王京京，魏麟，陳斌*

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豬胰島素誘導1基因的cDNA克隆和差異表達及蛋白質序列分析

王京京1，魏麟2，陳斌1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，湖南長沙 410128；2.懷化學院生物與食品工程學院，湖南懷化 418000)

克隆豬胰島素誘導1()基因，并對其蛋白質序列進行分析。根據(jù)人基因的保守序列設計1對引物，以豬總RNA為模板，經(jīng)RT–PCR獲得基因序列，通過相對熒光定量PCR分析該基因在不同組織中的表達量；將基因序列連接到pMD19–T Simple載體上，用PCR檢測陽性克隆后測序，并對克隆得到的基因進行生物信息學分析。結果表明，基因在肺中的表達量最高，其次是在肝臟，再次是在脾臟，在心臟中的表達量最低；通過克隆，獲得了一段999 bp的序列，其中831 bp的開放閱讀框編碼276個氨基酸；該蛋白不含信號肽序列，與其他動物基因氨基酸序列的一致性在71%以上。

豬；胰島素誘導1基因；基因克??；序列分析

胰島素誘導基因(insulin induced gene,)是近年來被發(fā)現(xiàn)在脂肪代謝調控方面起重要作用的基因[1]，是其中的一個亞型[2]。Mohn等[3]于1991年在小鼠肝臟以及鼠H35肝癌細胞中分離到的mRNA； Peng等[4]最早從再生肝臟中克隆得到了基因；基因能使固醇調節(jié)元件結合蛋白(sterol regulatory element–binding protein, SREBPS)家族成員激活，通過與3–羥基–3–甲基戊二酰輔酶A 還原酶(3–hydroxy–3–methylglutary– CoA reductase, HMGR)的固醇敏感域(sterol sensing domain, SSD) 和SRE BPS裂解活化蛋白(SREBPS cleavage activating protein, SCAP)結合，調節(jié)膽固醇的合成，調控脂肪代謝。是反饋調節(jié)膽固醇和脂肪合成的重要因子，能有效調控脂肪細胞的分化、成熟與脂質合成[6]?；虮磉_產(chǎn)物在脂質合成的反饋調節(jié)中起重要作用。基因受多種物質的調節(jié)，在不同物種、不同組織中的表達量也不同。近年來，人類和小鼠基因的克隆、分離、表達和調控成為熱點。邱歡[7]對基因進行了染色體定位和生物學特征鑒定；朱亞南等[8]研究了基因在豬前體脂肪細胞分化過程的表達。除上述報道外，其他關于豬基因的報道較少。本試驗中采用RT–PCR方法克隆基因的cDNA片段，檢測該基因在豬不同組織器官中的特異性表達，對其進行測序并進行生物信息學分析?，F(xiàn)將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

采集黔邵花豬的心臟、肝臟、脾臟、肺、胃、腎臟和肌肉共7種樣品，清洗干凈后用乙醇擦拭，經(jīng)焦酸二乙酯(DEPC)水處理后，–80 ℃冷凍保存，備用。

RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA回收純化試劑盒、熒光定量試劑盒SYBR Prime ScriptTMRT–PCR Kit、酶、pMD19–T Vector載體、菌種JM109、DNA相對分子質量標記、T4DNA連接酶及電泳類試劑等，均購自TaKaRa公司。

1.2引物設計

用Oligo 6軟件設計所有引物序列。根據(jù)NCBI/GenBank中登錄的人基因序列(NM_005542)，設計1對豬的特異性克隆引物。上游引物F，5–GCCGGATCCATGCCCAGACT GGACGACCA–3；下游引物R，5–ACCGAATTCTC AGTCGCTGTGTGGCTT–3。采用實時熒光定量PCR檢測豬基因表達水平的引物(上游引物，AGCGGCCACACCAACAGCTGG；下游引物，TGGCTGTCGATGCAGGGGTA)。以甘油醛–3–磷酸脫氫酶()基因為參照，根據(jù)NCBI/ GenBank中登錄的豬基因(NM_ 001206359)序列設計其特異性引物(上游引物，CACTGACACG TTGGCAGTGG；下游引物，CATGGAGAAGGCTG GGGCTC)。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1豬基因的克隆與測序

按照Trizol試劑說明書提取豬心臟、肝臟、脾臟、肺、胃、腎臟和肌肉的RNA，檢測RNA的純度和濃度。根據(jù)cDNA合成試劑盒說明書進行cDNA鏈合成。將反轉錄產(chǎn)物分離純化。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19–T Vector載體連接，轉到JM109感受態(tài)細胞中。挑取陽性菌落培養(yǎng)過夜，將獲得的重組子用I和I雙酶切鑒定。提取質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3.2相對熒光定量PCR表達分析

采用相對熒光定量PCR方法，按照熒光定量試劑盒SYBR Prime ScriptTMRT–PCR Kit的操作說明，以基因的表達為對照，以SYBR為熒光染料，檢測基因在豬心臟、肝臟、脾臟、肺、胃、腎臟和肌肉中的相對表達量。用ABI 7500實時定量PCR儀進行檢測。反應體系：總RNA 2 μL，隨機引物(100 μmol/L)1 μL，寡聚胸苷酸引物(50 μmol/L)1 μL，反轉錄酶1 μL，5×緩沖液4 μL，補ddH2O至20 μL。熒光定量PCR擴增反應體系：cDNA模板2 μL，上下游引物(10 μmol/L)均為0.375 μL，2×SYBR Premix ExTM 10 μL，50×ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，補ddH2O至20 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性20 s，60 ℃復性30 s，35個循環(huán)。每個試驗重復3次。采用Excel和ABI 7500 PCR儀的Sequence Detection software 軟件[9]對數(shù)據(jù)進行分析。

1.3.3生物信息學分析

采用Expasy在線軟件(http://expasy.org/tools)與DNA Star進行序列分析。編碼蛋白氨基酸序列的基本理化性質用ProtParam程序[10]進行分析；信號肽、跨膜結構域、二級結構和三級結構分別用SignalP 4.1 Server[11]軟件、TMHMM Server V. 2.0、SOPMA程序和SWISS–MODEL[12–14]進行預測與分析；用NCBI中的Blastp在線工具進行其他物種的同源氨基酸序列搜索，用MEGA 6.0軟件進行聚類分析。

2　結果與分析

2.1基因的克隆與測序

提取的豬肌肉總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S rRNA 和18S rRNA 條帶清晰(圖1)，提取的RNA完整性較好；經(jīng)純度檢測，260 nm與280 nm比值的平均值為1.91，說明純度較高，可用于后續(xù)試驗。

泳道1和2為樣品總RNA。

以豬基因組cDNA為模板進行PCR擴增，得到的特異性條帶約為999 bp(圖2)。經(jīng)克隆測序，該片段大小與預期目標片段大小相符。

M　DNA Marker 5 000；1　INSIG基因擴增產(chǎn)物。

用I和I內切酶雙酶切鑒定重組質粒，得到2條片段，其中一條約為3 000 bp的pMD19–T線性片段，另一條約為1 000 bp的插入片段(圖3)，片段大小與預期的大小相符。

M　DNA Marker 5 000；1　pMD19–T/INSIG1。

對鑒定正確的重組質粒進行測序，得到的序列長度為999 bp。該序列含有1個完整的開放閱讀框架(ORF)，共編碼276個氨基酸(圖4)。經(jīng)BLAST比對，克隆得到的DNA序列為豬的序列。

圖4　豬INSIG1基因的堿基和氨基酸序列

2.2豬的差異表達

分別以基因為參照，采用熒光定量PCR檢測基因在豬不同組織中的表達量，檢測結果表明，該基因在肺中的表達量最高，其次為肝臟，再次為脾臟，在胃和腎臟中的表達較低，在心臟和肌肉中的表達最低(圖5)。雖然在各組織中均檢測到，但該基因在各組織中的表達量差異顯著，表明其表達具有組織特異性。

圖5　INSIG1基因在不同組織中的相對表達量

2.3豬基因的生物信息學分析

豬理化性質分析結果表明：基因編碼的蛋白含有276個氨基酸殘基，該蛋白的相對分子質量為29 735.2，理論等電點為8.21，其氨基酸組成中亮氨酸含量達12.3%，分子式為C1339H2075N373O372S12，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為32.08，屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為96.41，總平均親水性為0.176。分析豬所編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)該序列不含信號肽，屬于非分泌蛋白。對豬INSIG1進行跨膜區(qū)分析的結果表明，該蛋白有5個跨膜區(qū)，分布在82～104、124～146、186～203、208～230和240～262位氨基酸之間(圖6)。二級結構預測結果顯示，該蛋白由α–螺旋、β–轉角、伸展鏈和無規(guī)卷曲構成，占總蛋白的比例分別為37.68%、6.52%、15.22%和40.58%(圖7)，其三級結構預測結果見圖8。

圖6　TMHMM程序對豬INSIG1跨膜結構的預測結果

圖7　SOPMA對豬INSIG1二級結構的預測結果

圖8　豬INSIG1蛋白三維結構預測結果

2.4豬INSIG1氨基酸序列的一致性和親緣關系分析

氨基酸序列對比結果表明，豬INSIG1與人(NP_005533)、小鼠(NP_705746)、中國倉鼠(NP_001231008)、布氏鼠耳蝠(EPQ19350)、牦牛(ELR49247)、水牛(NP_001277853)、牛(NP_001071377)、山羊(NP_001273017)、雙峰駝(EPY79870)、食蟹猴(NP_001274621)、眼鏡王蛇(ETE72252)、綠頭鴨(EOA96705)和野雞(NP_001026137)的INSIG1氨基酸序列一致性分別為84%、75%、75%、98%、90%、89%、89%、89%、89%、84%、76%、75%和71%，序列的一致性較高，表明基因在進化過程中具有一定的保守性。圖9分析結果顯示：豬與布氏鼠耳蝠、雙峰駝的親緣關系較近，與水牛、山羊、牛、牦牛的親緣關系次之，而與眼鏡王蛇、綠頭鴨、野雞等非哺乳動物的親緣關系相對較遠。

3　討論

有研究表明，西農(nóng)薩能奶山羊基因含有1個831 bp的完整閱讀框，編碼276個氨基酸[15]。本研究獲得的豬基因編碼的氨基酸數(shù)與西農(nóng)薩能奶山羊的一致，比人的INSIG1蛋白氨基酸組成數(shù)少1個，與其他動物INSIG1蛋白氨基酸序列的一致性在71%以上。

據(jù)報道，基因在秦川牛組織中差異表達，且在肝臟中的表達量最高[16]；在西農(nóng)薩能奶山羊10個組織中均有表達，其中在肝臟中的相對表達量最高，在心臟中的相對表達量最低[15]；在鼠肝臟、腎臟的表達量較高，在其他組織的表達量較低[17]。本研究中，基因在豬的7個組織中均有表達，在肺中的表達量最高，其次為肝臟，在心臟中的表達量最低?；蛟诟鹘M織間的表達差異可能與組織功能差異有關，還可能受生長發(fā)育等其他因素影響，如肝臟中基因mRNA的表達量隨肝臟的發(fā)育而變化[18]。

INSIG1是一種跨膜蛋白，TMHMM預測到豬INSIG1蛋白和西農(nóng)薩能奶山羊INSIG1蛋白一樣，只有5個跨膜區(qū)，比人INSIG1蛋白少1個。豬與人INSIG1氨基酸序列的一致性為84%，與哺乳動物的親緣關系相對較近，豬INSIG1序列的一致性較高，表明基因在進化過程中具有一定的保守性。

參考文獻：

[1] 莫朝暉，廖二元．胰島素誘導因子與脂代謝[J]．國際內分泌代謝雜志，2008，28(5)：320–322．DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673–4157.2008.05.010.

[2] Yabe D，Komuro R，Liang G，et al．Liver-specific mRNA for Insig–2 down-regulated by insulin：implications for fatty acid synthesis[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(6)：3155–3160．DOI:10.1073/pnas.0130116100．

[3] Mohn K L，Laz T M，Hsu J C，et al．The immediate-early growth response in regenerating liver and insulin- stimulated H–35 cells：comparison with serum-stimulated 3T3 cells and identification of 41 novel immediate-early genes[J]．Mol Cell Biol，1991，11(1)：381–390．DOI: 10.1128/mcb.11.1.381．

[4] Peng Y，Schwarz E J，Lazar M A，et al．Cloning，human chromosomal assignment，and adipose and hepatic expression of the CL–6/INSIG1 gene[J]．Genomics，1997，43(3)：278–284．DOI:10.1006/geno.1997.4821．

[5] Yang T，Espenshade P J，Wright M E，et al．Crucial step in cholesterol homeostasis：sterols promote binding of SCAP to INSIG–1，a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER[J]．Cell，2002，110(4)：489–500．DOI:10.3410/f.1003998.146257．

[6] Sever N，Yang T，Brown MS，et al．Accelerated degradation of HMG CoA reductase mediated by binding of insig–1 to its sterol-sensing domain[J]．Mol Cell，2003，11(1)：25–33．DOI:10.1016/s1097–2765(02)00822–5．

[7] 邱歡．豬SCAP和INSIG家族基因的克隆、染色體定位及生物學特征研究[D]．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2005.10.7666/d.Y806701．

[8] 朱亞南，李青瑩，任書強，等．胰島素誘導基因1和2在豬前體脂肪細胞分化過程的表達[J]．吉林農(nóng)業(yè)大學學報，2014，36(2)：194–198．DOI:10.13327/j.jjlau.2014. 1911.

[9] Livak K J，Schmittgen T D．Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(–Delta Delta C(T)) method[J]．Methods，2001，25(4)：402–408．DOI:10.1006/meth.2001.1262．

[10] Gasteiger E，Hoogland C，Gattiker A，et al．Protein identification and analysis tools on the ExPASy server[J]. The Proteomics Protocols Handbook，2005：571– 607．DOI:10.1385/1–59259–890–0:571．

[11] Petersen T N，Brunak S，von Heijne G，et al．SignalP 4.0：discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]．Nat Methods，2011，8(10)：785–786．DOI:10. 1038/nmeth.1701．

[12] Arnold K，Bordoli L，Kopp J，et al．The SWISS–MODEL workspace：a web-based environment for protein structure homology modelling[J]．Bioinformatics，2005，22(2)：195–201．DOI:10.1093/bioinformatics/bti770．

[13] Kiefer F，Arnold K，Künzli M，et al．The SWISS- MODEL Repository and associated resources[J]. Nucleic Acids Res，2009，37(Database issue)：D387–D392．DOI: 10.1093/nar/gkn750．

[14] Benkert P，Biasini M，Schwede T．Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models[J]．Bioinformatics，2011，27(3)：343–350．DOI: 10.1093/bioinformatics/btq662．

[15] 王慧，羅軍，胡仕良，等．西農(nóng)薩能奶山羊INSIG–1編碼區(qū)的克隆、序列特征分析和組織表達[J]．西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版)，2013，41(8)：24–30.

[16] Liu Y，Liu X L，He H，et al．Four SNPs of insulin-induced gene 1 associated with growth and carcass traits in Qinchuan cattle in China[J]．Genet Mol Res，2012，11(2)：1209–1216．DOI:10.4238/2012.May.8.3．

[17] Taub R，Mohn K L，Diamond R H，et al．Molecular aspects of insulin-regulated hepatic growth [J].Molecular Biology of Diabetes，1994，46：301–320.

[18] Haber B，Naji L，Cressman D，et al．Coexpression of liver-specific and growth-induced genes in perinatal and regenerating liver：attainment and maintenance of the differentiated state during rapid proliferation[J]. Hepatology，1995，22(3)：906–914．DOI:10.1002/ hep.1840220331．

Cloning and differential expression of insulin induced gene 1 in pig and the analysis on its protein sequence

Wang Jingjing1, Wei Lin2, Chen Bin1*

(1. College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China 2. College of Biological and Food Engineering, Huaihua University, Huaihua, Hunan 418000, China)

The study aims to clone the pig insulin induced gene 1() and conducts its protein sequences analysis. According to conserved sequence genein human, a pair of primers was designed. By adopting pig total RNA as template, thegene sequences was cloned using RT–PCR, then thegene was connected to pMD 19–T Simple vector. The positive clone was sequenced after the identification of clone by PCR, and the sequence characterization was performed from biology information analysis software. The results from relative real-time PCR analysis indicated thattranscript abundance was the highest in lung, next in liver, spleen, and heart in turn. The experiment obtained a 999 bp sequence, of which included 831 bp open reading frame encoded with 276 amino acids. From the results of bioinformatics analysis showed that the protein does not contain signal peptide sequence, and from the results of amino acid sequence alignment showed that pighad high similarity score (more than 71%) with other animals in GenBank.

pig; insulin induced gene 1(); gene clone; sequence analysis

S828.2

A

1007-1032(2016)05-0505-06

2015–12–10

2016–04–06

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(CARS–36)；湖南農(nóng)業(yè)大學青年科學基金項目(14QN27)

王京京(1981--—)，女，湖南常德人，博士研究生，主要從事動物遺傳育種研究，304774418@qq.com；*通信作者，陳斌，博士，教授，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，chenbin7586@126.com

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責任編輯：王賽群

英文編輯：王庫