馮珊珊，楊　博，劉愛琴，武　婧，翟惠虹

(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院：1. 外科學研究室；2. 消化內科，寧夏銀川　750004)

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◇技術方法研究◇

S100A6siRNA的構建及鑒定

馮珊珊1，楊博2，劉愛琴2，武婧2，翟惠虹2

(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院：1. 外科學研究室；2. 消化內科，寧夏銀川750004)

目的利用小片段干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)抑制S100A6蛋白的表達，為研究CacyBP/SIP核轉位機制提供有利的工具。方法設計S100A6的siRNA序列，用脂質體LipofectamineTM2000將siRNA轉染至人結腸癌SW480細胞中，在熒光顯微鏡下觀察轉染效率，用Real-timePCR及Westernblot方法檢測S100A6在人結腸癌SW480細胞內的mRNA和蛋白表達。結果構建了3對S100A6-siRNA，熒光顯微鏡下檢測轉染人結腸癌SW480細胞成功；RT-PCR證明了在SW480細胞內S100A6的mRNA表達顯著降低(P<0.05)；Westernblot證明了SW480細胞內S100A6蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與S100A6si-1、S100A6si-3組相比，S100A6si-2組對S100A6的mRNA和蛋白抑制效果最明顯(P<0.05)。結論成功構建了S100A6-siRNA，為CacyBP/SIP核轉位機制研究提供了有利的工具。

結腸癌；S100A6；siRNA；鈣周期素結合蛋白

鈣周期素結合蛋白[calcyclin(S100A6)-binding-protein,CacyBP]是1998年從小鼠艾氏腹水瘤細胞中發(fā)現(xiàn)的以鈣依賴方式結合S100A6的蛋白[1]；2001年發(fā)現(xiàn)一種人Siah-1結合蛋白(Siah-1interactingprotein,SIP)與CacyBP序列相同，從此命名為CacyBP/SIP[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鈣周期素結合蛋白(CacyBP/SIP)在結腸癌組織及結腸癌SW480細胞中高表達[3-4]。研究還發(fā)現(xiàn)，在結腸癌細胞中，CacyBP/SIP在細胞質表達，給予胃泌素[4-5]、表皮生長因子[6]、前列腺素E2[7]、缺氧[8]刺激后，CacyBP/SIP轉位于細胞核。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CacyBP/SIP核轉位促進了結腸癌細胞的增殖[4]，且CacyBP/SIP核轉位后可能與核內的細胞周期調控因子結合[9]。細胞核是細胞的代謝、生長、分化及遺傳物質的調控中心。因此，CacyBP/SIP核轉位可能與結腸癌的發(fā)生發(fā)展有關，但CacyBP/SIP的核轉位機制尚不明確。根據CacyBP/SIP結構分析，CacyBP/SIP通過Ca2+可以結合S100蛋白家族中的S100A1、S100A6、S100B、S100P[10]。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，S100A6可能導致CacyBP/SIP發(fā)生依賴Ca2+濃度方式的核轉位。因此，本研究通過S100A6-siRNA的構建及鑒定，為CacyBP/SIP的核轉位機制研究提供有利的工具。

1　材料與方法

1.1材料人結腸癌SW480細胞(北京協(xié)和細胞庫)；S100A6-siRNA(上海吉瑪公司)；無內毒素質粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司)；小鼠抗人S100A6單克隆抗體、HRP標記羊抗鼠二抗(Santa公司)；SYBRGreenPCRMasterMix(ABI公司)；逆轉錄cDNA試劑盒(Fermentas公司)；LipofectamineTM2000、Trizol(美國Invitrogen公司)；DNA引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)結腸癌SW480細胞用含有100mL/L胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的IMEM培養(yǎng)液，37 ℃、50mL/LCO2條件下培養(yǎng)，48h更換1次培養(yǎng)液，用2.5g/L胰酶消化傳代，細胞傳代3～4次后進行轉染。

1.2.2S100A6-siRNA引物設計根據GenBank提供的S100A6基因cDNA序列(編號GI：NM_014624)，選擇S100A6的靶點序列設計引物(表1)。

表1S100A6-siRNA序列

Tab.1SequenceofS100A6-siRNA

GenesiRNAsequenceTargetsites陰性對照組Sense:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'Anti-sense:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'S100A6si-1Sense:5'-GCGAAUGUGCGUUGUGUAATT-3'Anti-sense:5'-UUACACAACGCACAUUCGCTT-3'120～138S100A6si-2Sense:5'-GUGGCCAUCUUCCACAAGUTT-3'Anti-sense:5'-ACUUGUGGAAGAUGGCCACTT-3'349～367S100A6si-3Sense:5'-CCUCUCUGAGUCAAAUCCATT-3'Anti-sense:5'-UGGAUUUGACUCAGAGAGGTT-3'624～642

1.2.3基因轉染取對數生長期的SW480細胞，以(5～6)×104/孔細胞接種于6孔板，細胞達到80%～90%融合時進行細胞轉染，轉染前更換無抗生素培養(yǎng)基過夜。按照LipofectamineTM2000步驟轉染siRNA，將7.5μL標記熒光素的陰性對照siRNA轉染至SW480細胞，轉染6h后更換無抗生素的完全培養(yǎng)液，24～72h內熒光顯微鏡下檢測轉染效率。

1.2.4Real-timePCR檢測S100A6-siRNA效率本實驗分為空白組、陰性對照組、S100A6si-1組、S100A6si-2組、S100A6si-3組，檢測轉染72h后各組細胞S100A6的mRNA表達水平。以β-actin為內參，采用Primer4.0軟件設計引物[10](表2)。分別提取各組細胞總RNA，以總RNA為模板反轉錄為cDNA，用SYBRGreenⅠ熒光染料進行PCR擴增。PCR擴增反應條件為：95 ℃預變性，5min；94 ℃變性，20s；退火59 ℃，20s；延伸72 ℃，20s；40個循環(huán)。采用Real-timePCR中相對定量比較Ct值法計算各組S100A6mRNA的相對表達水平，并根據各組表達倍數差異得出抑制率。

表2RT-PCR引物序列和長度

Tab.2SequenceandlengthofS100A6-siRNA

GeneSequenceLengthS100A6Forward:5'-GGGAGGGTGACAAGCACAC-3'Reverse:5'-AGCTTCGAGCCAATGGTGAG-3'79bpβ-actinForward:5'-CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3'Reverse:5'-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3'208bp

1.2.5Westernblot方法檢測各組細胞中S100A6蛋白的表達實驗分組及轉染步驟同上。轉染72h后分別提取各組總蛋白，用BCA蛋白分析試劑測定蛋白濃度。取30μg總蛋白進行100g/LSDS-PAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜進行免疫印跡，以GAPDH為內參，檢測S100A6的蛋白表達水平。

2　結　　果

2.1siRNA陰性對照轉染結腸癌SW480細胞用siRNA陰性對照片段標記熒光素FAM摸索轉染條件，3組S100A6-siRNA按陰性對照條件進行轉染。經檢測，轉染后72h，轉染效率>80%(熒光鏡下細胞數/光鏡下細胞數)，轉染效果較理想，可進行后續(xù)實驗(圖1)。

2.2結腸癌SW480細胞總RNA的表達各組轉染SW480細胞，提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)28S和18S特征性條帶，證明細胞總RNA完整性較好，無明顯降解發(fā)生(圖2)。

2.3結腸癌SW480細胞S100A6mRNA的表達采用Real-timePCR法觀察S100A6在結腸癌SW480細胞內的mRNA表達，β-actin為內參,得到擴增曲線和熔解曲線(圖3)，熔解曲線為單峰，擴增產物特異性好，無引物二聚體形成，實驗結果可靠。

圖1對照siRNA轉染人結腸癌SW480細胞Fig.1ControlplasmidwastransfectedinSW480cells(×400)

A：光鏡下細胞數；B：熒光鏡下細胞數。

圖2SW480細胞總RNA的電泳結果

Fig.2TotalmRNAlevelofSW480cells1. 空白組；2. 對照組；3.S100A6si-1；4.S100A6si-2；5.S100A6si-3。

圖3擴增曲線和熔解曲線

Fig.3Amplificationcurveandmeltcurve

A：擴增曲線；B：熔解曲線。

2.4S100A6mRNA的相對定量結果采用Real-timePCR中相對定量比較Ct值法比較目的基因mRNA的相對含量。結果顯示，siRNA-S100A6實驗組與陰性對照組相比，mRNA的表達明顯降低(P<0.05)；S100A6si的3個實驗組相比，S100A6si-2組抑制效果最好(P<0.05)，抑制率達到87.9%；空白組與陰性對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表3、圖4)。提示從mRNA水平上證明了S100A6-siRNA明顯抑制了SW480細胞內S100A6的表達。

表3各組間S100A6mRNA的表達倍數

Tab.3mRNAexpressionlevelofS100A6-siRNAindifferentgroups

組別ΔCt值△△Ct倍數(2-△△Ct)空白組6.896±0.0440.000±0.0441.000陰性對照組6.891±0.0150.036±0.0150.976S100A6si-1組8.935±0.1102.080±0.1100.237S100A6si-2組9.910±0.1173.055±0.1170.121S100A6si-3組7.632±0.0770.777±0.0770.584

圖4S100A6在結腸癌SW480細胞中的mRNA表達

Fig.4mRNAexpressionlevelofS100A6incolonSW480cells

與對照組比較，*P<0.05；與S100A6si-2比較，#P<0.05。

2.5結腸癌SW480細胞中S100A6蛋白的表達免疫印跡結果證明，S100A6siRNA實驗組的蛋白表達明顯降低(P<0.05，圖5)，S100A6siRNA實驗組與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，S100A6si-2組與S100A6si-1、S100A6si-3組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。提示S100A6si-2組抑制效果最好(P<0.05)，抑制率達到85.0%；空白組與陰性對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示從蛋白水平證明了S100A6在結腸癌SW480細胞內的表達受抑制。

3　討　　論

在胃癌細胞中發(fā)現(xiàn)，胃癌的多藥耐藥性與CacyBP/SIP上調有關，并且CacyBP/SIP可以調控胃癌細胞對化療藥物的應答反應[11]，首次發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP可能是胃癌多藥耐藥治療的潛在靶點。本課題組早期制備了CacyBP/SIP的單克隆抗體[12]。隨后研究了CacyBP/SIP在正常組織及腫瘤組織中的表達，發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP在正常結腸黏膜組織不表達，在結腸癌組織中高表達[3]。進一步研究了CacyBP/SIP在不同大腸組織中的表達，發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP在大腸增生性息肉中不表達，在大腸腺瘤組織、大腸癌組織中高表達。提示CacyBP/SIP可能參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展[13]。研究還發(fā)現(xiàn)，CacyBP/SIP在結腸癌SW480細胞中亦高表達[5]。

圖5S100A6在結腸癌SW480細胞中的蛋白表達

Fig.5ProteinexpressionlevelofS100A6incolonSW480cells

A：S100A6轉染結腸癌SW480細胞的相對蛋白表達量(1：空白組；2：對照組；3：S100A6si-1；4：S100A6si-2；5：S100A6si-3)。B：不同轉染組S100A6/GAPDH的相對表達比較，與對照組比較，*P<0.05；與S100A6si-2比較，#P<0.05。

FILIPEK[14]、WU[15]在小鼠神經母細胞瘤NB-2a細胞和人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中發(fā)現(xiàn)，CacyBP/SIP具有Ca2+依賴的核轉位現(xiàn)象。本課題組在結腸癌SW480細胞中發(fā)現(xiàn)，CacyBP/SIP在細胞質表達，給予胃泌素[4-5]、細胞外刺激因子如表皮生長因子[6]、前列腺素E2[7]、缺氧[8]刺激，可以誘導CacyBP/SIP轉位至細胞核。研究還發(fā)現(xiàn)，在胃癌細胞[16]和結腸癌細胞[5]中，CacyBP/SIP轉位至細胞核后可以促進細胞增殖，使G1期縮短。提示CacyBP/SIP通過核轉位參與了細胞周期調控。我們進一步篩選并驗證了結腸癌核轉位后的下游信號分子[9]。但是CacyBP/SIP的核轉位機制尚不明確。

根據CacyBP/SIP的結構分析，CacyBP/SIP可以和S100蛋白家族、Skp1、tubulin及ERK1/2四個靶蛋白結合[17]，而S100蛋白是唯一依賴Ca2+結合CacyBP/SIP的靶蛋白。因此，S100蛋白可能調控CacyBP/SIP依賴Ca2+濃度的核轉位現(xiàn)象。FILIPEK[1]最早在小鼠艾氏腹水瘤細胞中以S100A6的配體形式發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在結腸癌SW480細胞中，給予Ca2+刺激，S100A6可以與CacyBP/SIP結合。S100A6是分子量為10.5ku的小分子鈣離子結合蛋白，它可以以被動轉運方式通過核膜進入細胞核[18]。S100A6在上皮細胞、纖維細胞及不同的腫瘤細胞中高表達，功能研究中發(fā)現(xiàn)S100A6參與細胞增殖、細胞骨架動力學和腫瘤形成[19]。綜上提示，S100A6可能是在結腸癌細胞中引起CacyBP/SIP核轉位的靶蛋白。

在本課題中，抑制S100A6與CacyBP/SIP結合的方法有兩種：①在CacyBP/SIP的S100A6結合區(qū)構建缺失突變體(CacyBP△S1000A6)；②利用siRNA沉默S100A6的表達。為排除因CacyBP/SIP結構改變而影響其核轉位的情況，本研究選擇沉默S100A6構建siRNA。RNAi可以被誘導(小于22個堿基片段的RNA，稱為小干擾RNA，siRNA)載入到RNA誘導的沉默復合物(RISC)中，使RNA雙鏈特異性被降解，導致相應的基因沉默，是目前用于沉默同源基因轉錄后表達的分子技術。這種由21個堿基合成的siRNA可以在細胞內觸發(fā)基因沉默，并發(fā)現(xiàn)比長片段(如shRNA)的沉默效率更高，尤其是將siRNA導入觸發(fā)基因沉默的細胞中效果更明顯，原因是在Dicer酶表達量低的細胞中，shRNA的基因沉默功能會受到削弱，但是siRNA不會受到影響。本實驗針對人S100A6的mRNA，選擇了3條特異性siRNA靶序列，分別構建了3組siRNA轉染至人結腸癌SW480細胞，轉染S100A6si-2組抑制mRNA和蛋白的表達效果最好，表明S100A6siRNA構建成功。

本研究將S100A6-siRNA轉染至結腸癌SW480細胞，從mRNA和蛋白水平鑒定了S100A6-siRNA沉默了S100A6的表達，為CacyBP/SIP核轉位機制研究提供了有利的工具。

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(編輯卓選鵬)

ConstructionandidentificationofS100A6-siRNA

FENGShan-shan1,YANGBo2,LIUAi-qin2,WUJing2,ZHAIHui-hong2

(1.SurgeryLaboratory; 2.DepartmentofDigestiveDiseases,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

ObjectiveToinhibittheexpressionofS100A6proteinwithshortinterferingRNA(siRNA)soastoprovideausefultoolforstudyingcalcyclin(S100A6)-binding-protein(CacyBP)/SIPnucleartranslocationmechanism.MethodsThesiRNAsoftheS100A6codingsequenceweredesignedandtransientlytransfectedtohumancoloncancerSW480cellsbyLipo-fectamine2000.Westernblotandsemi-quantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)analyseswereusedtoexaminetheexpressionofS100A6inthesetransfectants.ResultsS100A6-siRNAwasconstructedandtransientlytransfectedsuccessfullytohumancoloncancerSW480cellsunderthefluorescencemicroscope.SilentexpressionofS100A6atthemRNAandproteinlevelswasconfirmedbyRT-PCRandWesternblot,respectively(bothP<0.05).TheinhibitoryeffectwasthemostobviousinS100A6si-2group(P<0.05).ConclusionTheavailabletooloftheCacyBP/SIPnucleartranslocationmechanismhasbeenprovidedbyconstructingtheS100A6-siRNA.

coloncancer;S100A6;siRNA;CacyBP/SIP

2016-02-15

2016-05-12

國家自然科學基金資助項目(No.81072040)；寧夏自然科學基金資助項目(No.NZ0897))；寧夏醫(yī)科大學重點資助項目(No.XZ201413)

翟惠虹.E-mail:zhaihuihong@263.net

R57

A

10.7652/jdyxb201605028

SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81072040),theNaturalScienceFoundationofNingxia(No.NZ0897),andtheKeyResearchFundsofNingxiaMedicalUniversity(No.XZ201413)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160805.1016.012.html(2016-08-05)