劉歡，楊周萍，金桂芳，王桂香，潘雪刁

(1.廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.三九腦科醫(yī)院 藥劑科，廣東 廣州 510510)

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芹菜素對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的影響及機(jī)制研究

劉歡1，楊周萍2，金桂芳1，王桂香1，潘雪刁1

(1.廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.三九腦科醫(yī)院 藥劑科，廣東 廣州 510510)

目的 探討芹菜素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖及葡萄糖攝取的影響及其可能的內(nèi)在機(jī)制。方法 采用MTT法檢測(cè)不同劑量不同作用時(shí)間芹菜素對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響；采用葡萄糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)芹菜素對(duì)SGC-7901細(xì)胞葡萄糖攝取量的影響；蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)芹菜素作用SGC-7901細(xì)胞后，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GLUT1)和己糖激酶Ⅱ(HKⅡ)表達(dá)水平的影響。結(jié)果 芹菜素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901具有增殖抑制作用，并具有一定的劑量和時(shí)間依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；芹菜素干預(yù)后的SGC-7901細(xì)胞的葡萄糖攝取量明顯減少，芹菜素10 μmol/L和20 μmol/L組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；一定劑量的芹菜素能下調(diào)SGC-7901細(xì)胞中GLUT1、HKⅡ蛋白的表達(dá)水平，具有一定的時(shí)間和劑量依賴性。結(jié)論 芹菜素能抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖和葡萄糖攝取的作用，其機(jī)制可能與調(diào)控GLUT1、HKⅡ蛋白表達(dá)水平有關(guān)，為臨床胃癌的診斷和治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。

芹菜素； 人胃癌SGC-7901細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 葡萄糖攝取

胃癌是源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)其惡性程度排名第5，其發(fā)病率排名第3[1]。目前臨床上針對(duì)早期胃癌根治的方法仍是手術(shù)切除術(shù)[2]。但是早期胃癌的臨床癥狀多不明顯，容易造成延誤診治，大多數(shù)屬于晚期腫瘤，術(shù)后5年生存率維持在30%左右[3]。目前內(nèi)科治療方案主要以一線聯(lián)合化療(如：順鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶)為主，但是受疾病本身的特點(diǎn)及治療效果有限，接受二線治療的患者甚少[4]。故需找到高效、安全的抗胃癌方案十分重要。

芹菜素(apigenin，API)是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜和水果中，具有多種藥理作用，如抗炎、抗氧化、降血壓、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、中樞鎮(zhèn)靜作用等[5]。近年來(lái)研究表明芹菜素還具有普遍的抗腫瘤作用，對(duì)乳腺癌[6]、膀胱癌[7]、前列腺癌[8]等都有顯著的抑制作用。有文獻(xiàn)報(bào)道芹菜素具有誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]，但是芹菜素對(duì)于胃癌細(xì)胞糖代謝影響的報(bào)道罕見。本實(shí)驗(yàn)研究了芹菜素作用SGC-7901細(xì)胞后，其細(xì)胞增殖及葡萄糖攝取量的變化及其可能相關(guān)的機(jī)制，為芹菜素抗胃癌活性的研究提供新思路。

1 材料與儀器

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞SGC-7901購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。芹菜素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，阿拉丁)；RPMI-1640 培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone，批號(hào)：AAG204845)；胎牛血清(美國(guó) Gibco，批號(hào)：41Q6531K);青鏈霉素雙抗(美國(guó)Gibco，批號(hào)：1491907);0.25%含EDTA的胰酶(美國(guó) Gibco，批號(hào)：1715701)；PBS粉(鼎國(guó)生物公司)；葡萄糖檢測(cè)試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：361500)；MTT(Genview，批號(hào)：36200204100)；Anti-GLUT1一抗、β-actin一抗、Anti-HKⅡ一抗、羊抗鼠-HRP 二抗、羊抗兔-HRP二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；其余試劑(分析純)均購(gòu)于廣州試劑。

1.2 主要儀器

371型恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific)；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)；680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad)；5424R高速微量冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)；ME204E電子分析天平(美國(guó)Mettler Toledo)；PowerPacTMBasic垂直電儀泳儀(美國(guó)Bio-Rad)。

2 方法

2.1 體外細(xì)胞培養(yǎng)

將SGC-7901 細(xì)胞以適宜密度接種于T25規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，其中含有5 mL RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，體積比為10%的胎牛血清，100 U/mL 的青霉素和鏈霉素。細(xì)胞于37 ℃，5%(φ)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)開始傳代，PBS洗凈培養(yǎng)基，1 mL 2.5%含EDTA的胰酶進(jìn)行消化，含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞形成細(xì)胞懸液，2 000 r/min 離心2 min得細(xì)胞沉淀，加入適量含血清培養(yǎng)基混勻，將適量細(xì)胞數(shù)種入新的培養(yǎng)瓶，加入完全培養(yǎng)基至適量。

2.2 檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞以5×104個(gè)/mL密度接種于96孔板中，分為空白對(duì)照組(無(wú)細(xì)胞組)、陰性對(duì)照組(不加藥組)、芹菜素2.5、5、10、20 μmol/L加藥組，每組6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞生長(zhǎng)24 h 后，移除完全培養(yǎng)基，加藥組依次加入含不同濃度芹菜素的無(wú)血清培養(yǎng)基，空白組和陰性對(duì)照組加入等體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24、48、72 h后，避光加入 10 μL/孔 MTT(5 mg/mL)溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h，移棄上清，加入150 μL/孔的二甲基亞砜，水平搖床上100 r/min震蕩10 min充分溶解甲瓚結(jié)晶，波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)各孔的吸光度A。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞存活率(%)=100-(陰性對(duì)照組A-加藥組A)/(陰性對(duì)照組A-空白對(duì)照組A)

2.3 葡萄糖攝取量的檢測(cè)

選用對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SGC-7901細(xì)胞按5×104個(gè)/mL密度接種于96孔板中，設(shè)置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、芹菜素不同濃度組。用終濃度為2.5、5、10、20 μmol/L芹菜素分別處理 24、48、72 h 后，收集所有組別培養(yǎng)基上清液，根據(jù)葡萄糖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書要求操作，運(yùn)用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)505 nm處檢測(cè)樣品吸收度。以空白對(duì)照組為葡萄糖總量，分別計(jì)算不同組別的葡萄糖消耗量，再將加藥組的葡萄糖消耗量與陰性對(duì)照組比較，觀察芹菜素不同劑量不同作用時(shí)間對(duì)SGC-7901細(xì)胞葡萄糖攝取量的影響。

2.4 GLUT1、HKⅡ蛋白表達(dá)的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SGC-7901細(xì)胞按5×106個(gè)/mL 密度接種于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，分別設(shè)陰性對(duì)照組、芹菜素作用組(2.5、5、10、20 μmol/L)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度約70%～80%時(shí)棄去培養(yǎng)基，加藥組加入不同濃度芹菜素(對(duì)照組加等體積的無(wú)血清培養(yǎng)基)，培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞，加入適量蛋白裂解液冰上裂解，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞并收集，4 ℃，12 000 r/min離心的細(xì)胞總蛋白上清，按BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白定量，每泳道蛋白上樣量為50 μg，8%SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃孵育Anti-GLUT1一抗(1∶1 000)、Anti-HKⅡ 一抗、Anti-β-actin一抗過夜。棄一抗，TBST洗膜3次，8 min/次，室溫孵育羊抗兔-HRP二抗(1∶10 000)、羊抗鼠-HRP二抗(1∶5 000)1 h。棄二抗，TBST洗膜3次，8 min/次。暗室中在PVDF膜上孵ECL發(fā)光液，根據(jù)熒光強(qiáng)度選擇X膠片合適的曝光時(shí)間，并顯影、定影。運(yùn)用Image J軟件處理膠片中條帶的灰度值。以各組灰度面積的乘積/內(nèi)參(β-actin) 灰度面積的乘積反映蛋白相對(duì)表達(dá)豐度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 芹菜素對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

和陰性對(duì)照組相比，不同濃度的芹菜素作用SGC-7901細(xì)胞后，細(xì)胞增殖出現(xiàn)不同程度的抑制作用，且呈一定的時(shí)間和劑量依賴性。除24 h低濃度的芹菜素組別外，其余組相比對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

3.2 芹菜素對(duì)SGC-7901細(xì)胞葡萄糖攝取量的影響

相比陰性對(duì)照組，芹菜素干預(yù)組的SGC-7901細(xì)胞葡萄糖攝取量呈現(xiàn)不同程度的抑制作用，且10、20 μmol/L的芹菜素組的抑制效果與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見圖1。

3.3 芹菜素對(duì)SGC-7901細(xì)胞糖代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

不同濃度芹菜素干預(yù)SGC-7901細(xì)胞48 h后，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芹菜素具有下調(diào)GLIUT1、HKⅡ蛋白的表達(dá)水平，并具有一定的劑量依賴性；選用10 μmol/L芹菜素作為最佳干預(yù)濃度作用不同時(shí)間發(fā)現(xiàn)GLUT1和HKⅡ蛋白的表達(dá)水平均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，結(jié)果見圖2，說(shuō)明芹菜素對(duì)于胃癌細(xì)胞SGC-7901糖代謝的影響可能與這些蛋白的表達(dá)改變有關(guān)。

A. SGC-7901細(xì)胞活性； B. SGC-7901細(xì)胞葡萄糖攝取量；與陰性對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖1 不同濃度芹菜素作用不同時(shí)間對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖及葡萄糖攝取量的影響

Figure 1 Effect of apigenin on the cell proliferation and glucose uptake of SGC-7901 cells with different concentrations and times

A、B. 不同濃度芹菜素對(duì)SGC-7901細(xì)胞株的HKⅡ、GLUT1蛋白表達(dá)的影響； C、D. 10 μmol/L芹菜素作用SGC-7901細(xì)胞株不同時(shí)間HKⅡ、GLUT1蛋白表達(dá)的變化；與陰性對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖2 芹菜素對(duì)SGC-7901細(xì)胞株HKⅡ、GLUT1蛋白表達(dá)的影響

Figure 2 Effect of apigenin on the expression of GLUT1 and HKⅡ in SGC-7901 cells

4 討論

在能量代謝方面，正常細(xì)胞所需的能量主要是由線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP提供，而腫瘤細(xì)胞主要以糖酵解途徑供能[10]。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞對(duì)于葡萄糖的攝取利用十分活躍，腫瘤細(xì)胞的能量異常代謝稱為瓦伯格效應(yīng)。抑制瓦伯格效應(yīng)可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，近年來(lái)能量代謝方面已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)備受關(guān)注。

與糖代謝相關(guān)的酶類則成為糖代謝靶向抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)之一，其中在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中差異表達(dá)的有GLUT1、HK Ⅱ等。腫瘤細(xì)胞對(duì)于葡萄糖的大量攝取主要依賴于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的高表達(dá)，而己糖激酶是糖酵解途徑中重要的限速酶[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道GLUT1、HK Ⅱ在胃癌組織的表達(dá)高于癌旁組織，且在中晚期癌癥存在高于早期[12]。這些蛋白在癌癥的發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用。

芹菜素是一種黃酮類單體，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外大量研究表明其具有抗腫瘤作用。在胰腺癌、卵巢癌、肺癌等癌癥中，芹菜素均具有下調(diào)GLUT1蛋白表達(dá)水平的作用[13-15]。而關(guān)于芹菜素抑制胃癌細(xì)胞GLUT1、HKⅡ蛋白表達(dá)的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果顯示芹菜素具有明顯抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖作用，與報(bào)道芹菜素具有選擇性抑制胃癌細(xì)胞活性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡結(jié)果一致，表明芹菜素具有潛在的治療胃癌的價(jià)值。葡萄糖含量檢測(cè)結(jié)果表明芹菜素能明顯抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的葡萄糖攝取量，且隨著劑量增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用越明顯，上述結(jié)果與芹菜素影響肝癌細(xì)胞株HepG2的葡萄糖攝取的結(jié)果相似[16]。故推測(cè)芹菜素可能通過影響胃癌細(xì)胞SGC-7901的葡萄糖攝取及代謝從而抑制細(xì)胞的增殖。有研究指出，腫瘤增加的葡萄糖攝取及代謝主要依賴于GLUT1的表達(dá)及活性增加，其次是HKⅡ在內(nèi)的糖酵解途徑限速酶表達(dá)及活性的增加。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芹菜素能抑制SGC-7901細(xì)胞的葡萄糖代謝相關(guān)蛋白GLUT1和HK Ⅱ蛋白的表達(dá)水平，這可能是細(xì)胞葡萄糖攝取量及代謝減少的重要原因。本研究主要表明了芹菜素通過抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901糖代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)抑制葡萄糖的攝取及代謝，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖，其具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Effect and mechanism of apigenin on cell proliferation of human gastric cancer SGC-7901 cells

LIU Huan1,YANG Zhouping2,JIN Guifang1,WANG Guixiang1,PAN Xuediao1

(1.CollegeofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.DepartmentofPharmacy,Guangdong999BrainHospital,Guangzhou510510,China)

Objective To investigate the inhibitory effect of apigenin on cell proliferation and glucose uptake in human gastric cancer SGC-7901 cells and its underlying mechanism. Methods MTT assay was used to detect the influence of apigenin on cell proliferation of SGC-7901 cells with different times and concentrations. Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit was applied to explore the effect of apigenin on glucose uptake of SGC-7901 cells. The relative expression of GLUT1 and HKⅡ proteins in SGC-7901 cells treated with or without apigenin was measured by western blot. Results Treatment with apigenin significantly suppressed cell proliferation of SGC-7901 cells in a time- and concentration-dependent manner (P<0.05,P<0.01). The glucose uptake of SGC-7901 cells treated with apigenin was decreased and there was a statistical?difference when apigenin at 10 or 20 μmol/L in comparison with the control group (P<0.01). The expression of GLUT1 and HKⅡ was decreased in SGC-7901 cells when treated with apigenin in a time- and concentration-dependent manner. Conclusion Apigenin could inhibit the cell proliferation and glucose uptake of SGC-7901 cells,the mechanism of which may be related to modulation of the expression of GLUT1 and HKⅡ.

apigenin; human gastic cancer SGC-7901 cell; cell proliferation; glucose uptake

2016-08-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81102465)

劉歡(1990—)，女，2014級(jí)碩士研究生，Email：18825171098@163.com；通信作者：潘雪刁，女，碩士，副教授，主要從事腫瘤藥理及多肽藥物的研究，Email：panxuediao@126.com。

時(shí)間：2016-12-07 15:36

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161207.1536.001.html

R965

A

1006-8783(2016)06-0743-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016082601