宋昊 王白鶴 邵雪寶 程偉 熊競(jìng)舒 王小坡 王建 曾學(xué)思 徐秀蓮 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科

CCL18在惡性黑素瘤中的表達(dá)及其與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、Ki67表達(dá)的相關(guān)性研究

宋昊 王白鶴 邵雪寶 程偉 熊競(jìng)舒 王小坡 王建 曾學(xué)思 徐秀蓮 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科

目的探討趨化因子配體18（CCL18）在惡性黑素瘤（惡黑）組織中的表達(dá)和臨床意義，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、Ki67表達(dá)的相關(guān)性。方法用免疫組化方法檢測(cè)58例惡黑石蠟標(biāo)本中CCL18、VEGF及細(xì)胞增殖核抗原Ki67的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)20例色素痣石蠟標(biāo)本中CCL18的表達(dá)水平。對(duì)CCL18的表達(dá)與惡黑臨床病理及VEGF、Ki67的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。用免疫熒光方法驗(yàn)證CCL18在惡黑組織中的表達(dá)。結(jié)果CCL18在惡黑組陽(yáng)性率為84.48%（49/58），而在色素痣組均無(wú)表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=45.46，P＜0.01）。CCL18在惡黑的表達(dá)與腫瘤Clark分級(jí)、Breslow厚度呈正相關(guān)（rs值分別為0.609、0.644，均P＜0.01）；在有無(wú)潰瘍以及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。CCL18的表達(dá)在不同性別、年齡、肢端/非肢端惡黑患者組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。惡黑中CCL18陽(yáng)性表達(dá)水平與VEGF表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs=0.727，P＜0.05），與Ki67表達(dá)水平無(wú)相關(guān)（P＞0.05）。免疫熒光顯示，惡黑組織中腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)CCL18。結(jié)論CCL18在惡黑組織中高表達(dá)，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系。

痣和黑素瘤；趨化因子CCL18；病理過(guò)程；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類；Ki?67抗原

趨化因子配體18（CCL18）是一種CC型趨化性細(xì)胞因子，主要由M2型單核/巨噬細(xì)胞或樹(shù)突細(xì)胞分泌，可作為基本細(xì)胞因子維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，其基因位于染色體17q11.2［1］。目前研究表明，淋巴及外周組織中單核細(xì)胞表達(dá)的CCL18可能促進(jìn)炎癥及病理狀態(tài)下淋巴細(xì)胞及未成熟樹(shù)突細(xì)胞的趨化，并影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)［2?3］。CCL18因子在惡性黑素瘤（惡黑）中的作用不清楚，我們通過(guò)檢測(cè)惡黑、色素痣組織中CCL18的表達(dá)，探討CCL18在惡黑組織中的表達(dá)意義。

資料與方法

1.資料：2012—2015年中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院經(jīng)臨床、組織病理學(xué)及免疫組化確診的58例惡黑（包括原位黑素瘤15例，侵襲性黑素瘤43例，其中轉(zhuǎn)移性黑素瘤5例）和20例色素痣石蠟標(biāo)本。58例惡黑患者中，男26例，女32例；年齡26～86歲，平均59歲，其中20～59歲25例，60～86歲33例。病程0.3個(gè)月至8年。皮損位于肢端者45例，非肢端者13例。伴發(fā)潰瘍者34例，不伴潰瘍者24例。Clark分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)29例，Ⅲ～Ⅴ級(jí)29例。Breslow厚度≤1 mm 14例，1～2 mm 13例，2～4 mm 23例，＞4 mm 8例。2例惡黑及對(duì)照正常皮膚新鮮組織標(biāo)本取自2016年4月本院經(jīng)臨床、組織病理及免疫組化確診并手術(shù)擴(kuò)大切除的惡黑患者。

2.主要試劑：CCL18免疫組化抗體為濃縮型兔抗人多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、Ki67均為即用型兔抗人單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。DAB酶底物顯色試劑盒和即用型快捷免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。CCL18免疫熒光抗體為鼠抗人單克隆抗體（美國(guó)RD Systems公司）。免疫熒光二抗為Alexa Fluor?488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（南京福麥斯生物技術(shù)有限公司）。

3.免疫組化法檢測(cè)石蠟標(biāo)本CCL18、VEGE、Ki67：石蠟切片脫蠟至水，65℃水浴孵育45 min至1 h脫色素檸檬酸/乙二胺四乙酸（EDTA）緩沖液高壓修復(fù)6 min；滴加一抗，4℃冰箱孵育過(guò)夜，滴加二抗，室溫孵育15 min，3，3′?二氨基聯(lián)苯氨四鹽酸鹽（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染。磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，廠家提供已知陽(yáng)性片做陽(yáng)性對(duì)照。

4.免疫熒光法檢測(cè)新鮮組織標(biāo)本CCL18：新鮮組織冰凍切片經(jīng)4%甲醛液固定10 min，Triton X?100通透15 min，免疫染色封閉液封閉1 h；滴加一抗，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，滴加二抗，室溫孵育1 h，4′，6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI）染色3 ～ 5 min。封片后激光共聚焦顯微鏡觀察。

5.免疫組化結(jié)果判定：CCL18陽(yáng)性表現(xiàn)為顯微鏡下細(xì)胞胞質(zhì)棕黃色染色，在高倍鏡（×400）下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分率及染色強(qiáng)度評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：不著色計(jì)0分，＜25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，＞50%計(jì)3分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：不著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，深褐色計(jì)3分。二項(xiàng)乘積得最終評(píng)分。最終評(píng)分：（-）計(jì)0分，（+）計(jì)1～ 3分，（++）計(jì)4～6分，（+++）計(jì)＞6分。VEGF陽(yáng)性表現(xiàn)為胞膜或胞質(zhì)棕黃色染色：根據(jù)染色強(qiáng)度分為4級(jí)：陰性（-），弱陽(yáng)性（+），中度陽(yáng)性（++），強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。Ki67陽(yáng)性表現(xiàn)為胞核棕黃色顆粒沉著，取5個(gè)高倍（×400）視野，以陽(yáng)性細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的平均值計(jì)算Ki67陽(yáng)性率，分為4級(jí)：（-）為不著色，（+）為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) ＜ 5%，（++）為5% ～ 50%，（+++）為 ＞ 50%。結(jié)果由兩名皮膚病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片進(jìn)行，每張組化切片均同時(shí)行HE染色對(duì)照。

6.共聚焦顯微鏡觀察：樣品在激光共聚焦顯微鏡（日本Olymplus公司）下掃描。胞核染色為藍(lán)色熒光，CCL18陽(yáng)性表達(dá)的胞質(zhì)染色為綠色熒光，計(jì)算機(jī)采集數(shù)據(jù)并合成圖像。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSSl9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組獨(dú)立等級(jí)資料的非參數(shù)檢驗(yàn)采用Mann?WhitneyU檢驗(yàn)，等級(jí)資料相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.CCL18在惡黑組織及色素痣組織中的表達(dá)：CCL18在20例色素痣均無(wú)表達(dá)，在58例惡黑有49例有CCL18陽(yáng)性表達(dá)（圖1A），陽(yáng)性率為84.48%，而且CCL18與人黑素瘤標(biāo)志物Melan?A（T細(xì)胞識(shí)別黑素瘤抗原，圖1B）在同一組織中的陽(yáng)性分布一致。CCL18在惡黑組的表達(dá)明顯高于色素痣組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=45.46，P＜0.01）。2例新鮮標(biāo)本免疫熒光染色示CCL18在2例惡黑組織腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)（圖2A），而CCL18在2例正常皮膚組織中不表達(dá)（圖2B）。

2.惡黑組織中CCL18與VEGF、Ki67表達(dá)水平的相關(guān)性：VEGF在惡黑標(biāo)本中均存在不同程度的表達(dá)（圖1C），Ki67在大部分惡黑標(biāo)本中弱陽(yáng)性或陽(yáng)性表達(dá)（圖1D）。CCL18表達(dá)水平與VEGF表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs=0.727，P＜0.01），與Ki67表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 免疫組化檢測(cè)惡性黑素瘤組織中蛋白表達(dá)（EnVision法×100） 1A：趨化因子配體18CCL18在腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，胞質(zhì)呈棕黃色；1B：T細(xì)胞識(shí)別黑素瘤抗原在腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，胞質(zhì)呈棕黃色；1C：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在部分細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)呈棕黃色染色；1D：細(xì)胞增殖核抗原Ki67在部分細(xì)胞胞核呈棕黃色染色 圖2 免疫熒光染色檢測(cè)皮膚惡性黑素瘤患者趨化因子配體18的表達(dá)2A：惡性黑素瘤組織中，CCL18在腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，呈綠色熒光；2B：正常皮膚組織中，CCL18不表達(dá)

表1 惡性黑素瘤CCL18與Ki67、VEGF表達(dá)的關(guān)系

3.惡黑組織中CCL18表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系：見(jiàn)表2。CCL18表達(dá)水平與惡黑Clark分級(jí)、Breslow厚度呈正相關(guān)（rs分別為0.609、0.644，均P＜0.01），在有無(wú)潰瘍、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），有潰瘍組CCL18表達(dá)水平高于無(wú)潰瘍組，有轉(zhuǎn)移組CCL18表達(dá)水平高于無(wú)轉(zhuǎn)移組。而CCL18表達(dá)水平在不同性別、年齡、部位（肢端/非肢端）組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

討 論

研究表明，惡黑組織中存在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞即M2型巨噬細(xì)胞，并與惡黑的侵襲和轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系，發(fā)揮促癌作用［4］。CCL18是M2型巨噬細(xì)胞分泌的一種趨化性細(xì)胞因子，除了在炎癥過(guò)程中激活和趨化白細(xì)胞，CCL18還在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤中表達(dá)升高，參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、促進(jìn)血管生成，最終促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。

目前對(duì)CCL18在惡黑發(fā)生發(fā)展中的作用尚無(wú)研究，辛崇美等［5］通過(guò)細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，CCL18有促進(jìn)A375細(xì)胞侵襲的作用，并明顯促進(jìn)腫瘤血管生成，其表達(dá)提示惡黑獲得更高的侵襲能力［6?7］。本研究結(jié)果顯示，CCL18表達(dá)在惡黑組織中升高，與腫瘤Clark分級(jí)、Breslow厚度呈正相關(guān)，并在腫瘤形成潰瘍或發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況下CCL18表達(dá)增高，表明CCL18在惡黑中具有促進(jìn)腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的促癌作用。

為了進(jìn)一步評(píng)估CCL18與惡黑增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，我們選取了與增殖相關(guān)的抗原Ki67以及與血管生成相關(guān)的抗原VEGF進(jìn)行研究。有研究表明Ki67抗原與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)［8］。VEGF能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分裂，誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中新生血管形成，并增加血管通透性，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［9?10］。本文結(jié)果顯示，在惡黑中CCL18的表達(dá)與Ki67的相關(guān)性不明顯，表明CCL18對(duì)惡黑細(xì)胞的增殖活性可能無(wú)明顯影響，但CCL18的表達(dá)水平與VEGF的表達(dá)有相關(guān)性，與辛崇美等［5］CCL18有促進(jìn)腫瘤血管生成的研究，結(jié)果一致。說(shuō)明CCL18在惡黑的血管形成中發(fā)揮重要作用。

表2 CCL18在惡性黑素瘤組織中的表達(dá)及其與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

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Expression of CC chemokine ligand 18 in cutaneous malignant melanoma tissues and its relationship with vascular endothelial growth factor and Ki67 antigen expressions

Song Hao,Wang Baihe,Shao Xuebao,Cheng Wei,Xiong Jingshu,Wang Xiaopo,Wang Jian,Zeng Xuesi,Xu Xiulian,Sun Jianfang
Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo measure the expression of CC chemokine ligand 18（CCL18）in cutaneous malignant melanoma（CMM）tissues,and to explore its clinical significance,as well as relationship with vascular endothelial growth factor（VEGF）and Ki67 antigen expressions.MethodsImmunohistochemistry was performed to measure CCL18,VEGF and Ki67 expressions in 58 paraffin?embedded CMM tissue specimens,as well as CCL18 expression in 20 paraffin?embedded pigmented nevus specimens,and immunofluorescence assay to confirm the expression of CCL18 in fresh CMM tissue specimens.Correlations of CCL18 expression with CMM clinicopathologic features,VEGF and Ki67 expressions were analyzed.ResultsCCL18 was detected in 49（84.48%）of 58 paraffin?embedded CMM specimens,but in none of the 20 paraffin?embedded pigmented nevus specimens,with a significant difference in the positive rate of CCL18 between the CMM group and pigmented nevus group（χ2=45.46,P＜ 0.01）.The expression of CCL18 in paraffin?embedded CMM tissues was positively correlated with Clark′s level and Breslow thickness of CMM（rs=0.609,0.644 respectively,bothP＜ 0.01）,and was significantly different between ulcerated and non?ulcerated CMM（P＜ 0.05）,as well as between patients with and without lymphatic metastasis（P＜ 0.05）.However,there were no significant differences in the expression of CCL18 among patients of different age,gender,or between acral and non?acral CMM（allP＞0.05）.In addition,the expression of CCL18 in CMM tissues was positively correlated with that of VEGF（rs=0.727,P＜ 0.05）,but unrelated to that of Ki67（P＞ 0.05）.Immunofluorescence assay showed CCL18 expression in the cytoplasm of tumor cells in CMM tissues.ConclusionCCL18 is highly expressed in CMM tissues,and may be involved in tumor invasion and metastasis.

Nevi and melanomas;Chemokine CCL18;Pathologic processes;Vascular endothelial growth factors;Ki?67 antigen

s:Xu Xiulian,Email:xxlqjl@sina.com;Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

2016?01?29）

（本文編輯：尚淑賢）

徐秀蓮，Email：xxlqjl@sina.com；孫建方，Email：fangmin5758@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.10.002

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