吳艷婷,陳桂添,時軍,郭嘉俊

(廣東藥科大學 中藥學院,廣東 廣州 510006)

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天然藥物化學

山柰醋炙前后對甲氧基肉桂酸乙酯含量與抗感染鎮(zhèn)痛作用變化研究

吳艷婷,陳桂添,時軍,郭嘉俊

(廣東藥科大學 中藥學院,廣東 廣州 510006)

目的 比較山柰醋炙前后水提物和醇提物的抗感染鎮(zhèn)痛作用差異,同時測定提取物中對甲氧基肉桂酸乙酯的質量分數。方法 采用HPLC法測定對甲氧基肉桂酸乙酯質量分數,采用熱板法和二甲苯致小鼠耳廓腫脹法對比山柰提取物的抗感染鎮(zhèn)痛作用。結果 山柰各提取物中對甲氧基肉桂酸乙酯質量分數大小順序為醋炙醇提物>生品醇提物>醋炙水提物>生品水提物。與生理鹽水組比較,山柰提取物均能顯著抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹度(P<0.01),能不同程度地提高小鼠的痛閾值(P<0.05或P<0.01)；醋炙醇提物組的抗感染鎮(zhèn)痛作用均高于生品水提物組(P<0.05)。結論 醋炙后，山柰提取物中對甲氧基肉桂酸乙酯質量分數顯著增加,抗感染鎮(zhèn)痛作用增強,對甲氧基肉桂酸乙酯可能是山柰抗感染鎮(zhèn)痛作用藥效成分之一。

山柰； 醋炙； 抗炎鎮(zhèn)痛； 高效液相色譜法

山柰系姜科山柰屬植物山柰KaempferiagalangaL.的干燥根莖,作為一種藥食同源的傳統(tǒng)中藥,性辛、溫,有溫中化濕、散寒、行氣止痛、除濕辟穢的功效,主治胸脘脹滿、心腹冷痛、寒濕吐瀉、消化不良、風蟲牙痛、風濕關節(jié)痛、跌打損傷等證[1-3]?，F代研究表明,山柰中主要含有揮發(fā)油[4-6]、山柰酚[7]等活性成分。2015年版《中國藥典》規(guī)定山柰含揮發(fā)油不得少于4.5%。對甲氧基肉桂酸乙酯是山柰揮發(fā)油中的主要有效成分之一,具有鎮(zhèn)痛、抗感染、抗癌、抑菌、防曬等作用[8]。

中醫(yī)理論認為,醋炙能引藥入肝,具有疏肝散癖活血、理氣止痛的作用[9]。李時珍《本草綱目》記載：“治療心腹冷痛,山柰、丁香、當歸、甘草等份,為末,醋糊丸梧子大。每服三十丸,酒下,集簡方[10]?！贝送?民間多用川芎與山柰醋炙后治療膝關節(jié)骨質增生,療效良好[11-12]。本文通過比較山柰醋炙前后的鎮(zhèn)痛抗感染效果,考察醋炙前后對甲氧基肉桂酸乙酯質量分數的變化,歸納總結其量效關系,以期為醋炙山柰的抗感染鎮(zhèn)痛應用提供科學理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DIONEX Ulti Mate 3000高效液相色譜系統(tǒng)(賽默飛世爾科技中國有限公司)；RE-2000A型真空旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHE-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；202-2AB型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；PHS-25型酸度計pH計(上海雷磁儀電科學儀器有限公司)；BP211D型萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

山柰藥材(安徽歸然藥業(yè)有限公司,批號20160103,經廣東藥科大學中藥學院馬鴻雁副教授鑒定為姜科植物山柰KaempferiagalangaL.的干燥根莖)；對甲氧基肉桂酸乙酯對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號110835-201202,質量分數>98%)；老陳醋(山西四眼井釀造實業(yè)有限公司,批號20150910,總酸質量濃度以乙酸計≥5.00 g/100 mL)；對乙酰氨基酚片(成都德通藥業(yè)有限公司,批號20150806)；甲醇(色譜純,Merk KgaA)；二甲苯、冰乙酸、乙醇等均為分析純,水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級KM小鼠,體質量(20±2)g,雌雄不分,由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,許可證號SCXK(粵)2016-0002。

2 方法與結果

2.1 山柰提取物的制備

取山柰飲片適量,根據2015年版《中國藥典》醋制規(guī)范,每100 kg凈山柰藥材加入老陳醋20 kg,拌勻,悶潤至醋被吸盡后,置炒制容器內,用文火加熱炒干,取出放涼,即得山柰醋炙品。取山柰生品、山柰醋炙品各適量,粉碎成粗粉,過1號篩,分別以10倍量的蒸餾水和70%(體積分數)乙醇為溶劑,冷凝回流提取3次,前2次回流2 h,第3次回流1 h,趁熱抽濾后合并濾液,減壓回收水和乙醇至浸膏狀。生品水提組、生品醇提組、醋炙水提組、醋炙醇提組的得率分別為62.64%、18.77%、54.58%、28.63%。將所得山柰提取物密封,置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 山柰提取物中對甲氧基肉桂酸乙酯的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-質量分數0.5%(pH=2.3)磷酸水溶液(體積比60∶40)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃,進樣量：20 μL。在此條件下,對照品溶液、供試品溶液的色譜圖見圖1,對甲氧基肉桂酸乙酯的保留時間為(26.35±0.05)min,表明方法專屬性強,其他物質無干擾。

2.2.2 對甲氧基肉桂酸乙酯對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒質量的對甲氧基肉桂酸乙酯對照品2.47 mg,置5 mL量瓶中,加50%(體積分數,下同)甲醇適量,超聲30 min溶解,加50%甲醇定容至刻度,搖勻,0.22 μm微孔濾膜濾過,配制成質量濃度為494 μg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取各組別的總浸膏0.50 g,置于10 mL離心管中,加入50%甲醇適量超聲(功率70 W,溫度50 ℃,時間20 min),3 000 r/min離心30 min,收集上清液移至25 mL容量瓶中,加50%甲醇定容,搖勻,過0.22 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

2.2.4 方法學考察 精密量取“2.2.2”項配制的對甲氧基肉桂酸乙酯對照品溶液,用50%甲醇稀釋成濃度分別為4.94、9.88、14.82、19.76、29.64、34.58、39.54 μg/mL的系列標準樣品濃度,在上述色譜條件下重復進樣3次,測定峰面積,以峰面積平均值為縱坐標、質量濃度為橫坐標進行線性回歸,得線性方程為Y=1.367 7X+0.062 23,r=0.999 5,結果表明對甲氧基肉桂酸乙酯在4.94～39.54 μg/mL之間具有良好的線性關系。日內精密度、日間精密度、重復性、24 h內穩(wěn)定性試驗的RSD分別為0.13%、0.15%、0.39%、0.55%,表明儀器的精密度和重復性良好,樣品在24 h內穩(wěn)定性良好。樣品中對甲氧基肉桂酸乙酯的平均回收率為98.96%,RSD=0.72%(n=6),表明樣品的回收率符合要求。最小檢測限為12.37 ng/mL,信噪比(S/N)約為3∶1。定量限為98.50 ng/mL,信噪比(S/N)約為10∶1。

t/min200150100500-501751257525-201-26.3971-26.3221-26.3651-26.4001-26.288250200150100500-5010152025303505BACEDmAUmAUmAU

A.對甲氧基肉桂酸乙酯對照品; B.生品水提物樣品;C.生品醇提物樣品; D.醋炙水提物樣品; E.醋炙醇提物樣品。

圖1 山柰中對甲氧基肉桂酸乙酯的HPLC

Figure 1 HPLC chromatograms of Ethylp-methoxy cinnamate inKaempferiaRhizoma

2.2.5 樣品的測定 取各組別的總浸膏0.50 g,精密稱定,按“2.2.3”項下方法處理,依上述色譜條件分別測定3次,記錄峰面積,取平均值，結果測得生品水提組中對甲氧基肉桂酸乙酯的質量分數為(2.601 3±0.07)μg/g，生品醇提組為(33.541 1±1.9)μg/g，醋炙水提組為(6.109 4±0.6)μg/g，醋炙醇提組為(62.861 9±1.5)μg/g?？梢?，經醋炙后，山柰提取物中對甲氧基肉桂酸乙酯的質量分數明顯增加。

2.3 小鼠的抗感染鎮(zhèn)痛試驗

2.3.1 小鼠熱板法的鎮(zhèn)痛試驗 取健康昆明種雌性小鼠,將智能熱板儀溫度調至(55±0.5)℃,預熱10 min后,將雌性小鼠每次1只放在熱板上,小鼠自放上至出現舐左后足所需時間作為該鼠的痛閾值,將篩選合格(舔足時間在5～30 s)的雌性小鼠100只,分10組,每組10只,分別為生理鹽水組(0.2 mL/10 g)、對乙酰氨基酚陽性對照組(58 mg/kg),生品水提組、醋炙水提組、生品醇提組、醋炙醇提組各分別設高、低劑量組(按生藥計為1 750、875 mg/kg)。每組給藥前重復測定痛閾值,取2次痛閾平均值作為正常痛閾值。適應性喂養(yǎng)3 d后給藥,按不同組別進行相應藥物灌胃,每天1次,連續(xù)給藥7 d。末次給藥后分別于30、60、90 min測量小鼠的痛閾值,計算各組給藥后的痛閾提高百分率,結果以SPSS22進行組間t檢驗,多組間均數比較采用單因素方差分析,以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

結果見表1?？梢?對乙酰氨基酚、山柰提取物均能不同程度地提高熱板法疼痛模型小鼠痛閾值、減少疼痛反應次數,鎮(zhèn)痛效應與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；醋炙醇提組的鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于生品水提組(P<0.05)；生品水提組在90 min時,痛閾值提高百分率無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3.2 二甲苯致小鼠耳廓腫脹法的抗炎試驗 取健康昆明種小鼠100只,雌雄各半,分10組,每組10只,分組及給藥方式同“2.3.1”項。于末次給藥0.5 h后,將0.02 mL二甲苯均勻涂于每只小鼠右耳耳廓兩面致炎,左耳不涂作為正常對照。1 h后脫頸處死,沿耳廓基線剪下雙耳,用直徑8 mm打孔器取左右耳同一部位圓耳片,用電子天平稱定質量,以右耳質量減去左耳質量為腫脹度,計算耳腫脹度及腫脹抑制率。結果以SPSS22進行組間t檢驗,多組間均數比較采用單因素方差分析,以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

結果見表1?？梢?對乙酰氨基酚、生品水提組、生品醇提組、醋炙水提組、醋炙醇提組對二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹均有明顯的抑制作用,二甲苯誘發(fā)耳廓腫脹度與生理鹽水組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。醋炙醇提高劑量組與生品水提低劑量組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01),即醋炙醇提取物比生品水提取物的抗感染作用更明顯,表明醋炙能增強山柰的抗感染作用。

表1 山柰不同提取物的抗感染鎮(zhèn)痛作用比較

與生理鹽水組比較：*P<0.05,**P<0.01；與生品水提物低劑量組比較：▲P<0.05,▲▲P<0.01。

3 討論

揮發(fā)油類和黃酮類成分是山柰中公認的有效成分，但具體的抗感染鎮(zhèn)痛成分目前尚未完全明確[13-14]。前期研究發(fā)現,對甲氧基肉桂酸乙酯是山柰揮發(fā)油中質量分數最高的特征性成分,具有抗感染、鎮(zhèn)痛、抗癌、防曬等藥理活性,是山柰藥材質量控制的指標性成分[15],因此選擇對甲氧基肉桂酸乙酯作為本文的考察指標[15-16]。

本文研究結果表明,山柰經醋炙后,提取物中對甲氧基肉桂酸乙酯的質量分數明顯增加,抗感染及鎮(zhèn)痛作用增強。醋炙醇提物中對甲氧基肉桂酸乙酯的質量分數最高，且抗感染及鎮(zhèn)痛作用強度與對乙酰氨基酚相當，量效關系良好。原因可能是,醋炙后山柰中的黃酮類和揮發(fā)油類成分與醋酸結合成更易溶出的可溶性醋酸鹽，醋酸促進部分糖苷類成分水解成具有抗炎鎮(zhèn)痛活性的苷元；對甲氧基肉桂酸乙酯易溶于乙醇等有機溶劑而難溶于水。本文結果進一步闡明了中藥炮制理論的科學性與合理性,驗證了對甲氧基桂皮酸乙酯是山柰抗炎鎮(zhèn)痛的主要藥效物質基礎,為后續(xù)山柰的炮制和提取工藝優(yōu)化研究奠定了基礎。

本文比較了流動相為甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.2%磷酸水、甲醇-0.3%磷酸水、甲醇-0.5%磷酸水,有機相與水相體積比(80∶20,60∶40,52∶48,30∶70),柱溫分別為25、30、35 ℃時的色譜圖。結果表明,流動相為乙腈-水、甲醇-0.5%磷酸水時,色譜基線較穩(wěn)定,峰的分離度大,峰形良好；有機相與水相體積比為60∶40時,對甲氧基肉桂酸乙酯的保留時間適中,在3個柱溫條件下對甲氧基肉桂酸乙酯的出峰情況無明顯差異。綜合實際情況考慮,以流動相為甲醇-質量分數0.5%(pH=2.3)磷酸水溶液(體積比60∶40),檢測波長為280 nm,柱溫為25 ℃作為液相色譜條件。本文建立了對甲氧基肉桂酸乙酯的測定方法,經方法學驗證精密度、重現性、穩(wěn)定性良好(RSD<2%)。該方法定量準確、專屬性強、回收率高,適用于山柰中對甲氧基肉桂酸乙酯的含量測定[17]。

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(責任編輯：陳翔)

Study on the effects of anti-inflammatory and analgesic and the determination of EPMC from Kaempferia Rhizoma before and after vinegar processing

WU Yanting,CHEN Guitian,SHI Jun,GUO Jiajun

(SchoolofTraditionalChineseMedichine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective To compare the effect of different processing technique on analgesic and anti-inflammatory inKaempferiaRhizoma,and to establish a method for the determination of Ethylp-methoxy cinnamate (EPMC). Methods The HPLC method was used for the determination of EPMC. Xylene induced ear swelling and hot plate test were adopted to observe anti-inflammatory and analgesic effects. Results The content of EPMC in different processed products ofKaempferiaRhizomawas as follows: the alcohol extracts from vinegar-processedKaempferiaRhizoma>the alcohol extracts from cleansingKaempferiaRhizoma>the water extracts from vinegar-processedKaempferiaRhizoma>the water extracts from cleansingKaempferiaRhizoma. All the four extracts ofKaempferiaRhizomahad obvious analgesic and anti-inflammatory effects compared to NS group (P<0.05 orP<0.01),but the alcohol extracts from vinegar-processedKaempferiaRhizomawere better than the water extracts from cleansingKaempferiaRhizoma(P<0.05). Conclusion The higher content of EPMC and stronger analgesic and anti-inflammatory effects were observed in the vinegar-processedKaempferiaRhizoma. EPMC might be the effective part on analgesic and anti-inflammatory.

KaempferiaRhizoma; vinegar processing technology; analgesia and anti-inflammatory; HPLC

2016-08-05

廣東藥科大學創(chuàng)新強校項目(廣東省高校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃資助類別，2015cxqx209)

吳艷婷(1993—),女,2016級中藥學碩士研究生,Email：13437871411@sina.cn；通信作者：時軍(1980—),男,副教授,主要從事中藥新藥及制劑新技術研究,電話：020-39352169,Email：shijun8008@163.com。

時間：2016-11-24 16:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161124.1600.001.html

R283.3

A

1006-8783(2016)06-0679-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016080503