肖　穎，劉永亮

(1. 唐山市工人醫(yī)院放化療科；2. 唐山市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山　063000)

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◇中醫(yī)藥研究◇

葡萄籽原花青素對(duì)放射性腦損傷大鼠學(xué)習(xí)能力和ERK1/2活性的影響

肖穎1，劉永亮2

(1. 唐山市工人醫(yī)院放化療科；2. 唐山市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山063000)

目的觀察葡萄籽原花青素(GSPE)對(duì)放射性腦損傷大鼠學(xué)習(xí)能力和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)活性的影響。方法120只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組，U0126組，低、高劑量GSPE組。用直線加速器進(jìn)行腦部照射22Gy制作放射性腦損傷模型。HE染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化；免疫組織化學(xué)法及免疫印跡法檢測(cè)磷酸化的ERK1/2表達(dá)；穿梭箱評(píng)測(cè)大鼠學(xué)習(xí)能力。結(jié)果與模型組比較，U0126組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷加重，磷酸化ERK1/2表達(dá)水平降低(P<0.01)，穿梭箱評(píng)測(cè)顯示GSPE組動(dòng)物主動(dòng)回避反應(yīng)率降低，被動(dòng)回避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.01)；GSPE組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷減輕，磷酸化ERK1/2表達(dá)水平增高(P<0.01)，穿梭箱評(píng)測(cè)顯示GSPE組動(dòng)物主動(dòng)回避反應(yīng)率明顯升高，被動(dòng)回避潛伏期縮短(P<0.01)；上述變化在高劑量GSPE組最為顯著(P<0.01)。結(jié)論GSPE可以改善放射性腦損傷大鼠學(xué)習(xí)能力障礙，增強(qiáng)ERK1/2活性。

放射性腦損傷；學(xué)習(xí)能力；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2；葡萄糖原花青素

放射性腦損傷(radiationinjuriesbrain,RIB)是顱面頸區(qū)腫瘤放射治療后的常見并發(fā)癥，臨床報(bào)道接受全腦照射的存活患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的概率高達(dá)50%～90%，且認(rèn)知障礙的程度往往與照射的劑量有關(guān)[1]。如何防治電離輻射造成的認(rèn)知功能障礙已成為放射醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellularsignalregulatedkinase,ERK1/2)是有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)家族的重要組成部分，活化后經(jīng)多級(jí)激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)把細(xì)胞外刺激信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞，從而介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生各種生物學(xué)反應(yīng)；現(xiàn)已證實(shí)ERK1/2活性變化與腦損傷后認(rèn)知障礙及癡呆的形成密切相關(guān)[2-3]。葡萄籽原花青素(grapeseedproanthocyanidinextract,GSPE)是從葡萄籽中提取出的生物類黃酮物質(zhì)，具有極強(qiáng)的抗氧化和清除自由基作用[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道，GSPE不僅可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移[4]，而且可減輕輻照引起的臟器損傷[5]。目前有關(guān)GSPE對(duì)RIB的研究尚少。本研究建立RIB模型，觀察磷酸化的ERK1/2(活化的ERK1/2)表達(dá)變化，初步探討GSPE防治RIB認(rèn)知障礙的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物分組和模型制備120只清潔級(jí)、健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(245±15)g，月齡(2.8±0.3)月；采用隨機(jī)數(shù)字法分組原則，分成對(duì)照組(n=24)、模型組(n=24)、U0126組(n=24)、高劑量GSPE干預(yù)組(n=24)、低劑量GSPE干預(yù)組(n=24)。各組分別分為照射后7、14、28d三個(gè)亞組，各時(shí)間組8只動(dòng)物。

對(duì)照組：動(dòng)物只進(jìn)行常規(guī)麻醉，不進(jìn)行照射；模型組：動(dòng)物常規(guī)麻醉，參考文獻(xiàn)[6]制作RIB模型，方法：采用德國(guó)進(jìn)口加速器產(chǎn)生的6MeV電子線對(duì)大鼠進(jìn)行單次全腦照射，源皮距為100cm，吸收劑量率250Mu/min，吸收劑量為22Gy；干預(yù)組：在動(dòng)物進(jìn)行照射前2周開始每天灌胃給藥1次，持續(xù)給藥觀察時(shí)點(diǎn)，劑量分別為：高GSPE組200mg/kg、低GSPE組100mg/kg。

1.2學(xué)習(xí)能力的評(píng)測(cè)采用ZH-CSC型穿梭實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)(ShuttleBoxSystem)測(cè)定動(dòng)物行為學(xué)能力。將各組大鼠按時(shí)間點(diǎn)分別放入穿梭箱，適應(yīng)5min消除探究反射后給予鈴聲刺激5s，繼之給予電擊20s，間隔10s后進(jìn)入下一輪訓(xùn)練。訓(xùn)練中，如果在鈴聲刺激5s內(nèi)大鼠逃向安全區(qū)，則為主動(dòng)回避反應(yīng)，系統(tǒng)自動(dòng)停止當(dāng)次訓(xùn)練；如果在鈴聲刺激5s內(nèi)大鼠未逃向安全區(qū)，則給予1.5mA交流電20s，如果在電擊后逃向安全區(qū)，則為被動(dòng)回避反應(yīng)陽(yáng)性，否則為主動(dòng)、被動(dòng)回避反應(yīng)陰性。每只大鼠電擊30次，記錄被動(dòng)回避潛伏期(passiveavoidancelatency,PAL)、主動(dòng)回避反應(yīng)次數(shù)等參數(shù)。主動(dòng)回避反應(yīng)次數(shù)占總訓(xùn)練次數(shù)的百分比即為主動(dòng)回避反應(yīng)率(activeavoidancereactionrate,AARR)；AARR越高，PAL越短，表明動(dòng)物學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。

1.3腦組織海馬區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察各組各時(shí)間點(diǎn)取4只大鼠，40g/L多聚甲醛灌注固定后，取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織。石蠟包埋、冠狀切片，片厚5μm，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4免疫組織化學(xué)法和免疫印跡法檢測(cè)磷酸化ERK1/2表達(dá)免疫組織化學(xué)法：取材動(dòng)物及標(biāo)本采集與HE染色方法相同，切片常規(guī)脫蠟至去離子水，滴加復(fù)合消化液后入37 ℃溫箱孵育20min，經(jīng)PBS洗滌3次，每次5min，入30g/L過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15min，經(jīng)PBS洗滌后滴加兔抗鼠磷酸化ERK1/2多克隆抗體(1∶200)，4 ℃過(guò)夜；37 ℃復(fù)溫45min，PBS洗滌后滴加生物素化二抗，37 ℃ 40min，PBS洗滌；DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。在有測(cè)微尺的光學(xué)顯微鏡(20×10)下計(jì)數(shù)該視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞核中有陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物，染色呈棕黃色)。具體方法：每個(gè)標(biāo)本取4張切片，在海馬區(qū)隨機(jī)選取4個(gè)視野，在有測(cè)微尺的光學(xué)顯微鏡(20×10)下觀察海馬區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞變化并計(jì)數(shù)(20×10)倍視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

免疫印跡法：40μg蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混合，煮沸10min后進(jìn)行100g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜；加封閉液，室溫下震蕩2～3h后，加入磷酸化ERK1/2單克隆抗體(北京中山生物公司，1∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST洗膜，標(biāo)記的二抗，經(jīng)37 ℃孵育1h后，再次TBST洗膜；ECL顯色，用圖像分析儀測(cè)定吸光度，作定量分析。

2　結(jié)　　果

2.1各組穿梭實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物的AARR減少、PAL延長(zhǎng)(P=0.000)，且至照射后28d時(shí)，AARR和PAL恢復(fù)跡象不明顯；與模型組相比，U0126組AARR減少、PAL延長(zhǎng)(P=0.000)，而GSPE組動(dòng)物的AARR增多、PAL縮短(P=0.000)，且28d時(shí)AARR和PAL恢復(fù)跡象明顯(表1、表2)，上述變化在高劑量GSPE組最為顯著。

表1各組大鼠AARR的比較

組別7d14d28d對(duì)照組76.84±4.7877.36±5.3477.68±5.53模型組45.63±0.90*32.71±0.65*34.50±0.78*U0126組34.82±1.20△24.55±1.86△28.48±1.60△低劑量GSPE組56.23±2.56*△44.66±2.79*△50.40±2.16*△高劑量GSPE組64.71±5.65*△▲50.51±5.86*△▲69.98±6.26*△▲

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量GSPE組比較，▲P<0.05。

表2各組大鼠PAL的比較

組別7d14d28d對(duì)照組17.68±1.7917.56±2.5517.53±3.64模型組40.11±1.57*51.13±1.89*49.08±1.78*U0126組48.44±1.96△61.20±2.08△55.70±1.92△低劑量GSPE組34.11±1.57*△45.52±1.88*△39.52±1.79*△高劑量GSPE組28.33±0.87*△▲36.53±2.70*△▲27.51±1.57*△▲

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量GSPE組比較，▲P<0.05。

2.2各組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元胞體較大，胞核大而圓，核仁清晰。模型組可見神經(jīng)細(xì)胞變性水腫，細(xì)胞輪廓模糊；亦可見部分死亡神經(jīng)細(xì)胞，表現(xiàn)胞體收縮呈多角形或不規(guī)則。U0126組神經(jīng)細(xì)胞變性水腫，細(xì)胞輪廓模糊；可見較多死亡神經(jīng)細(xì)胞，形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷更為嚴(yán)重。GSPE組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)減輕，在高劑量組變化尤為明顯(圖1)。

2.3各組磷酸化ERK1/2免疫組化和免疫印跡結(jié)果免疫組化：磷酸化ERK1/2陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞的胞核可見細(xì)小的棕黃色顆粒(圖2)。對(duì)照組有少量磷酸化ERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞，染色棕黃；與對(duì)照組比較，模型組7、14d時(shí)間點(diǎn)磷酸化ERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞均增多，28d有所降低，但仍高于對(duì)照組(P=0.000)；與模型組比較，U0126組中各時(shí)間點(diǎn)磷酸化ERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞減少，而GSPE組中各時(shí)間點(diǎn)磷酸化ERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞增多，高表達(dá)狀態(tài)持續(xù)至28d，在高劑量組變化尤為明顯(P=0.000，表3)。

圖1各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

Fig.1Variationofthehippocampusneuronalmorphologyandstructureindifferentgroupsofratsunderlightmicroscope(×400)

A：對(duì)照組；B：模型組14d；C：U0126組；D：低劑量GSPE組14d；E：高劑量GSPE組14d。

圖2各組大鼠海馬區(qū)磷酸化ERK1/2免疫組化染色結(jié)果

Fig.2ImmunohistochemicalstainingresultsofthehippocampusphosphorylatedERK1/2indifferentgroupsofrats

A：對(duì)照組；B：模型組14d；C：U0126組；D：低劑量GSPE組；E：高劑量GSPE組。

組別7d14d28d對(duì)照組2.25±0.702.32±0.682.40±0.75模型組11.12±1.18*20.20±2.50*12.86±1.26*U0126組8.34±0.67△13.74±1.15△9.22±0.96△低劑量GSPE組13.20±1.45△27.40±2.52△19.80±1.30△高劑量GSPE組16.10±1.18△▲34.16±2.94△▲24.36±2.26△▲

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量GSPE組比較，▲P<0.05。

免疫印跡：以β-actin校準(zhǔn)后的蛋白條帶IA值反映其蛋白水平(圖3)。與對(duì)照組比較，模型組7、14d時(shí)間點(diǎn)磷酸化ERK1/2表達(dá)水平增高，28d有所降低，但仍高于對(duì)照組(P=0.000)；與模型組比較，U0126組各時(shí)間點(diǎn)磷酸化ERK1/2表達(dá)水平降低，而GSPE組中各時(shí)間點(diǎn)磷酸化ERK1/2表達(dá)水平進(jìn)一步增高，高表達(dá)狀態(tài)持續(xù)至28d，在高劑量組變化尤為明顯(P=0.000，表4)。

圖3各組大鼠海馬區(qū)磷酸化ERK1/2蛋白免疫印跡結(jié)果

Fig.3WesternblotofthehippocampusphosphorylatedERK1/2indifferentgroupsofrats

A：對(duì)照組；B：模型組 14d；C：U0126 組；D：低劑量GSPE組；E：高劑量GSPE組。

表4各組大鼠海馬區(qū)磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)水平的比較

Tab.4ComparisonoftheexpressionofphosphorylatedERK1/2proteininthehippocampusindifferentgroupsofrats

組別7d14d28d對(duì)照組0.148±0.0100.124±0.090.126±0.07模型組0.396±0.110*0.648±0.136*0.446±0.118*U0126組0.288±0.102△0.432±0.114△0.310±0.112△低劑量GSPE組0.536±0.152△0.810±0.180△0.788±0.175△高劑量GSPE組0.860±0.174△▲1.064±0.162△▲0.948±0.140△▲

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量GSPE組比較，▲P<0.05。

3　討　　論

本研究的結(jié)果顯示，GSPE組動(dòng)物不僅學(xué)習(xí)損傷程度輕，同時(shí)學(xué)習(xí)能力在早期即有恢復(fù)的趨勢(shì)，表現(xiàn)在高劑量GSPE組動(dòng)物在28d時(shí)主動(dòng)回避反應(yīng)率和被動(dòng)回避潛伏期變化相對(duì)穩(wěn)定，未出現(xiàn)模型組中持續(xù)下降的趨勢(shì)，說(shuō)明GSPE對(duì)RIB學(xué)習(xí)障礙有較好的防治作用。電離輻射可以造成腦內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元損傷、神經(jīng)遞質(zhì)釋放紊亂等，進(jìn)而造成認(rèn)知能力損傷[7-8]。GSPE具有較強(qiáng)抗氧化作用，其抗氧化能力是VitE的50倍、VitC的20倍，與SOD相當(dāng)；此外，GSPE具有抑制炎癥通路激活和炎癥反應(yīng)的作用[9-10]。因此，應(yīng)用GSPE可以降低RIB造成的認(rèn)知障礙。

ERK1/2信號(hào)是MAPKs家族中研究最為深入的成員。研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2激活可通過(guò)基因表達(dá)、蛋白合成等影響神經(jīng)細(xì)胞增殖分化、突觸可塑性、軸突生長(zhǎng)等，從而參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展[11]。長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)是與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。CRISTOG等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)非依賴型LTP增強(qiáng)，需ERK1/2的活化，ERK1/2基因敲除的小鼠海馬區(qū)LTP消弱或不能形成，動(dòng)物表現(xiàn)出學(xué)習(xí)能力下降。ZHONG等[13]報(bào)道，當(dāng)條件性敲除ERK1/2通路基因，不能誘導(dǎo)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)；亦有研究顯示，ERK1/2激活可通過(guò)提高神經(jīng)細(xì)胞突觸傳遞效能、提高興奮性遞質(zhì)受體，進(jìn)而誘導(dǎo)與維持LTP的形成[14]。國(guó)內(nèi)學(xué)者梁慶[15]也證實(shí)對(duì)腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用與提高腦內(nèi)ERK1/2活化水平有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)U0126組較模型組動(dòng)物的AARR減少、PAL延長(zhǎng)，說(shuō)明ERK1/2信號(hào)活性變化是RIB學(xué)習(xí)記憶障礙的關(guān)鍵。

鑒于ERK1/2信號(hào)與學(xué)習(xí)能力關(guān)系的密切性，我們觀察了GSPE對(duì)RIB大鼠海馬區(qū)ERK1/2活性變化的影響，結(jié)果顯示GSPE組中磷酸化ERK1/2在GSPE組呈劑量依賴式顯著增高，且高表達(dá)時(shí)間延長(zhǎng)，說(shuō)明GSPE可提高海馬區(qū)ERK1/2活性，可能是GSPE對(duì)放射性學(xué)習(xí)記憶損傷起到很好的防治作用的原因之一。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GSPE增強(qiáng)RIB大鼠腦內(nèi)ERK1/2活性，減輕RIB大鼠學(xué)習(xí)能力障礙。本研究為GSPE抗腫瘤及抗輻射的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

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(編輯韓維棟)

EffectsofgrapeseedproanthocyanidinonlearningabilityandERK1/2activityinaratmodelofradiation-injuredbrain

XIAOYing1,LIUYong-liang2

(1.DepartmentofRadiotherapyandChemotherapy,TangshanWorkers’Hospital,Tangshan063000;2.DepartmentofNeurosurgery,TangshanPeople’sHospital,Tangshan063000,China)

ObjectiveToobservetheeffectsofgrapeseedproanthocyanidinextract(GSPE)onlearningabilityandextracellularsignalregulatedkinase(ERK1/2)activityafterradiation-inducedinjurytothebraininrats.MethodsTotally120maleWistarratsweredividedintocontrolgroup,modelgroup,U0126group,andhigh-andlow-doseGSPEgroups.Theradiation-injuredbrainmodelswereestablishedbyusinglinearacceleratorirradiationin22Gy.ThemorphologicalchangesoftheneuronsinthehippocampuswereobservedwithHEstaining.TheexpressionofphosphorylatedERK1/2wasdetectedbyimmunohistochemistryandWesternblotting.Thelearningabilitywasassessedwithshuttlebox.ResultsComparedwiththemodelgroup,U0126grouphadincreaseddegreeofnervecellmorphologicalinjuryanddecreasedphosphorylatedERK1/2expressionlevel(P<0.01).ShuttleboxtestingshowedthattheactiveavoidancereactionratewasdecreasedandpassiveavoidancelatencywasprolongedinGSPEgroups(P<0.01);theGSPEgroupshaddecreaseddegreeofnervecellmorphologicalinjuryandincreasedphosphorylatedERK1/2expressionlevel(P<0.01).ShuttleboxtestingshowedthattheactiveavoidancereactionratewasincreasedandpassiveavoidancelatencywasshortenedinGSPEgroups(P<0.01).Theabove-mentionedchangesweremoresignificantinhigh-doseGSPEgroup(P<0.01).ConclusionGSPEcanreducelearningdisabilityofradiation-injuredbrainandpromotetheERK1/2activity.

braininjuryfromradiation;learning;extracellularsignalregulatedkinase

2015-08-07

2015-11-07

河北省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(No.20130384)

肖穎.E-mail:szg123@163.com

R742

A

10.7652/jdyxb201605025

SupportedbytheHealthDepartmentofHebeiProvince(No.20130384)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160805.0946.002.html(2016-08-05)