chǎn)地：寧夏，批號：160801)、黃芪(產(chǎn)地：甘肅，批號：160801)、紅棗(產(chǎn)地：新疆，批號：160701)均購自廣州至信中藥飲片有限公司，由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院嚴寒靜教授鑒定分別為茄科植物枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實，豆科植物黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. Var. mongholicus (Bge.) Hsiao 的干燥根，鼠李科植物棗ZiziphusjujubaMill. 的干燥成熟果實；95%(φ)乙醇、三羥甲基氨基甲烷(廣州化學(xué)試劑廠)；1,1-二苯-2-苦基肼(上海麥克林生化科技有限公司)；抗壞血酸VC(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：F1517002)；MTT(噻唑藍)(Sigma 公司，批號：M7905)；丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(批號分別是041916160906、063216160808、042916160912，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA)；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；UV-2500紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；Multi-scan Mk 3酶標儀、Thermo 311 CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo)。

1.3 方法

1.3.1 多糖的制備 將待提取的枸杞、黃芪、紅棗藥材分別洗凈、烘干、粉碎為粗粉。按一定料液比熱水浸提，經(jīng)離心、濃縮、醇沉、Sevage 法[6]除蛋白、透析3 d后，冷凍干燥得多糖樣品。參照汪琢等[7]的方法提取LBP；參照郭會清等[8]的方法提取APS；參照李銘芳等[9]的方法提取ZJP。

1.3.2 復(fù)合多糖的制備 按上述制備的枸杞、黃芪、紅棗多糖根據(jù)傳統(tǒng)防癌茶方的質(zhì)量配比黃芪∶紅棗∶枸杞 (4∶3∶3)，構(gòu)成復(fù)合多糖。

1.3.3 DPPH清除率測定 參照文獻[10],制成質(zhì)量濃度分別為1、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL的樣品溶液和VC溶液，以VC作陽性對照。DPPH自由基清除率由式(1)計算：

(1)

(1)式中，Ac為DPPH乙醇溶液與蒸餾水混合吸光值；Aj為乙醇和多糖溶液的吸光值；Ai為DPPH乙醇溶液和多糖溶液的吸光值。

1.3.4 ·OH清除率測定 參照文獻[11]，配制成如上樣品溶液和VC溶液。羥自由基清除率由式(2)計算：

(2)

(2)式中，As為不同多糖質(zhì)量濃度下的吸光值；Ac為不加水楊酸時提取液的吸光值,Ao為不加樣品時提取液的吸光值。

1.3.5 對超氧陰離子自由基的清除率測定 參照文獻[12],配制成如上樣品溶液和VC溶液。清除超氧陰離子自由基的能力由式(3)計算：

(3)

(3)式中，Ai為樣品溶液的吸光值，Ao為相同體積的蒸餾水代替樣品溶液的吸光值。

1.3.6H2O2誘導(dǎo)細胞損傷模型的建立L-O2和HepG2細胞以1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度H2O2溶液，放入培養(yǎng)箱反應(yīng)4h后，用MTT法測定細胞存活率。實驗設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次實驗，按公式(4)計算細胞存活率。

(4)

1.3.7 多糖最佳保護濃度的篩選 同“1.3.6”項進行L-O2和HepG2細胞接種，設(shè)置正常對照組、H2O2損傷組、多糖保護組。正常對照組、H2O2損傷組在含10%(φ)的胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，細胞多糖保護組分別加入終質(zhì)量濃度為40、80、160、320、640、1 280 μg/mL的LBP、APS、ZJP及PM培養(yǎng)液處理。24 h后，H2O2損傷組和多糖保護組均加入100 mL終濃度分別為5 μmol/L和50 μmol/L H2O2損傷4 h，正常組加入等量的培養(yǎng)液處理4 h。然后用MTT法測定，按公式(4)計算細胞存活率。

1.3.8 MDA含量測定、SOD和GSH-Px活力檢測 設(shè)置對照組，H2O2損傷組和篩選出的4種最佳多糖保護濃度組，方法同“1.3.7”項，根據(jù)試劑盒說明書檢測并計算MDA含量、SOD活力和GSH-Px活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 LBP、APS、ZJP、PM對DPPH自由基的清除率

如圖1所示，4種多糖隨著濃度的增加，對DPPH自由基的清除率先升高后降低，清除率均小于同濃度條件下的VC溶液。當PM質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時，相較于其他多糖有較強的清除作用。質(zhì)量濃度在0.4～1 mg/mL的LBP的清除率高于其他多糖組?？梢?種多糖具有明顯清除DPPH自由基的能力。

圖1 4種多糖對DPPH自由基的清除作用(n=4)

Figure 1 Scavenging activities of four polysaccharides on DPPH radicals

2.2 LBP、APS、ZJP和PM對·OH自由基的清除率

圖2顯示，在所選范圍內(nèi)， LBP、ZJP和PM隨著濃度的升高，對·OH自由基的清除率先升高后降低。APS隨著濃度升高，清除·OH自由基能力不斷增強。4種多糖對·OH自由基的清除率均小于同濃度條件下的VC溶液對·OH自由基的清除率。質(zhì)量濃度在0.2～0.4 mg/mL時，ZJP對·OH自由基有較強的清除作用。質(zhì)量濃度在0.6～0.8 mg/mL時， LBP有較強的清除作用。APS在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時清除·OH自由基能力最強。PM清除·OH自由基能力在0.4 mg/mL以上濃度顯示相近活性。

圖2 4種多糖對·OH自由基清除作用(n=4)

Figure 2 Scavenging activities of four polysaccharides on hydroxyl radicals

2.3 LBP、APS、ZJP和PM對O2-·自由基的清除率

圖3顯示，在所選范圍內(nèi)， LBP、ZJP和PM隨著濃度的升高，清除O2-·自由基的能力先強后弱。APS隨著濃度升高，清除O2-·自由基能力不斷增強。4種多糖對O2-·自由基的清除率均小于同濃度條件下的VC溶液對O2-·自由基的清除率。質(zhì)量濃度在0.2～0.6 mg/mL和1 mg/mL時， LBP清除作用最強。質(zhì)量濃度在0.8 mg/mL時，PM清除能力最強。

Figure 3 Scavenging activities of four polysaccharides on superoxide anion radicals

2.4 多糖對L-O2和HepG2細胞最佳保護濃度篩選結(jié)果

濃度為5 μmol/L的H2O2作用于L-O2細胞4 h，細胞存活率為(40.4%±2.16)%,此時細胞出現(xiàn)一定損傷，選擇此濃度的H2O2作用4 h建立L-O2細胞氧化損傷模型。如圖4所示， LBP、APS、ZJP的最佳保護濃度分別為160、40、80 μg/mL。當PM質(zhì)量濃度為80 μg/mL時，細胞存活率為86.9%，達到最高，說明較低濃度的PM即可達到對氧化損傷的L-O2細胞較強的保護作用。

圖4 4種多糖對L-O2細胞的抗氧化作用(n=4)

Figure 4 Antioxidant activity of four polysaccharides in L-O2 cells

濃度為 50 μmol/L的H2O2作用于HepG2細胞4 h，細胞存活率為(51.9±1.89)%,選擇此濃度的H2O2作用4 h建立HepG2細胞氧化損傷模型。由圖5可知， LBP、APS、ZJP的最佳保護濃度分別為160、320、160 μg/mL。在質(zhì)量濃度40～320 μg/mL的范圍內(nèi)，PM的細胞存活率明顯高于其他多糖組。質(zhì)量濃度為160 μg/mL時，細胞存活率為78.4%，達到最高，由此說明PM對氧化損傷的HepG2細胞在較低濃度即顯示了較強的保護作用。

圖5 4種多糖對HepG2細胞的保護作用(n=4)Figure 5 Antioxidant activity of four polysaccharides in HepG2 cells

2.5 體外細胞抗氧化指標檢測

如表1、表2所示，H2O2損傷L-O2細胞、HepG2細胞,H2O2模型組與正常組相比，MDA 水平顯著升高，SOD和GSH-Px活力顯著降低。4種多糖保護組與模型組相比，均能顯著降低兩種細胞MDA水平，細胞的SOD和GSH-Px活力均顯著升高。在L-O2細胞模型中，PM的SOD和GSH-Px活力達到最高值，比單種多糖抗氧化作用更明顯。在HepG2細胞中，4種多糖的MDA水平和SOD活力接近，但PM的GSH-Px有明顯活力，達到最高值。

表1 多糖對L-O2細胞中MDA含量、SOD和GSH-Px活性影響

與正常組比較：△P<0.05； 與模型組比較：*P<0.05。

表2 多糖對HepG2細胞中MDA 含量、SOD和GSH-Px活性影響

與正常組比較：△P<0.05； 與模型組比較：*P<0.05。

3 討論

人類多種疾病與體內(nèi)過剩氧自由基(ROS)有關(guān)[14]。研究者發(fā)現(xiàn)自由基反應(yīng)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程密切相關(guān),在復(fù)雜的癌變過程中,自由基可能起重要作用。中藥多糖能夠清除和平衡多種活性氧自由基，減少自由基對人體的損傷，與化學(xué)合成藥品比較，中藥多糖具有無毒、生物相容性良好等優(yōu)點[15-16]。

在前期多種中藥多糖抗氧化活性研究基礎(chǔ)上，按照傳統(tǒng)防癌茶方的組成，分別提取枸杞、黃芪和紅棗的多糖成分，對單味中藥多糖與復(fù)合中藥多糖的抗氧化活性進行研究，結(jié)果表明4種多糖在清除DPPH自由基、·OH、O-2自由基等一系列檢測中，顯示了明顯的抗氧化活性。進一步通過H2O2氧化損傷肝細胞模型評價多糖的抗氧化活性，結(jié)果顯示，在正常肝細胞L-O2細胞和肝腫瘤細胞HepG2細胞氧化損傷模型中，PM濃度分別為80、160 μg/mL時，兩種模型的細胞存活率達到最高，與其他單味多糖相比，低濃度的PM在正常肝細胞即表現(xiàn)出更強的抗氧化活性，同時4種多糖處理兩種氧化損傷細胞后，細胞MDA下降，SOD和GSH-Px活力顯著升高。因此推測多糖可能通過提高 SOD 和GSH-Px活性，降低MDA含量，減少氧化應(yīng)激對細胞的損傷，從而發(fā)揮抗氧化作用[17]。

實驗結(jié)果表明，防癌茶方PM在體外抗氧化活性略低于單種多糖，但在細胞模型抗氧化活性評價中在較低濃度即顯示出較強的抗氧化能力，尤其在正常肝細胞中PM抗氧化活性更明顯。上述結(jié)果提示PM被細胞攝取后有利于細胞抗氧化能力的提高，這為中藥PM開發(fā)作為良好抗氧化活性物質(zhì)提供一定的依據(jù)，但其抗氧化作用機制還有待在今后的動物實驗中進一步驗證。

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(責任編輯：幸建華)

Effect of three kinds of Chinese medicine polysaccharides and their compound polysaccharide on antioxidant activity

YANG Liu1,LI Shengyou2,HUANG Hongliang2

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofBioscienceandBiopharmaceutical,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective To study the antioxidant activity of polysaccharides from Lycium barbarum (LBP),Astragalus (APS),Ziziphus jujube (ZJP) and their compound polysaccharide (PM). Methods Antioxidant activity is evaluated by scavenging DPPH free radical,hydroxyl free radical and superoxide anion free radical. L-O2 cells (human normal liver cells) and HepG2 cells (human liver cancer cells) were damaged by H2O2,then the antioxidant activity of polysaccharides in L-O2 cells and HepG2 cells was detected by MTT assay. The levels of MDA,SOD and GSH-Px were detected. Results Four kinds of polysaccharides showed the antioxidant activity but lower than VCinvitro. The cell viability was the highest in L-O2 and HepG2 cells when treated with the compound polysaccharide at 80 μg/mL and 160 μg/mL,respectively. Four polysaccharides reduced MDA content and increased SOD and GSH-Px activities in cells. Conclusion LBP,APS,ZJP and PM show antioxidant activity,especially PM at the lower concentration,in cells when damaged by H2O2.

polysaccharide; the mixture of polysaccharide; antioxidant activity

2016-10-08

廣東省教育廳優(yōu)秀人才培育基金(2050205F5504)

楊柳(1990—)，女，2014級碩士研究生，從事中藥活性成分研究，Email：2208954369@qq.com；通信作者：黃宏靚(1974—)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物技術(shù)藥物研究，Email：hhongliang@163.com。

時間：2016-11-29 10:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161129.1000.003.html

R285.5

A

1006-8783(2016)06-0752-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016100801