白酒黃水中纖維素降解菌的分離鑒定及產(chǎn)酶活性研究

曾林1，2，譚霄1，袁春紅1，3，張慶1，2*，楊穎4，趙婷婷1，2，唐潔1

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610039；2.西華大學(xué)古法發(fā)酵（釀造）生物技術(shù)研究所，四川成都610039；3.樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川樂山614000；4.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101）

為拓展纖維素降解菌資源，以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為唯一碳源作初篩培養(yǎng)基，從濃香型白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水中分離得到18株具有產(chǎn)纖維素酶能力的菌株進(jìn)行純培養(yǎng)。形態(tài)學(xué)、生理生化和系統(tǒng)發(fā)育鑒定結(jié)果顯示，菌株XH01、XH04、XH05、XH18為Bacillus cereus，菌株XH34為Bacillus circulans，菌株SW01、SW05為Bacillus megaterium，菌株SW02為Bacillus endophyticus，菌株SW03、SW04為Bacillus simplex，菌株SW09、SW13為Bacillus bataviensis。菌株ZL08為Penicillium camemberti，菌株ZL13為Aspergillus fumigatus，菌株ZL04和ZL25為Penicillium chrysogenum，菌株ZL15和ZL17為Alternaria tenuissima。利用二硝基水楊酸法對(duì)菌株發(fā)酵液纖維素酶活進(jìn)行研究，結(jié)果表明，菌株SW02的產(chǎn)酶活性較高，其羧甲基纖維素酶活為153.36 U/mL，β-葡萄糖苷酶活為126.00 U/mL，微晶纖維素酶活為17.64 U/mL，濾紙酶活為30.48 U/mL。

黃水；纖維素酶；微生物；系統(tǒng)發(fā)育；酶活

纖維素是地球上分布最廣的碳水化合物，同時(shí)又是世界上含量最豐富的可再生資源[1]。目前，許多研究者致力于不同來源的產(chǎn)纖維素酶微生物的篩選，因?yàn)閷?duì)自然界進(jìn)行生物多樣性探索，是獲得適合、適用工業(yè)生產(chǎn)的新型生物催化劑最有效的手段[2]。

纖維素酶是一類誘導(dǎo)型多酶復(fù)合體，通常由內(nèi)切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶3種具有不同催化反應(yīng)功能的酶組成，幾種酶協(xié)同作用催化纖維素水解為葡萄糖，利用微生物及其產(chǎn)生的纖維素酶類來分解纖維素是一種經(jīng)濟(jì)、有效且無污染的方法[3-4]。纖維素酶是微生物在纖維素類誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)作用下產(chǎn)生的[5-6]，產(chǎn)纖維素酶的微生物在自然界中廣泛存在，但由于酶的生成量、酶穩(wěn)定性及催化效率等因素的制約，使得纖維素酶的生產(chǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)的需要[7-8]。因此，對(duì)產(chǎn)纖維素酶微生物的篩選一直是研究的熱點(diǎn)。

黃水是白酒釀造的副產(chǎn)物，具有黏度大、溶氧低等特點(diǎn)，構(gòu)成了極為復(fù)雜的微生物生長(zhǎng)環(huán)境[9]。迄今為止，產(chǎn)纖維素酶微生物的篩選來源大多限于土壤、糞便、水體等，楊柳等[10]從土壤中分離的一株產(chǎn)濾紙酶和羧甲基纖維素酶活性較高的解淀粉芽孢桿菌；YOUNG C C等[11]從森林土壤中分離出2株能降解堿性木質(zhì)素的芽孢桿菌。但從濃香型白酒黃水中篩選產(chǎn)纖維素酶微生物的報(bào)道不多。

本研究從濃香型白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水中篩選產(chǎn)纖維素酶菌株，并對(duì)其進(jìn)行鑒定及產(chǎn)酶活性評(píng)估，以期對(duì)窖池中黃水微生物系統(tǒng)的研究提供一定的理論指導(dǎo)，拓寬了產(chǎn)纖維素酶的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型白酒黃水樣品：四川水井坊股份有限公司。

羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMCNa）（分析純）：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；微晶纖維素（化學(xué)純）、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（化學(xué)純）：成都市科龍化工試劑廠；TaKaRa聚合酶、DH5α感受態(tài)細(xì)胞：TaKaRa Biotechnology（大連）；pGM-T試劑盒、MarkerⅦ：天根生化科技有限公司。

培養(yǎng)基：CMC-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基、CMC液體發(fā)酵培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YPD）培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基菌均按參考文獻(xiàn)[12]配制。

1.2 儀器與設(shè)備

720BR/01492電泳凝膠成像分析系統(tǒng)、BiometraT1PCR儀：BIO-RAD公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；Heraues Multifuge X1R冷凍高速離心機(jī)：Thermo Fisher Scientific公司；BHC-1300ⅡA2生物安全柜：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BiometraPCR儀：德國(guó)耶拿分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物的分離純化

取黃水樣液25 mL，加入225 mL無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，均質(zhì)5 min。取適量均質(zhì)液用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋后涂布于LB培養(yǎng)基菌和YPD培養(yǎng)基進(jìn)行分離，LB培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)48 h，YPD培養(yǎng)基于28℃、120 r/min培養(yǎng)48 h。分別挑取單菌落劃線純化3次。

1.3.2 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選

將純化后的菌株接種于篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d后向培養(yǎng)加入適量碘液染色2 min。觀察并測(cè)量菌株及其周圍透明水解圈直徑大小，計(jì)算透明水解圈直徑與菌落直徑的比值，初步確定菌株的纖維素酶活性高低。

1.3.3 菌株的形態(tài)及生理生化特征

按照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[13]和《真菌鑒定手冊(cè)》[14]中的鑒定方法進(jìn)行。

1.3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)XIANG W L等[15]方法提取細(xì)菌DNA。16S rRNA擴(kuò)增引物為Eu27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸2 min，30循環(huán)后72℃保持10 min。

根據(jù)李可[16]的方法提取真菌DNA。18S rRNA擴(kuò)增引物：18S-F（5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′）和18S-R（5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′）。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸55 s，36個(gè)循環(huán)后72℃保持10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pGM-T載體后克隆入感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中，提取重組質(zhì)粒對(duì)16S rRNA和18S rRNA測(cè)序。所得序列提交至NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 纖維素酶系活力測(cè)定

將產(chǎn)酶菌株接于種子培養(yǎng)基，細(xì)菌于37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)6 h，真菌于28℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。以2%的接種量（約1×107CFU/mL）將種子液接種于液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于37℃和28℃恒溫空氣搖床上180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液8 000×g離心5 min，上清液即為粗酶液。采用3,5-二硝基水楊酸測(cè)定還原糖的方法檢測(cè)內(nèi)切型葡聚糖苷酶（CMC酶活）、外切型葡萄糖苷酶（微晶纖維素酶）、β-葡萄糖苷酶的酶及濾紙酶活。分別以CMC-Na、微晶纖維素、D-水楊苷、濾紙為唯一作用底物，取1 mL適當(dāng)稀釋的待測(cè)酶液和1 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 7.0），于50℃水浴1 h后，加入2 mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴中煮沸10 min，冷水浴冷卻后，于波長(zhǎng)540 nm處比色[17]。

纖維素酶系活力定義為每1mL樣液每分鐘水解纖維素底物生成1μg葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，U/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的分離純化及形態(tài)特征分析

以CMC-Na為唯一碳源對(duì)濃香型白酒發(fā)酵黃水中微生物進(jìn)行篩選培養(yǎng)，共篩選到18株纖維素降解菌，將18株纖維素降解菌纖維素降解菌接種于平板培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min培養(yǎng)24 d后，菌體形態(tài)見圖1，其菌落直徑和透明圈直徑見表1。

圖1 產(chǎn)纖維素酶菌株的菌體形態(tài)Fig.1 Mycelial morphology of cellulase-producing strains

由圖1可知，細(xì)菌菌落多數(shù)為圓形，均具有光澤，顯微觀察菌體均為桿狀，革蘭氏染色均為陽(yáng)性。真菌菌落擴(kuò)散生長(zhǎng)，呈棉絮狀，結(jié)構(gòu)疏松，孢子黑色，邊緣較整齊。

表1 篩選平板上18株微生物的菌落直徑和透明圈直徑Table 1 Diameters of colony and clear haloes on the screening plate formed by cellulose-decomposing strains

由表1可知，菌株XH34和SW02在篩選培養(yǎng)基上表現(xiàn)出具有較大的水解纖維素能力，比酶活力分別是6.52±0.54和9.04±0.67。

2.2 菌株的生理生化及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對(duì)篩選出的18株產(chǎn)纖維素酶系菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見表2。將產(chǎn)纖維素酶的18株菌株全部進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得序列經(jīng)Mallard 1.02檢測(cè)后，通過軟件BioEdit 7.0檢測(cè)，無異常序列發(fā)現(xiàn)。再利用MEGA5.0軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2和圖3。18株菌株中4株被鑒定為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）；1株鑒定為內(nèi)生芽孢桿菌（Bacillus endophyticus）；1株被鑒定為環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）；2株被鑒定為簡(jiǎn)單芽孢桿菌（Bacillus simplex）；2株被鑒定為巴達(dá)維亞芽孢桿菌（Bacillus bataviensis）；2株被鑒定為巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium）；2株被鑒定為細(xì)極鏈格孢菌（Alternariatenuissima）；1株被鑒定為沙門柏干酪青霉菌（Penicillium camemberti）；1株鑒定為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）；2株被鑒定為黃青霉（Penicillium chrysogenum）。這與生理生化特征試驗(yàn)結(jié)果相符。

表2 纖維素降解細(xì)菌理化特征比較Table 2 Comparison of physicochemical properties of cellulose-decomposing strains

圖2 基于16S rRNA序列同源性的纖維素降解細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Bacteria phylogenetic tree of cellulose-decomposing bacteria based on homology of 16S rRNA gene sequences

圖3 基于18S rRNA序列同源性的纖維素降解真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Fungus phylogenetic tree of cellulose-decomposing fungi based on homology of 18S rRNA gene sequences

2.3 纖維素酶系活力測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸試劑測(cè)定還原糖的方法檢測(cè)菌株纖維素酶系活力。分別以CMC-Na、D-水楊苷、濾紙、微晶纖維素為唯一作用底物，測(cè)定濃香型白酒黃水中纖維素降解菌發(fā)酵液中內(nèi)切型葡聚糖苷酶（CMC酶活）、β-葡萄糖苷酶的酶、外切型葡萄糖苷酶（微晶纖維素酶和濾紙酶活）。結(jié)果如圖4所示，總體來說，從濃香型白酒黃水中篩選的18株纖維素降解菌產(chǎn)生的纖維素酶對(duì)各底物的降解各不相同，表現(xiàn)出不同的活力，在白酒釀造過程中，各纖維素降解菌的協(xié)同作用和其產(chǎn)生的纖維素酶系的相互作用共對(duì)原料中的纖維素進(jìn)行降解，破壞間質(zhì)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使其包含的淀粉釋放出來，以利于糖化酶的作用，從而起到提高原料利用率、提高發(fā)酵率和縮短發(fā)酵時(shí)間的效果。個(gè)體來說，菌株ZL25和SW02產(chǎn)生的纖維素酶系活力較高。其中菌株SW02對(duì)羧甲基纖維素鈉和D-水楊苷表現(xiàn)出較高的降解活性，分別為153.36 U/mL和120.00 U/mL，也就是說，菌株SW02產(chǎn)生的纖維素酶系中內(nèi)切型葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性較高。

圖4 產(chǎn)纖維素酶菌株酶活力比較Fig.4 Comparison of the cellulase activities of the cellulase-producing strains

2.4 討論

纖維素酶由于其廣泛的應(yīng)用性及良好的應(yīng)用前景一直受到人們的關(guān)注，產(chǎn)纖維素酶菌株篩選、高產(chǎn)菌株的誘變選育、酶系基因克隆、酶系組成及作用機(jī)制等各個(gè)方向的研究一直都在進(jìn)行[18]。菌種篩選是纖維素酶生產(chǎn)的基礎(chǔ)性工作，也是關(guān)鍵步驟，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者已做了大量的研究工作，建立了較為完善的分離篩選方法，現(xiàn)如今已有很多關(guān)于纖維素酶產(chǎn)生菌選育的報(bào)道[19]。

本研究采用CMC-Na為唯一碳源的初篩方法從低氧、高酸度、營(yíng)養(yǎng)匱乏的黃水環(huán)境中分離出12株產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌和6株產(chǎn)纖維素酶的真菌，通過透明圈大小及比酶活力大小分析，菌株XH34和SW02在篩選培養(yǎng)基上表現(xiàn)出具有較大的水解纖維素能力。雖然透明圈大小及比酶活力大小可以直觀地反映酶濃度的高低及酶活力大小，但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力。其原因是多方面的，固態(tài)和液態(tài)培養(yǎng)條件下水活度、氧含量、菌的代謝情況等的不同；不同菌株具有不同的生長(zhǎng)、產(chǎn)酶速度及纖維素酶系組成；菌苔大小及在平板上堆積情況的差異等因素都會(huì)造成透明圈大小與液態(tài)發(fā)酵酶活力結(jié)果的不完全一致[20]。此外，初篩培養(yǎng)基所用的篩選底物為人工合成的可溶性纖維素，與天然不可溶纖維素相比更易被微生物分解利用，因此羧甲基纖維素鈉平板篩選法還忽略了天然纖維素和人工纖維素之間的差異，其結(jié)果并不能準(zhǔn)確反映出菌株對(duì)天然纖維素底物的利用能力[21]。所以，進(jìn)一步對(duì)菌株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵對(duì)產(chǎn)纖維素酶菌株的表達(dá)能力評(píng)估必不可少。

經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化分析及分子鑒定得出12株細(xì)菌均屬于芽孢桿菌屬，分別為Bacilluscereus、Bacilluscirculans、Bacillusmegaterium、Bacillusendophyticus、Bacillussimplex、Bacillusbataviensis。目前，已有許多種芽孢桿菌被報(bào)道其產(chǎn)纖維素酶能力，如Bacillus amyoliquefaciensDL-3、Bacillus subtilisKG10、Bacillus flexus、Bacillus haloduransCAS1、BacilluslicheniformisSVD1等，而有關(guān)Bacillus megaterium、Bacillusendophyticus、Bacillussimplex及Bacillusbataviensis的產(chǎn)纖維素酶的報(bào)道還未曾見到[22]。在白酒釀造工業(yè)，產(chǎn)纖維素酶菌可對(duì)粗原料中的纖維素進(jìn)行降解，破壞間質(zhì)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使其包含的淀粉釋放出來，以利于糖化酶的作用，從而起到提高原料利用率、提高發(fā)酵率和縮短發(fā)酵時(shí)間的效果[23]。農(nóng)業(yè)上，這些產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌還具有微生物催腐劑的潛力，可加速田間農(nóng)作物廢棄物軟化腐朽，提升土壤肥力，減少環(huán)境污染。因此，本研究對(duì)黃水中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌進(jìn)行篩選、鑒定，不僅為黃水中微生物系統(tǒng)的研究提供一定的理論指導(dǎo)，擴(kuò)展了纖維素酶的種質(zhì)來源，還為潛質(zhì)工業(yè)微生物的研究及開發(fā)提供參考。

3 結(jié)論

纖維素酶酶系表達(dá)能力分析結(jié)果表明，18株菌株都能分泌外型內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶，其中內(nèi)切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶酶的活力較高。與其他17株菌株相比菌株SW02的纖維素酶系活力最高，經(jīng)初步發(fā)酵測(cè)得的外型內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶及總酶活力大小分別為153.36 U/mL、12.00 U/mL、17.65 U/mL、30.48 U/mL，其中β-葡萄糖苷酶酶活力最高，與其他研究者篩選到的產(chǎn)纖維素酶菌株相比[7]，菌株SW02的酶系活力較低，但不同來源纖維素酶系的組成成分不同、結(jié)構(gòu)不同，其酶活力和分解能力也不相同，并且微生物的培養(yǎng)條件和酶活力測(cè)定條件對(duì)所測(cè)的酶活力影響較大。因此，后續(xù)的發(fā)酵條件優(yōu)化以提高纖維素酶系活力的研究尤為重要，這將為酶發(fā)酵工業(yè)化開發(fā)利用、提高纖維素分解效率等研究探討奠定基礎(chǔ)。

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Isolation and identification of cellulose-degrading strains from yellow water ofBaijiu (Chinese liquor)and its cellulase activity

ZENG Lin1,2,TAN Xiao1,YUAN Chunhong1,3,ZHANG Qing1,2*,YANG Ying4,ZHAO Tingting1,2,TANG Jie1
(1.Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan,College of Food and Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039, China;2.Biotechnology Institute of Ancient Brewing,Xihua University,Chengdu 610039,China;3.Food and Drug Testing Center of Leshan,Leshan 614000,China;4.Food and Drug Institute of Shandong,Jinan 250101,China)

In order to broaden and evaluate the strain resources with cellulose degradation capability,using carboxymethyl cellulose-Na as sole carbon sources,a total of 18 strains with cellulose-producing abilitywere isolated from yellow water of the Luzhou-flavorBaijiu(Chinese liquor)fermentation. The results of morphological,physiological and biochemical characterization and 16S rRNA analysis showed that strain XH01,XH04,XH05 and XH18 were identified asBacillus cereus,strain XH34 was identified asBacillus circulans,strain SW01 and SW05 were identified asBacillus megaterium,strain SW02 was identified asBacillus endophyticus,strain SW03 and SW04 were identified asBacillus simplex,strain SW09 and SW13 were identified asBacillus bataviensis.Strain ZL08 was identified asPenicillium camemberti,strain ZL13 was identified asAspergillus fumigatus, strain ZL04 and ZL25 were identified asPenicillium chrysogenum,strain ZL15 and ZL17 were identified asAlternaria tenuissima.Their cellulase activity were detected by DNS method,and results showed that strain SW02 had higher cellulase activity,the CMCase,β-glucosidase,avicelase and FPase activity were 153.36 U/ml,126.00 U/ml,17.64 U/ml and 30.48 U/ml,respectively.

yellow water;cellulase;microorganism;phylogeny;enzyme activity

TQ920.6

0254-5071（2016）11-0059-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.012

2016-08-02

教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目（Z2014060）；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（2016JY0253）；省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201510623081）

曾林（1992-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锛夹g(shù)。

*通訊作者：張慶（1979-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锛夹g(shù)。