陸　曉，馮笑山，高社干，周福有，王能超，楊海軍

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STAT3、Nanog基因在食管癌組織中的表達(dá)及臨床病理特征相關(guān)性

陸曉1，馮笑山1，高社干1，周福有2，王能超2，楊海軍2

目的探索STAT3、Nanog基因在食管癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性，為食管癌基因治療尋找新的靶點(diǎn)。方法選取2014年河南科技大學(xué)第四附屬醫(yī)院安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院食管癌50例為研究對(duì)象。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)食管癌癌組織與癌旁組織中STAT3、Nanog mRNA的表達(dá)；同時(shí)聯(lián)合運(yùn)用Western blot 技術(shù)與免疫組化技術(shù)檢測(cè)STAT3、Nanog蛋白在食管癌及癌旁組織的定位與表達(dá)。結(jié)果食管癌組織中STAT3、Nanog的mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.05)；STAT3和Nanog在低分化食管癌組織中的表達(dá)明顯高于其他分化程度(P<0.05)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織中STAT3、Nanog的陽(yáng)性表達(dá)率低于伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(P<0.05)，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管癌組織中的STAT3、Nanog陽(yáng)性率明顯低于伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管癌組織(P<0.05)。食管癌組織中STAT3和Nanog的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.303，P<0.05)。結(jié)論STAT3、Nanog基因可能在食管癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮重要作用，其可能成為食管癌基因診斷和治療的新靶點(diǎn)。

食管癌；STAT3；Nanog；RT-PCR；Western blot；免疫組化

食管癌是嚴(yán)重威脅人類生命的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其致死率為世界第6位[1]。尋找和確定食管癌發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用的基因、蛋白等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有助于對(duì)食管癌的發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，并將其應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防、早期診斷與治療。研究發(fā)現(xiàn)Nanog基因在囊胚內(nèi)細(xì)胞群、原始生殖細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESCs)中高表達(dá)，維持細(xì)胞多能性和自我更新，致使其獲得增殖及永生能力的分子基礎(chǔ)[2-3]。而STAT3是JAK-STAT信號(hào)通路家族的重要成員，它既是核轉(zhuǎn)錄因子，也是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，其參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、免疫反應(yīng)、惡性轉(zhuǎn)化、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和免疫逃避等[4]。有報(bào)道稱Nanog可能是STAT3途徑的一個(gè)直接靶基因，它們可能具有協(xié)同或交互作用[5-6]。本文現(xiàn)采用免疫組化SP法(streptavidin peroxidase conjugated method,SP)、Western blot和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)食管癌及癌旁組織中STAT3和Nanog的表達(dá)，探討二者在食管癌發(fā)生、進(jìn)展中的作用及其與食管癌臨床病理之間的相互關(guān)系。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源選取2014年河南科技大學(xué)第四附屬醫(yī)院安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院食管癌切除標(biāo)本50例，年齡(61.50±15.30)歲。高分化鱗癌14例，中分化鱗癌17例，低分化鱗癌19例。根據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)判斷，腫瘤浸潤(rùn)深度：T1 16例、T2 12例、T3 14 例、T4 8例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例；伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移24例。癌旁組織為食管癌手術(shù)切除標(biāo)本中距癌組織邊緣3～5 cm的食管組織。選取同時(shí)期10例STAT3和Nanog陽(yáng)性表達(dá)的睪丸精原細(xì)胞瘤作免疫組化的陽(yáng)性對(duì)照。

1.2免疫組織化學(xué)分析

1.2.1主要試劑兔抗人Nanog多克隆抗體(濃度1∶1 000)、兔抗人STAT3單克隆抗體(1∶1 000)均購(gòu)自武漢三鷹公司；SP試劑盒和DAB 酶底物顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2.2方法免疫組化染色采用SP法嚴(yán)格按試劑說(shuō)明操作。

1.2.3結(jié)果判斷Nanog和STAT3表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和(或)胞膜，按染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比計(jì)分。染色強(qiáng)度：細(xì)胞未染色為0 分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～7分為陰性，≥8分為陽(yáng)性。兩位高年資病理醫(yī)師雙盲讀片。

1.3Western blotting實(shí)驗(yàn)

1.3.1主要試劑兔抗人Nanog多克隆抗體(濃度1∶1 000)、兔抗人STAT3單克隆抗體(1∶1 000)均購(gòu)自武漢三鷹公司，預(yù)染Marker。凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽、電泳儀均購(gòu)自BIO-RAD公司(美國(guó))。

1.3.2方法

1.3.2.1SDS-PAGE電泳①配制12%分離膠和5%的濃縮膠，制備SDS-PAGE緩沖液；②將備用變性的組織蛋白上樣；③電泳：濃縮膠80 V，30 min；分離膠120 V，90 min?？倳r(shí)間約為120 min。

1.3.2.2轉(zhuǎn)膜按從陽(yáng)極到陰極的順序依次放置：海綿、3 M濾紙、PVDF膜、凝膠、3 M濾紙、海綿；加入轉(zhuǎn)膜液，低溫、恒壓90 V，l.5 h；用含5%脫脂牛奶的封閉緩沖液室溫下封閉1 h。

1.3.2.3免疫反應(yīng)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作。

1.3.2.4化學(xué)顯影和定影①在暗室中，將ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒中試劑A和試劑B在保鮮膜上等體積混合，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸l min，然后將PVDF膜移至另一保鮮膜上，移去殘液，包好。②放入凝膠成像系統(tǒng)機(jī)中曝光，以tublin作為內(nèi)參照，進(jìn)行凝膠圖像分析，應(yīng)用灰度分析軟件(ImageJ軟件)對(duì)Nanog和STAT3條帶進(jìn)行灰度值的比值對(duì)比分析。

1.4RT-PCR

1.4.1主要試劑Nanog引物、STAT3引物、GAPDH引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自生工生物工程技術(shù)有限公司(上海)。PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自百泰克生物技術(shù)有限公司(北京)。

1.4.2方法Trizol法提食管組織總RNA，取<1 pg的RNA用M-M LV酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以所得cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。通過(guò)primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。Nanog的上游引物：5’-AATAACCTTGGCTGCCGTCTC-3’，下游引物：5’-AGCCTCCCAATCCCAAACAAT-3’。STAT3上游引物：5’-ACACCGTAAGTGGCTTCCTT-3’，下游引物：5’-CTCTCACCCAGTGTCCCATTC-3’。GAPDH的上游引物：5’-GCCACATCGCTCAGACACC-3’，下游引物：5’-GATGGCAACAATATCCACTTTACC-3’。建立20 μL PCR 反應(yīng)體系：2xSuperReal PreMix Plusc DNA10 μL、cDNA 2 μL、Nanog(或STAT3)正反引物各0.5 μL(或GAPDH正反引物0.5 μL)，95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸32 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。用GAPDH mRNA為內(nèi)參進(jìn)行對(duì)照校正，各樣本的Nanog(或STAT3)基因擴(kuò)增量與GAPDH基因擴(kuò)增量采用Y=2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA水平Nanog和STAT3的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1食管癌中Nanog和STAT3的表達(dá)食管癌癌組織及癌旁組織中 Nanog和STAT3在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，見(jiàn)圖1。Nanog、STAT3在食管癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。因睪丸精原細(xì)胞瘤生物學(xué)特性與干細(xì)胞特性類似，將睪丸精原細(xì)胞瘤中的基因表達(dá)免疫組化結(jié)果作為陽(yáng)性對(duì)照。

A.食管癌組織中Nanog的表達(dá)　B.癌旁組織中Nanog的表達(dá)　C.精原細(xì)胞瘤中Nanog的表達(dá)　D.食管癌組織中STAT3的表達(dá)　E.癌旁組織中STAT3的表達(dá)　F.精原細(xì)胞瘤中STAT3的表達(dá)圖1　Nanog、STAT3的表達(dá)

2.2Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果凝膠成像以48 kDa的tublin為內(nèi)參，應(yīng)用灰度分析軟件(ImageJ軟件)對(duì)目的蛋白條帶的灰度值的比值進(jìn)行分析。結(jié)果顯示目的蛋白Nanog、STAT3在食管癌組織中高表達(dá)，癌旁組織中低表達(dá)，與免疫組化結(jié)果相一致，見(jiàn)圖2。

T.癌組織　N.癌旁組織圖2　Nanog、STAT3蛋白表達(dá)凝膠成像對(duì)比

2.3RT-PCR結(jié)果癌組織中的Nanog和STAT3擴(kuò)增量大于癌旁組織中的擴(kuò)增量，說(shuō)明Nanog與STAT3在食管癌癌組織中比其癌旁組織中的表達(dá)量高，見(jiàn)圖3。

A.Nanog mRNA擴(kuò)增　B.STAT3 mRNA擴(kuò)增圖3　Nanog、STAT3組織中的mRNA擴(kuò)增情況

2.4Nanog與STAT3與食管癌臨床病理特征Nanog與STAT3在低分化食管癌組中的表達(dá)明顯高于高+中分化癌組(P<0.05)；無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管癌組織中二者陽(yáng)性率明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管癌組織(P<0.05)，見(jiàn)表2。食管癌組織中Nanog和STAT3的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.303，P<0.05)。

表2　Nanog和STAT3與食管癌臨床特征　例(%)

3　討論

Nanog為ESCs中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，是ESCs自我更新和多潛能性的重要調(diào)控因子[7]，在胚胎外胚層維持多能性方面發(fā)揮的作用較為關(guān)鍵[8]。ESCs的多潛能性的維持可能與Nanog調(diào)控分化一些相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如STAT3的活性有關(guān)[9]。到目前為止，研究者對(duì)Nanog、STAT3在胚胎癌細(xì)胞和生殖細(xì)胞腫瘤中的作用所做的科研工作較多[10]，發(fā)現(xiàn)兩者在睪丸癌、胚胎性腫瘤和精原細(xì)胞瘤組織中表達(dá)量較高[11]。而且除了生殖類腫瘤外，Nanog、STAT3在體細(xì)胞實(shí)體腫瘤方面發(fā)揮的作用也逐漸受到關(guān)注，在乳腺癌、腦部腫瘤、骨肉瘤和膀胱癌腫瘤組織中存在與干細(xì)胞特性類似的細(xì)胞團(tuán)，在這些細(xì)胞團(tuán)中也發(fā)現(xiàn)Nanog、STAT3表達(dá)量較高[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在食管癌組織中Nanog、STAT3的表達(dá)量高于癌旁組織，這一結(jié)果表明食管癌組織中可能含有高表達(dá)Nanog、STAT3的腫瘤干細(xì)胞，在食管癌的發(fā)生階段發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示低分化癌組織中Nanog、STAT3的陽(yáng)性率明顯高于中高分化的癌組織中，表明食管癌的發(fā)展、分化過(guò)程中有Nanog、STAT3的參與，與 Siu報(bào)道結(jié)果相似[13]。而Nanog、STAT3可能位于干細(xì)胞維持全能性及自我更新調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的頂端，協(xié)同作用來(lái)調(diào)控與干細(xì)胞自我更新及分化方面有關(guān)的基因[14]。干細(xì)胞的分化狀態(tài)與Nanog、STAT3的表達(dá)水平密切相關(guān)[15]，在維持干細(xì)胞的低分化狀態(tài)、維持自我更新潛能及保持全能性方面與Nanog、STAT3的作用也是分不開(kāi)的。而本研究中食管癌組織中Nanog和STAT3的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且在低分化食管癌組織中的表達(dá)明顯高于高、中分化程度的食管癌。Nanog和STAT3的表達(dá)與臨床病理特征的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與否有關(guān)。并且，食管癌癌組織中Nanog和STAT3的表達(dá)呈相關(guān)性，研究結(jié)果表明食管癌發(fā)生與可能與腫瘤干細(xì)胞 Nanog和STAT3的表達(dá)呈相關(guān)，有望同前列腺癌中STAT3的作用一樣作為食管癌診斷的分子標(biāo)志。

總之，本研究結(jié)果提示STAT3、Nanog基因可能在食管癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮重要作用，可能成為食管癌基因診斷和治療的新靶點(diǎn)。

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Expression of STAT3 and Nanog Gene in Esophageal Cancer and Its Correlation with the Clinicopathological Characteristics

LU Xiao1,FENG Xiao-shan1,GAO She-gan1,ZHOU Fu-you2,WANG Neng-chao2,YANG Hai-jun2

(1.First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Anyang Tumor Hospital,Anyang 455000,China)

ObjectiveTo explore STAT3 and Nanog gene expression in esophageal cancer tissues and its correlation with the clinicopathological characteristic in order to look for new targets of gene therapy for esophageal cancer.MethodsThere were 50 cases of esophageal cancer which was selected from the Fourth Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology in 2014 as the research object.The expression of STAT3 and Nanog mRNA was detected by RT-PCR in esophageal carcinoma and paracancerous tissues.Meanwhile the expression and localization of STAT3 and Nanog protein were detected by Western blot technique and immunohistochemical technique in same tissues.ResultsThe mRNA and protein expression of STAT3 and Nanog in esophageal cancer tissues was significantly higher than that in paracancerous tissue(P<0.05).The expression of STAT3 and Nanog in poorly differentiated esophageal cancer tissues was observably higher than that in other differentiated cancer tissues(P<0.05).Among esophageal cancer tissues，without lymph node metastasis cancer tissues were accompanied with significantly lower positive expression rates than the tissues with lymph node metastasis(P<0.05).The esophageal cancer tissues without distant metastasis have less expression of STAT3 and Nanog than the tissues with distant metastasis(P<0.05).The expression of STAT3 and Nanog in Esophageal cancer tissues showed positive correlation(r=0.303,P<0.05).ConclusionSTAT3 and Nanog gene may play an important role in carcinogenesis and development of esophageal cancer,and it might be the new target genes for diagnosis and treatment of esophageal cancer.

esophagus cancer；STAT3；Nanog；RT-PCR；Western blot； immunohistochemisty

1672-688X(2016)03-0170-04DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.03.003

2016-01-26

1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽(yáng) 471003

2.安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院，河南安陽(yáng) 455000

陸曉(1986-)，男，山東肥城人，醫(yī)師，從事腫瘤科臨床工作。

馮笑山，男，博士，教授，E-mail：samfeng137@hotmail.com

R735.1

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