孟永斌 徐 蕾 張子?xùn)| 路 祺 劉 英 聶思銘 祖元?jiǎng)?

(1.東北林業(yè)大學(xué)生物資源生態(tài)利用國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

纖維剩余物發(fā)酵制備乙醇工藝研究

孟永斌1,2徐 蕾1,2張子?xùn)|1,2路 祺1,2劉 英1,2聶思銘1,2祖元?jiǎng)?,2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)生物資源生態(tài)利用國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

單因素實(shí)驗(yàn)和正交優(yōu)化對(duì)固定化酵母制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，并對(duì)固定化酵母的重復(fù)利用發(fā)酵能力進(jìn)行了考察，其優(yōu)化工藝條件為海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比1∶2 g·g-1，底物糖濃度30%，酵母用量1.5 g，固定化酵母發(fā)酵120 h。在此條件下，乙醇產(chǎn)率均值為83.68%。為塔拉纖維剩余物的酶解液發(fā)酵制備乙醇提供技術(shù)支撐。

纖維剩余物;發(fā)酵;乙醇;固定化酵母

目前工業(yè)化制備沒(méi)食子酸方法，雖然具有工藝成熟等優(yōu)點(diǎn)，但也存在塔拉廢渣對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染等問(wèn)題[1～2]。塔拉經(jīng)過(guò)堿提取沒(méi)食子酸后，其廢渣主要成分為綜纖維素[3]。酵母是一種單細(xì)胞真菌，在有氧和無(wú)氧環(huán)境下都能生存，屬于兼性厭氧菌[4]。發(fā)酵型的酵母無(wú)氧呼吸通過(guò)將糖類轉(zhuǎn)化成為二氧化碳和乙醇來(lái)獲取能量[5]。固定化酵母細(xì)胞技術(shù)[6～7]是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的生物技術(shù)，為近年來(lái)生物工程研究重點(diǎn)領(lǐng)域之一[8]。固定化酵母發(fā)酵將酵母細(xì)胞固定在不溶性物質(zhì)上進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程，具有高效、專一、可回收利用及便于反應(yīng)過(guò)程管理化、連續(xù)化及自控化等優(yōu)點(diǎn)[9]。固定化的酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇反應(yīng)結(jié)束后可以回收，重復(fù)發(fā)酵使用，提高了酵母的利用率，降低發(fā)酵成本。本研究是通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交優(yōu)化對(duì)固定化酵母制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，并對(duì)固定化酵母的重復(fù)利用發(fā)酵能力進(jìn)行了考察，為塔拉纖維剩余物的酶解液發(fā)酵制備乙醇提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酵母，安琪酵母股份有限公司；乙醇(色譜級(jí))；海藻酸鈉、氯化鈣、葡萄糖均為分析純。塔拉纖維剩余物酶解糖液制備是通過(guò)前期正交實(shí)驗(yàn)得到纖維素酶水解塔拉纖維剩余物優(yōu)化工藝條件，即料液比1∶6 g·mL-1，酶解溫度55℃，pH6，酶解時(shí)間48 h。在此條件下，塔拉纖維剩余物酶解還原糖產(chǎn)率均值為43.95%。

7890A氣相色譜儀，HP-55%苯甲基硅氧烷毛細(xì)管柱(0.25 μm×320 μm×30 m)以及G1540N-210FID(氫氣火焰檢測(cè)器)檢測(cè)器；美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探討固定化酵母發(fā)酵各因素對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)固定化酵母發(fā)酵進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[10]。

1.2.1 氣相色譜條件

柱箱子起始溫度40℃維持5 min，然后以20℃·min-1的速度升溫到200℃維持2 min。進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別設(shè)置為200℃和220℃。氮?dú)庾鳛檩d氣流量為30 mL·min-1，分流比25∶1。氫氣和空氣流量分別為35和320 mL·min-1。尾吹流量25 mL·min-1[11～12]。

1.2.2 乙醇產(chǎn)率測(cè)定

將40 mL待測(cè)乙醇液體置于150 mL圓底燒瓶中，添加40 mL蒸餾水后進(jìn)行蒸餾，采用50 mL容量瓶接收餾出液50 mL[13]。利用氣相色譜測(cè)量乙醇PA利用乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算乙醇濃度CA。

(1)

1810年，Gay-Lussac建立了酵母菌發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乙醇的反應(yīng)式由式1可以看出，100 g的葡萄糖能夠產(chǎn)生乙醇51 g，二氧化碳49 g；理論產(chǎn)量以重量計(jì)為51%。本章中定義乙醇產(chǎn)率是產(chǎn)生乙醇的量與理論產(chǎn)量的比值，根據(jù)公式2計(jì)算乙醇產(chǎn)率Y(%)。

(2)

式中：CA為樣品蒸餾液乙醇濃度(mg·mL-1)；VA為樣品蒸餾液體積(mL)；CG為樣品葡萄糖溶液濃度(mg·mL-1)；VG為樣品溶液體積(mL)。

1.2.3 酵母固定化

酵母活化：釀酒干酵母1.5 g，放入2%葡萄糖溶液30 mL中于35℃恒溫條件下復(fù)水15 min，于35℃下恒溫活化1 h后作酒母?jìng)溆谩?/p>

海藻酸鈉—酵母懸液的制備：在30 mL蒸餾水中攪拌加熱溶解0.338 g海藻酸鈉，完全溶解后將溫度降至30℃，均勻混合海藻酸鈉溶液與活化酵母液，形成海藻酸鈉—酵母懸液。

酵母細(xì)胞的固定化：在150 mL蒸餾水中攪拌溶解28.3 g的氯化鈣，用5 mL注射器將海藻酸鈉一酵母懸液緩慢滴入氯化鈣溶液中進(jìn)行造粒，混合后的菌懸液中的海藻酸鈉在CaCl2溶液中與鈣離子起到耦合作用，將海藻酸鈉羧基上的鈉換成鈣，形成多維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，生成凝膠和氯化鈉；并將酵母固定在包埋劑中。固定化酵母凝膠珠在20℃下初步平衡1 h后，取出固定化酵母用蒸餾水洗去表面氯化鈣溶液后，放入濃度為0.05 mol·L-1的氯化鈣溶液中深度平衡24 h備用[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

以乙醇濃度為橫坐標(biāo)，峰面積PA為縱坐標(biāo)作圖。線性回歸方程y=525.61x+6.513，R2=0.999；乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of alcohol

2.2 固定化酵母發(fā)酵制乙醇單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 固定化酵母底物糖濃度對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響

由圖2可以看出底物糖濃度對(duì)固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率的影響。隨著底物糖濃度的增加，溶液?jiǎn)挝惑w積可利用的糖量也隨之增加，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率也隨之緩慢增加；底物糖濃度達(dá)到30%時(shí)，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率達(dá)到最大值。但過(guò)高底物糖濃度會(huì)造成酵母細(xì)胞失水，不利于酵母生存，失水后會(huì)對(duì)酵母的生命活動(dòng)產(chǎn)生抑制。所以底物糖濃度達(dá)到50%，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率迅速下降。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)可知最適宜的底物糖濃度為30%。

2.2.2 固定化酵母用量對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響

酵母用量對(duì)固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率的影響如圖3。隨著酵母用量的增加，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率也隨之大幅度增加；當(dāng)酵母用量超過(guò)1.5 g時(shí)，由于溶液中酵母可利用的底物糖量是有限的，隨著酵母用量繼續(xù)增加固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率不再增加。因此，最適宜的酵母用量為1.5 g。

圖2 固定化酵母底物糖濃度對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on immobilized yeast ethanol productivity

圖3 固定化酵母用量對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of mass on immobilized yeast ethanol productivity

2.2.3固定化酵母的海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響

依據(jù)文獻(xiàn)海藻酸鈉溶液濃度選定為2.25%，海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比對(duì)固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖4。由圖可知，隨著海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比的增加，即海藻酸鈉用量逐漸增加時(shí)，固定化酵母凝膠珠數(shù)量逐漸增加，酵母與底物糖液接觸面積逐漸增加，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率隨之增加[14]。當(dāng)海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比超過(guò)1∶2時(shí)，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是由于海藻酸鈉用量繼續(xù)增加時(shí)，固定化酵母凝膠珠雖然增多，但固定化酵母凝膠珠中酵母量降低幅度較大，不利于發(fā)酵，固定化酵母乙醇產(chǎn)率也隨之降低。因此適宜的海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比為1∶2，此條件下，固定化酵母發(fā)酵底物糖液制備乙醇產(chǎn)率為83.68%。

圖4 固定化酵母的海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of sodium alginate mass on immobilized yeast ethanol productivity

2.2.4固定化酵母發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵乙醇產(chǎn)率的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖5。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率呈現(xiàn)先逐漸增加后趨于平緩的趨勢(shì)。隨著固定化酵母發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，利用的底物糖量越來(lái)越少和乙醇產(chǎn)物的積累增加，導(dǎo)致固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率增加速率也逐漸緩慢；當(dāng)固定化酵母發(fā)酵超過(guò)120 h，乙醇產(chǎn)率增加不明顯。

圖5 固定化酵母發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of time on immobilized yeast ethanol productivity

2.3 固定化酵母發(fā)酵制乙醇正交實(shí)驗(yàn)

通過(guò)前面單因素實(shí)驗(yàn)確定各因素取值范圍，以乙醇產(chǎn)率為固定化酵母發(fā)酵反應(yīng)性能評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)海藻酸鈉用量、底物糖濃度和酵母用量進(jìn)行L9(3)4正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討優(yōu)化實(shí)驗(yàn)(表1～2)。

表1L9(3)4正交實(shí)驗(yàn)水平因素表

Table1OrthogonalexperimenttablelevelfactorsofL9(3)4

水平因素LevelfactorsA海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比Theratioofsodiumalginate?yeast(g·g-1)B底物糖濃度Substratesugarconcentration(%)C酵母用量Yeastamount(g)11∶420121∶2301．531∶1．5403

表2L9(3)4正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table2OrthogonalarraydesignL9(3)4andexperimentalresults

因素FactorABC實(shí)驗(yàn)結(jié)果Results111176．37212279．73313374．90421282．59522381．16623179．18731377．69832180．59933278．49K177．0078．8878．71K280．9780．4980．27K378．9277．5277．92R3．9772．9702．353最優(yōu)條件A2B2C2

直觀分析表2正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，根據(jù)均值(K)，可知最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為A2B2C2。，海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比1∶2 g·g-1，底物糖濃度30%，酵母用量1.5 g為實(shí)驗(yàn)最優(yōu)條件。從各因素極差值(R)可知，A>B>C；對(duì)固定化酵母發(fā)酵制乙醇的主次順序?yàn)椋汉Ｔ逅徕c用量>底物糖濃度>酵母用量。

固定化酵母發(fā)酵制乙醇產(chǎn)率的方差分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。查表有F0.01(2,2)=99；F0.05(2,2)=19；F0.1(2,2)=9。當(dāng)F>F0.01，有高度顯著影響；當(dāng)F0.01>F>F0.05，有顯著影響；當(dāng)F0.05>F>F0.1時(shí)，有一定的影響；當(dāng)F

計(jì)算結(jié)果表明，因素A的FA，為F0.01>FA>F0.05；因素B的FB，為F0.05>FB>F0.1；因素C的FC，為F0.05>FC>F0.1；因此，因素A對(duì)固定化酵母發(fā)酵制乙醇產(chǎn)率的影響顯著，因素B和因素C對(duì)固定化酵母發(fā)酵制乙醇產(chǎn)率有一定的影響。

表3 方差分析

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到固定化酵母發(fā)酵葡萄糖液制乙醇的優(yōu)化工藝條件：海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比1∶2 g·g-1，底物糖濃度30%，酵母用量1.5 g；三次固定化酵母發(fā)酵制乙醇重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為84.73%，83.54%，82.77%，均值為83.68%，表明基本穩(wěn)定，重復(fù)性較好。

圖6 固定化酵母重復(fù)次數(shù)對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of times of repetition on immobilized yeast ethanol productivity

2.4 固定化酵母重復(fù)發(fā)酵能力

由圖6可知，隨著固定化酵母重復(fù)利用次數(shù)的增加，乙醇轉(zhuǎn)化率逐漸降低，其中第四次發(fā)酵液乙醇產(chǎn)率為54.94%，在第四次循環(huán)發(fā)酵結(jié)束后，固定化酵母表面開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)裂紋。第六次發(fā)酵液底物糖轉(zhuǎn)化率為38.63%。固定化酵母重復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，固定化酵母發(fā)酵能力隨發(fā)酵次數(shù)的增加逐漸下降，循環(huán)利用發(fā)酵四次后，固定化酵母包埋能力和發(fā)酵性能下降較大，這主要是由于酒精發(fā)酵過(guò)程中，乙醇濃度逐漸增大，產(chǎn)生反饋抑制，而且濃度越大，抑制作用越強(qiáng)。乙醇不僅可以抑制糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，還可抑制細(xì)胞膜上ATP酶活性，最終削弱細(xì)胞膜對(duì)酵母細(xì)胞的保護(hù)作用。另外，乙醇還可引起細(xì)胞內(nèi)線粒體的氧化損傷。隨著循環(huán)利用次數(shù)的增加，乙醇對(duì)酵母細(xì)胞抑制作用時(shí)間就越長(zhǎng)，從而對(duì)酵母細(xì)胞造成不可逆的破壞，使部分菌體喪失了發(fā)酵能力，發(fā)酵性能逐漸下降[15]。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定固定化酵母發(fā)酵制乙醇工藝各個(gè)因素取值范圍，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到優(yōu)化工藝條件：海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比1∶2 g·g-1，底物糖濃度30%，酵母用量1.5 g。固定化酵母發(fā)酵120 h乙醇產(chǎn)率均值為83.68%，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本穩(wěn)定，重復(fù)性較好。葡萄糖溶液最優(yōu)條件下固定化酵母發(fā)酵可重復(fù)使用四次，第四次乙醇產(chǎn)率為54.94%；為下一步塔拉纖維剩余物酶解糖液發(fā)酵制備乙醇提供了理論基礎(chǔ)。

1.呂麗麗.電子級(jí)沒(méi)食子酸制備過(guò)程中若干基礎(chǔ)問(wèn)題研究[D].杭州:浙江大學(xué),2009:18-22.

2.路祺,彪林海,徐蕾,等.漂白前后塔拉纖維剩余物的酶動(dòng)力學(xué)分析[J].植物研究,2015,35(5):791-794.

3.路祺,高悅,項(xiàng)鳳影,等.纖維剩余物酶解工藝研究[J].植物研究,2015,35(3):476-480.

4.劉國(guó)庫(kù),丁亞光,胡勝男,等.柑橘果酒酵母菌發(fā)酵特性的研究[J].食品與發(fā)酵科技,2014,50(1):81-84.

5.何東東.產(chǎn)朊假絲酵母的發(fā)酵及功能性質(zhì)研究[D].天津:天津商業(yè)大學(xué),2010:3-6.

6.Liu Ronghou,Li Jinxia L,Shen Fei,et al.Bioethanol Fermentation from Stalk Juice of Sweet Sorghum by Immobilized Yeast[J].Journal of Shanghai Jiaotong University,2005,S1:146-151.

7.Ken-ichi I,Mitsutoshi N,Hiroyuki S A.Rapid Ethanol Fermentation for Soy Sauce Production by Immobilized Yeast Cells[J].Agricultural and Biological Chemistry,1991,55(9):2201-2207.

8.陳智理,楊昌鵬,郭靜婕.固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)果酒研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(29):14357-14359.

9.鄭春明.多孔無(wú)機(jī)/聚合物復(fù)合材料的制備,表征及在制糖工業(yè)的中試應(yīng)用[D].天津:南開(kāi)大學(xué),2009:5-10.

10.紀(jì)鐵鵬,肖冬光.雙菌順次發(fā)酵釀制乳清酒工藝研究[J].釀酒科技,2014,9(4):68-71.

11.甄會(huì)英,王頡,李長(zhǎng)文,等.氣相色譜外標(biāo)法測(cè)定葡萄酒中高級(jí)醇[J].中外葡萄與葡萄酒,2005,01:12-15.

12.Zhuang GuangChao,Lin Yushih,Marcus E,et al.Gas chromatographic analysis of methanol and ethanol in marine sediment pore waters:Validation and implementation of three pretreatment techniques[J].Marine Chemistry,2014,160:82-90.

13.吳諳宇.離子液體處理稻稈纖維素制備乙醇的研究[D].哈爾濱:哈爾濱理工大學(xué),2014:3-20.

14.喻本青,閆云君,劉濤,等.海藻酸-SiO2雜化凝膠固定化洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶的研究[J].生物加工過(guò)程,2010,8(1):16-22.

15.張小玲,李文,王靖楠,等.固定化酵母重復(fù)發(fā)酵性能調(diào)控[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué),2014,34(7):1797-1803.

EthanolProductionTechnologybyFermentationformFiberResidues

MENG Yong-Bin1,2XU Lei1,2ZHANG Zhi-Dong1,2LU Qi1,2LIU Ying1,2NIE Si-Ming1,2ZU Yuan-Gang1,2*

(1.National Local Joint Engineering Laboratory for Ecological utilization of biological resources,Harbin 150040；2.Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Northeast Forestry University,Ministry of Education,Harbin 150040)

We studied the effects of various factors on the yield of ethanol from enzymatic hydrolysate of Tara fiber residues by the single factor experiment, and then optimized ethanol production technology by orthogonal experiments. The optimum conditions were the ratio of sodium alginate-yeast of 1∶2 g·g-1, substrate sugar concentration of 30%, the amount of yeast of 1.5 g, and fermentation time of 120 h, with the yield of ethanol of 83.68%.

fiber residues;fermentation;ethanol;immobilized yeast

黑龍江省博士后資助項(xiàng)目(LBH-Z14015)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2572014EA01-03)

孟永斌(1990—)，男，碩士研究生，主要從事生物質(zhì)資源化利用研究。

* 通信作者：E-mail:zuyuangangnefu@126.com

2015-09-11

Q539.3

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.023