韓燕 尹躍平 朱邦勇 劉宏業(yè) 鐘銘英

210042南京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所性病參比實驗室 中國疾病預防控制中心性病控制中心（韓燕、尹躍平、劉宏業(yè)、鐘銘英）；廣西壯族自治區(qū)皮膚病防治研究所中心實驗室（朱邦勇）

廣西性病門診患者泌尿生殖道沙眼衣原體株高分辨多位點測序分型研究

韓燕 尹躍平 朱邦勇 劉宏業(yè) 鐘銘英

210042南京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所性病參比實驗室 中國疾病預防控制中心性病控制中心（韓燕、尹躍平、劉宏業(yè)、鐘銘英）；廣西壯族自治區(qū)皮膚病防治研究所中心實驗室（朱邦勇）

目的了解廣西性病門診患者中泌尿生殖道沙眼衣原體型別分布，同時對隨訪患者沙眼衣原體的感染情況進行分析。方法在廣西壯族自治區(qū)皮膚病防治所收集泌尿生殖道沙眼衣原體感染患者，采集男性尿道和女性宮頸拭子標本，并對初篩陽性患者在治療完成后進行隨訪和標本采集，同時采集患者基本信息和臨床信息。應用QIAxtractor全自動核酸純化儀提取DNA，巢式PCR擴增沙眼衣原體主要外膜蛋白基因（ompA）和MLST（高分辨多位點測序分型）所需的CT046（hctB）、CT058、CT144、CT172和 CT682（pbpB）5個基因。對PCR產(chǎn)物進行序列測定，經(jīng)序列比對和MLST型別分析獲得菌株的ompA基因分型和型別，并用BioNumerics7軟件對廣西和意大利沙眼衣原體株繪制最小生成樹。結果在44份來自初診患者和6份來自隨訪患者的沙眼衣原體陽性樣本中，42份成功進行沙眼衣原體ompA和MLST分型。共發(fā)現(xiàn)7種ompA基因型和15種hr?MLST分型的ST型別，其中有3種ST型別為首次報道。廣西地區(qū)沙眼衣原體基因型別較意大利地區(qū)具有特征性。6例隨訪患者經(jīng)分型方法鑒定3例為再次的新發(fā)感染，3例因未能成功進行基因分型而未能確診。結論廣西性病門診患者感染的沙眼衣原體具有獨特的型別，在隨訪中出現(xiàn)泌尿生殖道沙眼衣原體再感染病例。

沙眼衣原體；多位點測序分型；隨訪研究；聚類分析

沙眼衣原體感染是性傳播疾病之一，2008年世界衛(wèi)生組織（WHO）估計成人新發(fā)感染生殖道沙眼衣原體的人數(shù)達1億［1］。近70%的女性和50%的男性感染沙眼衣原體后臨床癥狀隱匿，這除了增加了沙眼衣原體的在性活躍的人群中傳播的風險外，還可以導致沙眼衣原體上行感染，從而引發(fā)更為嚴重的后遺癥［2?3］。治療后沙眼衣原體陽性，在性活躍的人群中是一個很常見的現(xiàn)象，可能原因有再感染或治療失敗?；蚍中褪菂^(qū)分再感染和感染治療失敗的一種常用方法。沙眼衣原體傳統(tǒng)的ompA基因分型的型別有限，在特定人群中型別的分布比較集中［4?6］。沙眼衣原體多位點序列分型（MLST）由Markus等首次研發(fā)并應用，比以ompA為基礎的分型技術具有更高的分辨力［7］。該方法選用沙眼衣原體的5個基因即CT046（hctB）、CT058、CT144、CT172和CT682（pbpB），目前已成功對來自16個國家不同人群的2 089例沙眼衣原體感染者的標本進行分型［8］。我們對廣西泌尿生殖道沙眼衣原體臨床株進行ompA分型和hr?MLST分型，了解沙眼衣原體的型別分布以及隨訪患者的沙眼衣原體感染情況。

資料和方法

一、標本收集

2014年5月至2015年9月在廣西壯族自治區(qū)皮膚病防治所收集病例。經(jīng)過沙眼衣原體抗原檢測試劑盒（乳膠法）［艾博生物技術（杭州）有限公司］初篩，共收集44例實驗室確診的沙眼衣原體感染患者標本。其中男性尿道拭子標本32份，女性宮頸拭子標本12份，均于-70℃保存，冷鏈運送至性病中心參比實驗室。本研究通過中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。所有初篩陽性的患者在獲取檢查報告時，填寫知情同意書后，由實驗室工作人員采用統(tǒng)一的調(diào)查表對其進行基本信息、疾病相關信息、治療相關信息的采集，并告知患者在治療完成后3～5周進行復診。有16例患者遵醫(yī)囑用藥并在規(guī)定的時間內(nèi)進行復診，對這些患者在治療期間是否采取了保護性措施進行調(diào)查并征得其同意后，繼續(xù)留取標本。標本處理同初篩標本的采集和處理。

二、DNA提取和核酸檢測

使用德國Qiagen公司生產(chǎn)的QIAxtractor全自動核酸純化儀提取DNA，實驗操作按照說明書及提取液樣本的試驗方案進行。參照沙眼衣原體核酸檢測試劑盒說明書（廣州中山大學達安基因股份有限公司）進行沙眼衣原體核酸檢測。

三、ompA和hr?MLST基因分型

參照烏拉普斯大學沙眼衣原體MLST數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http：//mlstdb.bmc.uu.se）提供的引物序列、PCR反應體系和擴增程序進行。各分型基因的引物見表1。所有的引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成，PCR總反應體系為25 μl，包括5 μl DNA標本，2×Premix Taq（反應預混液），上下游引物（最終濃度為0.4 μmol/L），擴增程序如下：95 ℃變性15 min，擴增40個循環(huán)（94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃90 s），72℃延伸10 min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物送至上海頂卓生物科技有限公司進行純化，對目的基因擴增產(chǎn)物進行雙向測序。測序完成后，進入網(wǎng)站http：//mlstdb.bmc.uu.se/查詢，獲取每個標本每個基因等位基因的型別，最后綜合5個基因的等位基因型別查詢獲得該菌株的基因型別。利用Pubmed網(wǎng)站的BLAST數(shù)據(jù)庫進行序列比對獲得該菌株的ompA基因型別。每個標本的6個基因位點均能成功擴增并測序方可進行后續(xù)分析。ompA和MLST分型實驗均使用由E?bour（VR?348B）株（美國ATCC公司）提取DNA進行質(zhì)控。

表1 沙眼衣原體巢式PCR的引物序列

四、數(shù)據(jù)分析

在 PubMed網(wǎng)站選用關鍵詞“MLST”和“Chlamydia trachomatis”進行文獻搜索，共檢出26篇文獻，全文下載閱讀后僅有1篇文獻公布了每例患者的MLST型別［9］。利用BioNumerics 7（比利時Applied Maths公司）軟件進行聚類分析。

結 果

一、臨床資料

共收集感染者標本44份，隨訪標本16份。所有感染者標本核酸檢測均為陽性，隨訪者標本中有6份核酸檢測為陽性。所有核酸檢測陽性的標本（50份）均進行ompA和hr?MLST基因分型，其中42份標本所有的基因均得到有效擴增，可以進行后續(xù)測序分析，有效分型率84.0%（42/50）。ompA成功分型43份，MLST中CT058基因的分型成功份數(shù)最少，為42份；多重感染在本研究中未發(fā)現(xiàn)。

44例感染者中男32例（72.7%），女12例（17.3%），年齡（35.75±11.24）歲；漢族38例（86.4%），壯族6例（13.6%）；11例患者未婚，占25.0%；來自南寧市20例，來自廣西其他城市21例，來自福建和廣東3例。25例患者因尿道不適癥狀就診，14例因泌尿生殖道出現(xiàn)異常分泌物就診，4例因性伴感染自行體檢就診，1例未回答。病程（15.3±9.7）d，最短5 d，最長45 d。29例（65.9%）患者就診前3個月內(nèi)與臨時性伴發(fā)生性關系，其中22例（75.9%）為商業(yè)性行為。

44例感染者經(jīng)過治療后共有16例（36.4%）患者在治療4周后進行了隨訪。隨訪中男12例，女4例，4例未婚，12例已婚。來自南寧8例，來自其他城市8例。11例（68.8%）在就診前3個月與臨時性伴發(fā)生性關系，其中9例（81.8%）為商業(yè)性行為。該16例患者均遵醫(yī)囑服藥。16例中有6例（37.5%）經(jīng)核酸檢測仍為陽性。

二、沙眼衣原體ompA基因型別及MLST型別分布

在成功擴增的42例沙眼衣原體菌株中，發(fā)現(xiàn)ompA基因型7種，hr?MLST分型的ST型別15種，其中有3種為新發(fā)現(xiàn)的MLST型別，占7.1%（3/42）。E型（28.6%）、F型（26.2%）和D型（19.1%）為主要流行ompA基因型別，E?3（26.2%）、F?110（21.4%）和J?264（16.7%）為主要流行的ompA?hrMLST型別。見表2。

對來自廣西性病門診患者的42株與來自意大利在校學生的40株沙眼衣原體菌株的ST型別進行最小生成樹分析，結果顯示這些菌株可以分成6個簇，其中簇Ⅰ和簇Ⅳ來自意大利，簇Ⅲ（n=10）來自廣西；簇Ⅱ、簇Ⅴ和簇Ⅵ均為混合簇，簇Ⅵ來自廣西7例和意大利4例，簇Ⅴ中僅有1株來自廣西，其余6株均來自意大利，簇Ⅱ中僅有3株來自意大利，其余12株均來自廣西。廣西地區(qū)的菌株基本與意大利的菌株獨自形成簇。見圖1。

隨訪16例患者均遵醫(yī)囑服藥，有5例患者在治療期間進行了保護性性生活。隨訪標本經(jīng)核酸檢測后有6例陽性，6例患者均在治療期間未進行性生活，3例成功進行基因分型，其中2例ompA基因型別不一致，3例MLST型別均不一致，可判斷為再感染，其余3例因型別未鑒定無法判別。

討 論

MLST是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法，通過分析多個管家基因450 bp左右的核心片段的核酸序列對菌株的等位基因進行多樣性比較。沙眼衣原體MLST官方網(wǎng)站上選用7個看家基因（enoA、fumC、gatA、gidA、hemN、flX、oppA）［10］，至今共得到44種基因型別；Uppsala大學選用5個基因［CT046（hctB），CT058，CT144，CT172，CT682（pbpB）］［7］，目前收錄型別415個，是目前應用廣泛的沙眼衣原體MLST分型方案，已經(jīng)被MLST網(wǎng)站收錄。

表2 廣西性病門診患者沙眼衣原體hr?MLST和ompA型別分布

圖1 廣西性病門診患者與意大利在校學生沙眼衣原體MLST分型的最小生成樹 每個圓圈代表1個ST型別，圓圈的大小代表相同ST型別菌株的多少；綠色圓圈表示廣西菌株，紅色圓圈表示意大利菌株。陰影代表集群

我們首次報道廣西沙眼衣原體的MLST型別分布，發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體MLST型別分布，與意大利報道的年輕大學生有較為明顯的差異［9］，同時還發(fā)現(xiàn)3種新MLST型別。Versteeg等［11］對我國南京地區(qū)性病門診患者感染的沙眼衣原體進行MLST分析，在成功分型的91例標本中分出34種型別，其中24種為當時數(shù)據(jù)庫未收錄的型別，聚類分析發(fā)現(xiàn)南京菌株較荷蘭阿姆斯特丹菌株有著獨特的菌株，同時有部分重疊，這些地理距離較遠的國家具有相似ompA?MLST型別沙眼衣原體菌株的主要原因可能是這些菌株的基因組比較穩(wěn)定，存在于這些國家很長一段時間，這些ST型別可能即為所謂的起源菌株。此外也有可能是這些菌株內(nèi)在的毒力較強可以感染分布在世界各人群［12］。但我們的研究只局限于廣西的一個性病門診，收集菌株的代表性不夠。8例患者標本ompA?MLST分型沒有成功，其DNA含量均為1×103拷貝/ml左右，沒有能夠成功分型可能與標本的DNA含量較低有關，但標本中沙眼衣原體DNA含量的差異與基因型別之間無相關性［13?14］，這些沒有被成功分型的菌株是否會影響菌株型別的分布以及是否存在新的基因型別菌株尚不知。

如何在隨訪的患者中區(qū)分沙眼衣原體的再感染和原感染治療失敗對于沙眼衣原體感染的預防控制有著重要的意義：對于再感染，應對方案是加快性伴的治療、提倡安全的性行為；對于感染治療失敗，應對現(xiàn)有治療方案調(diào)整［14］。本研究44例患者中僅有16例患者進行了隨訪，隨訪率較低。6例患者在隨訪中檢測為陽性，3例隨訪的標本基因型別與初診時的標本不一致，因此均為再次新發(fā)感染。G?tz等［15］對27例隨訪且再檢測陽性患者的初診和隨訪標本進行MLST分型，發(fā)現(xiàn)63%患者初診和隨訪時感染的沙眼衣原體型別不一致。對于治療失敗的病例一般需要更換治療方案，但確診為再感染則只需沿用原治療方案繼續(xù)治療。在臨床上，應該加強患者的隨訪意識，并通過有效的基因分型手段輔助鑒定隨訪中沙眼衣原體陽性患者感染的類型，從而更好地指導臨床。

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（本文編輯：尚淑賢）

奧絡?夫西地酸乳膏有獎征文通知

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征文要求：①尚未在雜志上公開發(fā)表的文章；②研究未曾獲得澳美中國研究基金資助；③寫作符合《中華皮膚科雜志》稿約規(guī)定；④應用于濕疹、激光術后、大皰病等臨床研究請參考擬定的研究方案。

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香港澳美制藥廠有限公司有權使用應征文章，并對本次活動擁有最終解釋權。咨詢電話：021-63200090產(chǎn)品部。

阿維A（方希）治療特殊皮膚病病例有獎征集通知

一、征稿范圍和要求

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稿件要求：①參賽病例均未在國內(nèi)外醫(yī)學期刊上發(fā)表；②病例資料完整，包括疾病描述、體檢、皮膚科檢查、臨床圖片、病理圖片（必要時提供）、診斷、治療、討論；③完整病例稿件包括word文檔和PPT文檔各1份。

二、活動細則

1.全國收集的病例，由專家顧問團評選出一、二、三等獎各1名、2名、3名，共6名進行獎勵表彰，凡參與者均有參與獎。重慶華邦制藥有限公司對獲獎和參賽病例享有使用權。

2.獎勵：①獲一、二、三等獎第一作者分別獲得價值5 000、1 500、500元的獎品，并頒發(fā)獲獎證書；②參與獎：符合征集要求的第一作者獲得價值100元的紀念品。

3.征稿時間：2016年2月1日至10月31日。

4.投稿途徑：將病例郵件發(fā)至fangxihuabang@126.com并寫清聯(lián)系人、單位和聯(lián)系方式，郵件主題名：阿維A治療特殊皮膚病病例有獎征集。對符合《中華皮膚科雜志》或《中國皮膚性病學雜志》要求的病例，推薦發(fā)表。

詳情致電市場部023?67886926，或向當?shù)乇竟踞t(yī)學支持人員咨詢。重慶華邦制藥有限公司保留對本次活動的解釋權。

High?resolution multilocus sequence typing of urogenital Chlamydia trachomatis among STD clinic outpatients in Guangxi Zhuang Autonomous Region

Han Yan,Yin Yueping,Zhu Bangyong,Liu Hongye,Zhong Mingying
Reference Laboratory of STD,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;National Center for Sexually Transmitted Disease Control,China Center for Disease Control and Prevention,Nanjing 210042,China（Han Y,Yin YP,Liu HY,Zhong MY）;Central Laboratory,Institute of Dermatology of Guangxi Zhuang Autonomous Region（Zhu BY）

ObjectiveTo investigate the type distribution of urogenitalChlamydia trachomatis（Ct）among STD clinic outpatients in Guangxi Zhuang Autonomous Region,and to estimate the prevalence of Ct infection among the patients during posttreatment follow?up.MethodsUrethral and cervical swabs were collected from male and female outpatients with confirmed urogenital Ct infection,respectively,in Institute of Dermatology of Guangxi Zhuang Autonomous Region.The patients with positive results in preliminary screening tests were followed up after treatment,and specimens were collected at follow?up visits.General and clinical information was also obtained from these patients.DNA was extracted from these samples by using the QIAxtractor instrument.Nested PCR was performed to amplify the major outer membrane protein A（ompA）gene for ompA typing,and to amplify CT046（hctB）,CT058,CT144,CT172 and CT682（pbpB）genes for high?resolution multilocus sequence typing（hr?MLST）.Then,PCR products were sequenced,and ompA and MLST types of Ct were determined by sequence alignment and MLST analysis,respectively.The obtained MLST sequence types（STs） were compared with those from an Italian population by using the BioNumerics7 software,and a minimum spanning tree（MST）was generated.ResultsTotally,44 and 6 Ct?positive specimens were collected at first visits and follow?up visits respectively.Among the 50 specimens,42 underwent successful ompA typing and hr?MLST,and 7 ompA genotypes and 15 hr?MLST STs were identified,including 3 first reported STs.The distribution of STs of Ct isolates from Guangxi Zhuang Autonomous Region was significantly different from that from the Italian population.Among the 6 followed patients with posttreatment Ct infection,3 were confirmed to be reinfected with Ct,and the other 3 failed to be diagnosed because of unsuccessful genotyping.ConclusionThe genotypes of Ct strains isolated from STD clinic outpatients in Guangxi Autonomous Region were characteristic,and Ct reinfection occurred in some patients during follow?up.

Chlamydia trachomatis;Multilocus sequence typing;Follow?up studies;Cluster analysis

Yin Yueping,Email:yinyp@ncstdlc.org

2016?01?26）

尹躍平，Email：yinyp@ncstdlc.org

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.10.003

北京協(xié)和醫(yī)學院協(xié)和青年基金（33320140135）

Fund program:PUMC Youth Fund（33320140135）