闞延澤,江 翱，孫文秀,李 偉

( 長(zhǎng)江大學(xué) 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025 )

黃鱔載脂蛋白A1的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)譜分析

闞延澤,江 翱，孫文秀,李 偉

( 長(zhǎng)江大學(xué) 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025 )

根據(jù)克隆的黃鱔載脂蛋白A1基因的部分序列，進(jìn)行5′RACE擴(kuò)增和內(nèi)含子的克隆并采用熒光定量PCR分析該基因的表達(dá)譜。結(jié)果表明，該基因cDNA全長(zhǎng)1207 bp，5′UTR區(qū)域長(zhǎng)32 bp，編碼1個(gè)262 aa的多肽；在長(zhǎng)1391 bp的gDNA上，只發(fā)現(xiàn)了1個(gè)長(zhǎng)184 bp的內(nèi)含子。熒光定量PCR對(duì)該基因在不同組織和病原細(xì)菌嗜水氣單胞菌感染后的表達(dá)情況分析表明,該基因轉(zhuǎn)錄本在肝臟中表達(dá)量最高，在胃、腎臟、小腸、腦、皮膚和血液中表達(dá)量中等，而在心臟、脾臟和肌肉中表達(dá)量很低；病原細(xì)菌感染會(huì)顯著影響該基因在小腸、肝臟和脾臟中的表達(dá)水平。以上結(jié)果顯示黃鱔的載脂蛋白Apo-A1基因可能參與了魚(yú)體的天然免疫反應(yīng)。

黃鱔; 載脂蛋白; 基因結(jié)構(gòu); 表達(dá)

載脂蛋白Apo-A1 是血漿高密度脂蛋白的主要成分，在機(jī)體逆向膽固醇運(yùn)輸和脂質(zhì)代謝中具有重要作用[1]。人的載脂蛋白Apo-A1由肝臟和小腸合成，它不僅可以作為重要輔助因子激活卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶的活性參與膽固醇的酯化反應(yīng),而且還可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的清除，從而降低動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的危險(xiǎn)[2]。除此以外，載脂蛋白Apo-A1也是一個(gè)非常重要的天然免疫分子，它為許多免疫復(fù)合物的組裝提供了平臺(tái)[3]；并且具有抗病毒、抗細(xì)菌內(nèi)毒素等多樣化的功能[4]。其在免疫系統(tǒng)中的作用吸引了魚(yú)類分子育種學(xué)家的重視。目前已有相當(dāng)數(shù)量的魚(yú)類載脂蛋白Apo-A1基因被克隆，其中包括大西洋鮭(Salmosalar)[5]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[6]、斑馬魚(yú)(Daniorerio)[7]、金頭鯛(Sparusaurata)[8]、鰻鱺(Anguillajaponica)[9]、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidells)[10]、赤點(diǎn)石斑魚(yú)(Epinephelusakaara)[11]、斜帶石斑魚(yú)(E.coioides)12]、美洲條紋狼鱸(Moronesaxatilis)[13]、朝鮮(Hemibarbusmylodon)[14]和香魚(yú)(Plecoglossusaltivelis)[15]等。同哺乳動(dòng)物相類似，重組的魚(yú)類載脂蛋白Apo-A1蛋白具有明顯的體外抗細(xì)菌活性，且其基因表達(dá)水平往往受到外源病原的調(diào)節(jié)作用，說(shuō)明它們可能參與了魚(yú)類的天然免疫反應(yīng)[6,11-12]。相關(guān)資料顯示，魚(yú)類載脂蛋白Apo-A1基因的研究注重其在免疫系統(tǒng)中的作用，卻對(duì)其在脂質(zhì)代謝過(guò)程中的功能關(guān)注較少[11]。邱慶崇等[16]通過(guò)同源克隆的方法克隆了黃鱔(Monopterusalbus)載脂蛋白Apo-A1基因的cDNA片段，指出該基因可能是黃鱔脂質(zhì)代謝的一個(gè)重要生化指標(biāo)。但對(duì)于該基因的結(jié)構(gòu)及其在免疫反應(yīng)中的應(yīng)答未進(jìn)行深入研究。筆者立足于該cDNA片段基礎(chǔ)上，通過(guò)進(jìn)行5′- RACE擴(kuò)增獲得其5′-UTR序列，并克隆其內(nèi)含子結(jié)構(gòu)；采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同組織和病原細(xì)菌感染后該基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析。這將為進(jìn)一步明確黃鱔載脂蛋白Apo-A1基因在魚(yú)體天然免疫系統(tǒng)中的作用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚(yú)及病原菌感染

體質(zhì)量約60～70 g的黃鱔100尾，購(gòu)于荊州太湖市場(chǎng)。先于室溫條件下水箱中暫養(yǎng)7 d后，提取總RNA 并進(jìn)行病原菌感染試驗(yàn)。取適量心臟、肝臟、脾臟、胃、腎臟、血細(xì)胞、皮膚、腸、肌肉和腦組織，在液氮中速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?。?xì)菌感染試驗(yàn)按文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行。挑取病原細(xì)菌嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrohilia)單克隆在液體LB 培養(yǎng)基中 28 ℃培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，離心收集，用滅菌生理鹽水(0.9%)將菌液稀釋約至2.2×107cfu/mL。隨機(jī)取50 尾黃鱔用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽處理麻醉后進(jìn)行腹腔注射。每尾魚(yú)注射20 μL細(xì)菌。對(duì)照魚(yú)注射生理鹽水。分別在感染后3、6、12、24、48、72 h 隨機(jī)選3尾個(gè)體，取其小腸、肝臟和脾臟3 種組織液氮速凍后用于總RNA的提取。

1.2 引物設(shè)計(jì)、cDNA合成 和5′-RACE擴(kuò)增

根據(jù)黃鱔載脂蛋白Apo-A1的基因片段，設(shè)計(jì)基因特異性引物Apo-5GSP(5′-GTATGAGGATCAGCTTGCAGGGGAGC-3′)用于5′-RACE的擴(kuò)增。肝臟總RNA 提取按照Trizol 試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。cDNA 合成按照PrimeScript RT regent 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

5′-RACE按照Smart RACE cDNA 擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Touchdown 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，70 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃預(yù)變性1 min，65 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；延伸10 min。PCR 產(chǎn)物回收、純化后，連接至pEASY-T1 載體，克隆至T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3 DNA的提取及內(nèi)含子的克隆

根據(jù)上述1.2獲得的cDNA全長(zhǎng)，設(shè)計(jì)一對(duì)基因特異性引物Apo-F (5′-ATGGCTCCCCTGCAAGCTGATC-3′) 和Apo-R(5′-TCAGTTTGGGGTGAAGGTAG-3′) 用于基因組DNA上該基因包含全部ORF區(qū)域的擴(kuò)增，以便獲得其所有內(nèi)含子序列。DNA提取按照天根公司DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 黃鱔載脂蛋白Apo-A1基因的表達(dá)譜分析

采用熒光定量 PCR 技術(shù)，檢測(cè)載脂蛋白Apo-A1基因組織表達(dá)特異性和病原菌感染對(duì)該基因表達(dá)的影響。以不添加模板的反應(yīng)作為空白對(duì)照，以β-actin 的表達(dá)作為內(nèi)參。設(shè)計(jì)了引物rt-F (5′-CTGAGCGTGTGGAGCAACTG-3′)和rt-R (5′-TCTGCTACCTTCACCCCA-3′) 用于該基因的表達(dá)分析。熒光定量PCR 在Bio-Rad 公司CFX96系統(tǒng)上進(jìn)行。20 μL 反應(yīng)體系中包含1 μL 模板，10 μL SYBR Premix ExTaq，0.4 μL 引物，7.8 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s，54 ℃退火25 s，72 ℃ 延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。

每個(gè)處理重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件包中的單因素方差分析進(jìn)行，基因表達(dá)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05為差異顯著，當(dāng)P<0.01時(shí)差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃鱔載脂蛋白Apo-A1的序列分析

用Apo-5GSP引物進(jìn)行的5′RACE擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度為112 bp的片段，將該片段和已知基因片段進(jìn)行重疊后得到了長(zhǎng)度為1207 bp的cDNA。其中5′UTR長(zhǎng)32 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)度為792 bp，編碼262個(gè)氨基酸。用擴(kuò)增全長(zhǎng)ORF的引物對(duì)Apo-F/R擴(kuò)增獲得了一個(gè)長(zhǎng)為184 bp的內(nèi)含子，經(jīng)過(guò)和全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行拼接獲得了其基因組結(jié)構(gòu)(圖1)。

圖1 黃鱔載脂蛋白Apo-A1基因的基因結(jié)構(gòu)及編碼氨基酸序列

2.2 黃鱔載脂蛋白Apo-A1基因的組織表達(dá)分析

通過(guò)Real time RT-PCR方法檢測(cè)載脂蛋白Apo-A1轉(zhuǎn)錄本在不同組織的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在所檢測(cè)的10種組織中，載脂蛋白Apo-A1的表達(dá)量存在明顯差異；其中在肝臟表達(dá)最高，在心臟、脾臟、肌肉表達(dá)很低，而在胃、小腸、腎、腦、皮膚和血液中表達(dá)量中等。

圖2 黃鱔載脂蛋白Apo-A1基因的相對(duì)表達(dá)量

2.3 病原菌感染對(duì)黃鱔載脂蛋白Apo-A1基因表達(dá)的影響

病原菌嗜水氣單胞菌的感染會(huì)顯著影響肝臟、脾臟和小腸中載脂蛋白Apo-A1基因的表達(dá)水平。受病原菌嗜水氣單胞菌感染的影響，小腸里載脂蛋白Apo-A1基因的表達(dá)量在感染初期即急劇下降；在感染后的72 h內(nèi)呈反復(fù)波動(dòng)趨勢(shì)(圖3a)。而脾臟中載脂蛋白Apo-A1基因的表達(dá)量在感染后3～24 h呈逐步增加的趨勢(shì)，隨后表達(dá)量逐漸降低(圖3b)。肝臟中的載脂蛋白Apo-A1基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，在感染3～6 h表達(dá)量逐漸降低，在感染后24 h呈劇烈上升達(dá)到最大值，隨后又逐漸降低，直至感染后72 h降至正常水平(圖3c)。

圖3 病原菌感染后載脂蛋白Apo-A1 基因的相對(duì)表達(dá)量a: 小腸; b: 脾臟; c: 肝臟.

3 討 論

載脂蛋白Apo-A1是血漿高密度脂蛋白的主要成分，在機(jī)體脂質(zhì)代謝和抗動(dòng)脈粥樣硬化中具有重要作用。除此之外，它們還與生物體的抗氧化、抗炎、抗細(xì)菌和病毒等過(guò)程密切相關(guān)[11]。魚(yú)類等低等脊椎動(dòng)物也具有和哺乳動(dòng)物相類似的天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)以應(yīng)對(duì)外界病原物的入侵。只是，魚(yú)類的獲得性免疫系統(tǒng)相對(duì)不完善，更加依賴于天然免疫分子作為第一道防線[18]。魚(yú)類的載脂蛋白Apo-A1基因作為魚(yú)類的重要免疫相關(guān)候選基因，其分離和功能的鑒定對(duì)于魚(yú)類健康養(yǎng)殖具有重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，黃鱔的載脂蛋白Apo-A1基因轉(zhuǎn)錄本在本研究所檢測(cè)到的10種健康組織里均有不同程度的表達(dá)。這個(gè)研究結(jié)果和赤點(diǎn)石斑魚(yú)[11]、斜帶石斑魚(yú)[12]、虹鱒[6]和溝鲇(Ietaluruspunetaus)[19]的載脂蛋白Apo-A1基因組織分布結(jié)果相類似。有些魚(yú)類載脂蛋白Apo-A1基因的分布具有一定局限性，如草魚(yú)的小腸中未檢測(cè)到載脂蛋白Apo-A1基因的表達(dá)[10]，而大西洋鮭[5]的載脂蛋白Apo-A1基因的表達(dá)僅限于肝臟、肌肉和小腸中等。魚(yú)類載脂蛋白Apo-A1基因分布特異性結(jié)果提示魚(yú)類的肝臟和小腸仍與高等哺乳動(dòng)物一樣是載脂蛋白Apo-A1基因的主要合成部位[15]。

哺乳動(dòng)物上的大量試驗(yàn)表明，載脂蛋白Apo-A1是炎癥發(fā)生過(guò)程中急性反應(yīng)期的負(fù)反饋因子[20]。有些魚(yú)類的載脂蛋白Apo-A1的研究結(jié)果似乎與哺乳動(dòng)物的有些不同。如對(duì)于虹鱒的研究發(fā)現(xiàn)，病原細(xì)菌的感染并未顯著影響載脂蛋白Apo-A1在肝臟和血清里的表達(dá)水平[6]。對(duì)于赤點(diǎn)石斑魚(yú)的研究也發(fā)現(xiàn)，除脾臟外，受病原菌感染的其他組織里載脂蛋白Apo-A1基因的表達(dá)水平并無(wú)顯著的差異[11]。然而，也有相當(dāng)多的研究支持在哺乳動(dòng)物上的研究結(jié)論。如斜帶石斑魚(yú)[12]、溝鲇[19]、大西洋鱈(Gadusmorhua)[21]的研究發(fā)現(xiàn)病原細(xì)菌、病毒及其類似物對(duì)魚(yú)體的載脂蛋白Apo-A1基因表達(dá)具有顯著的影響。筆者的研究也發(fā)現(xiàn)，病原菌嗜水氣單胞菌感染會(huì)顯著影響黃鱔肝臟、小腸和脾臟內(nèi)載脂蛋白Apo-A1基因的表達(dá)水平。這充分說(shuō)明，在低等脊椎動(dòng)物魚(yú)類上載脂蛋白Apo-A1基因可能是一個(gè)非常重要的天然免疫分子，其在免疫系統(tǒng)中的具體作用值得進(jìn)一步深入研究。

[1] Chung H, Randolph A, Reardon I,et al. The covalent structure of apolipoprotein AI from canine high density lipoproteins [J]. J Biol Chem， 1982,257(6):2961-2967.

[2] 馬百坤,郭利利,方蓉,等.人載脂蛋白A-I基因的克隆表達(dá)及功能[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2005,21(2):273-277.

[3] Shiflett A M, Bishop J R, Pahwa A, et al. Human high density lipoproteins are platforms for the assembly of multi-component innate immune complexes [J].J Biol Chem,2005,280(38):32578-32585.

[4] 廖雪玲,吳滿平.載脂蛋白A-I 與機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)防御功能[J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志, 2005,14(3):193-196.

[5] Powell R,Higgins D G,Wolff J,et al.The salmon gene encoding apolipoprotein AI:cDNA sequence, tissue expression and evolution [J]. Gene,1991,104(2):155-161.

[6] Villarroel F,Bastías A,Casado A,et al.Apolipoprotein AI, an antimicrobial protein inOncorhynchusmykiss: evaluation of its expression in primary defence barriers and plasma levels in sick and healthy fish [J]. Fish and Shellfish Immunol, 2007,23(1):197-209.

[7] Babin P J,Thisse C,Durliat M,et al. Both apolipoprotein E and AI genes are present in a nonmammalian vertebrate and are highly expressed during embryonic development [J]. Proc Natl Acad Sci,1997,94(16):8622-8627.

[8] Llewellyn L, Ramsurn V P,Wigham T,et al.Cloning, characterization and expression of the apolipoprotein A-I gene in the sea bream (Sparusaurata) [J]. Biochim Biophys Acta Gene Struct Expr, 1998,1442(2/3):399-404.

[9] Kondo H, Kawazoe I,Nakaya M, et al. The novel sequences of major plasma apolipoproteins in the eelAnguillajaponica[J]. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids, 2001,1531(1/2):132-142.

[10] Concha M I, Molina S A, Oyarzún C, et al. Local expression of apolipoprotein A-I gene and a possible role for HDL in primary defence in the carp skin [J]. Fish and Shellfish Immunol, 2003,14(3):259-273.

[11] Qu M, Huang X, Zhang X, et al. Cloning and expression analysis of apolipoprotein A-I (ApoA-I) in the Hong Kong grouper (Epinephelusakaara) [J]. Aquaculture,2014(432):85-96.

[12] Wei J, Gao P, Zhang P. Isolation and function analysis of apolipoprotein A-I gene response to virus infection in grouper [J].Fish and Shellfish Immunol, 2015,43(2):396-404.

[13] Johnston L D,Brown G,Gauthier D,et al. Apolipoprotein A-I from striped bass (Moronesaxatilis) demonstrates antibacterial activity in vitro [J]. Comp Biochem Physiol B, 2008,151(2):167-175.

[14] Kim K Y,Cho Y S,Bang I C,et al.Isolation and characterization of the apolipoprotein multigene family inHemibarbusmylodon(Teleostei: Cypriniformes)[J].Comp Biochem Physiol B, 2009,152(1):38-46.

[15] Chen J, Shi Y,Hu H, et al. Apolipoprotein A-I, a hyperosmotic adaptation-related protein in ayu (Plecoglossusaltivelis) [J]. Comp Biochem Physiol A,2009,152(2):196-201.

[16] 邱慶崇,耿小雪,劉成都,等.黃鱔載脂蛋白 apoAI 基因的克隆及序列分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,50(21):4500-4502.

[17] Li W,Sun W X,Hu J F,et al.Molecular characterization，polymorphism and expression analysis of swamp eel major histocompatibility complex class IIB gene，after infection byAeromonashydrophilia[J].The Journal of Animal & Plant Sciences, 2014, 24(2):481-491.

[18] Plouffe D A,Hanington P C,Walsh J G,et al.Comparison of select innate immune mechanisms of fish and mammals [J]. Xenotransplantation,2005,12(4):266-277.

[19] Pridgeon J W,Klesius P H.Apolipoprotein A1 in channel catfish: transcriptional analysis, antimicrobial activity, and efficacy as plasmid DNA immunostimulant againstAeromonashydrophilainfection [J]. Fish and Shellfish Immunol, 201,35(4):1129-1137.

[20] Wang M, Briggs M R. HDL: the metabolism, function, and therapeutic importance [J]. Chem Rev, 2004,104(1):119-137.

[21] Caipang C M A,Hynes N,Puangkaew J,et al.Intraperitoneal vaccination of Atlantic cod,Gadusmorhuawith heat-killedListonellaanguillarumenhances serum antibacterial activity and expression of immune response genes[J].Fish and Shellfish Immun,2008,24(3):314-322.

GeneStructureandExpressionofApo-A1GenefromSwampEel

KAN Yanze, JIANG Ao, SUN Wenxiu, LI Wei

( Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of Wetland，Ministry of Education，Yangtze University, Jingzhou 434025,China )

In this paper, full-length cDNA and genomic structure of Apo-A1 gene were identified based on the cDNA fragment that we previously reported. Tissue distribution and immune response of the Apo-A1 gene to bacterial challenge were investigated. Results showed that the full-length cDNA was 1207 bp in length including a 32 bp-long 5′ untranslated region (UTR) encoding a 262 amino acids. In the 1391 bp-long genomic DNA,just one intron was identified. Real-time quantitative PCR demonstrated that Apo-A1 transcripts were ubiquitously expressed in ten tissues, with distinctly different expression level. Significant changes were observed in intestine, liver and spleen after the fish was challenged with pathogenic bacteriumAeromonashydrophilia. The findings suggeste that Apo-A1 may involve in the immune system of this fish.

swamp eel; Apo-A1, gene structrue; expression

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.016

S966.4

A

1003-1111(2016)06-0697-05

2016-01-26；

2016-04-18.

湖北省教育廳基金資助項(xiàng)目(Q20131206).

闞延澤(1993—),男, 碩士研究生;研究方向:生化與分子生物學(xué). E-mail: 378053841@qq.com.通訊作者:李偉(1976—),男, 副教授；魚(yú)類分子生物學(xué). E-mail: wetli@yangtzeu.edu.cn.