王秉鈞，王先坤，晏波，李紹平

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院急救中心，甘肅 蘭州，730030

β-欖香烯對(duì)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞凋亡的影響

王秉鈞，王先坤，晏波，李紹平

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院急救中心，甘肅 蘭州，730030

目的觀察β-欖香烯對(duì)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。方法β-欖香烯濃度設(shè)置為10、20、40、80、160 μg/mL，作用于體外培養(yǎng)的Panc-1細(xì)胞24、48、72 h。臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)Panc-1細(xì)胞抑制率；TUNEL法檢測(cè)Panc-1細(xì)胞凋亡；Hoechst33258熒光染色觀察Panc-1細(xì)胞核變化；ELISA檢測(cè)Panc-1細(xì)胞Caspase-3、8、9活性；Western blot檢測(cè)Panc-1細(xì)胞Fas、FasL、細(xì)胞色素C（Cyt c）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）蛋白表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，β-欖香烯作用Panc-1細(xì)胞24、48、72 h，Panc-1細(xì)胞抑制率明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01，P＜0.001），并呈時(shí)間/濃度依賴(lài)性；β-欖香烯作用Panc-1細(xì)胞72 h，Panc-1細(xì)胞核可見(jiàn)明顯碎裂，染色質(zhì)濃縮，呈強(qiáng)藍(lán)色熒光，形成凋亡小體；β-欖香烯作用Panc-1細(xì)胞48 h，Caspase-3、8、9活性明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)as、FasL、Cyt c及AIF蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。結(jié)論β-欖香烯能夠抑制 Panc-1細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其可能激活細(xì)胞內(nèi)死亡受體途徑及線粒體凋亡途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。

β-欖香烯；胰腺癌；Panc-1細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

雖然胰腺癌發(fā)病率僅占所有癌癥的 2.8%，但其侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差、死亡率高［1］。欖香烯是從姜科植物溫郁金中提取的有效成分。β-欖香烯注射液是由我國(guó)自行研發(fā)的抗腫瘤藥物，其抗腫瘤作用主要機(jī)制包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期及放化療增敏作用、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥、抗腫瘤轉(zhuǎn)移、提高機(jī)體免疫力等［2］。由于β-欖香烯具有抗腫瘤譜廣、作用高效、毒副作用小等特點(diǎn)［3］，臨床上已用于膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、大腸癌等惡性腫瘤的治療。本實(shí)驗(yàn)以胰腺癌Panc-1細(xì)胞株為模型，觀察 β-欖香烯對(duì)Panc-1細(xì)胞凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞

人胰腺癌Panc-1細(xì)胞株，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2藥物

β-欖香烯注射液，大連遠(yuǎn)大制藥有限公司，批號(hào)140623-2。

1.3試劑

10%胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）及臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)試劑盒，碧云天生物研究所；Caspase-活性檢測(cè)試劑盒，Hoechst33258染色液，武漢博士德生物制品有限公司；抗Fas、FasL、細(xì)胞色素C（Cyt c）及凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）鼠抗抗體，美國(guó) Santa Cruz公司。

1.4儀器

IX51熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），Spectra Mr型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)DYNEX公司），Z-323高速低溫離心機(jī)（德國(guó)HERMLE公司），EPICS XL流式細(xì)胞儀（美國(guó)COULTER公司）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

Panc-1細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2孵育箱中孵育，常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞。以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)Panc-1細(xì)胞抑制率

實(shí)驗(yàn)分為藥物組和對(duì)照組。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，棄去舊培養(yǎng)液，37 ℃預(yù)熱的PBS洗3次，0.25%胰酶消化，以新鮮培養(yǎng)液制細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度5×104/孔，接種于96孔培養(yǎng)板，5%CO2、37 ℃細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng) 24 h。棄去培養(yǎng)液，藥物組給予含 β-欖香烯的新鮮培養(yǎng)液，藥物終濃度為10、20、40、80、160 μg/mL。對(duì)照組予等體積新鮮培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別置孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。收集細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色5 min，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞抑制率［（1-藥物組OD值÷對(duì)照組OD值）× 100%］。β-欖香烯濃度設(shè)置參考文獻(xiàn)［4］。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.3TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

實(shí)驗(yàn)分組、細(xì)胞接種及給藥方法同“2.2”項(xiàng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Panc-1細(xì)胞接種于12孔板中，5%CO2、37 ℃孵育24 h，藥物組β-欖香烯終濃度為10、20、 40、80、160 μg/m，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，0.25%胰酶消化，得細(xì)胞懸液，1500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，4%多聚甲醛固定1 h，用含0.1%Triton X-100 PBS重懸細(xì)胞，冰浴孵育5 min。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.4Hoechst33258熒光染色法觀察細(xì)胞核的變化

實(shí)驗(yàn)分組、細(xì)胞接種及給藥方法同“2.2”項(xiàng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Panc-1細(xì)胞接種于6孔板中，5%CO2、37 ℃孵育24 h，藥物組β-欖香烯終濃度為20、40、80 μg/mL的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，分散制成細(xì)胞懸液。按照Hoechst33258熒光染色說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)和熒光的強(qiáng)弱，采集圖像。

2.5ELISA檢測(cè)Caspase-3、8、9酶活性

實(shí)驗(yàn)分組、細(xì)胞接種及給藥方法同“2.2”項(xiàng)。接種于6孔培養(yǎng)板的Panc-1細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h，藥物組β-欖香烯的終濃度為20、40、80 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，4 ℃預(yù)冷PBS沖洗3次，加入適量裂解液冰浴30 min。細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，置預(yù)冷離心管中，4 ℃、20 000 r/min離心15 min，取上清液存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所測(cè)酶活性以Caspase活性增加的百分比表示（藥物組OD值÷對(duì)照組OD值×100%）。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.6Western blot檢測(cè)Fas、FasL、細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分組、細(xì)胞接種及給藥方法同“2.2”項(xiàng)。細(xì)胞加入預(yù)冷的適量細(xì)胞裂解液（100～150 μL/孔，含蛋白酶抑制劑），冰浴裂解30 min，收集細(xì)胞，4 ℃、20 000 r/min離心25 min，取上清液，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0%SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，一抗Fas、FasL、Cyt c 及AIF抗體1∶1000稀釋?zhuān)? ℃過(guò)夜，二抗（1∶1000稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h，ECL法顯色。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4　結(jié)果

4.1β-欖香烯對(duì)Panc-1細(xì)胞增殖的影響

不同濃度β-欖香烯作用Panc-1細(xì)胞24、48、72 h后，與對(duì)照組比較，藥物組Panc-1細(xì)胞抑制率明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），并呈時(shí)間-濃度依賴(lài)性，兩者間無(wú)交互作用（P＞0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　各組Panc-1細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)Panc-1細(xì)胞抑制率比較（±s，%）

表1　各組Panc-1細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)Panc-1細(xì)胞抑制率比較（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　n　濃度/（μg/mL）　24 h　48 h　72 h對(duì)照組　3　0　0　0　0藥物組　3　10　7.31　18.26　29.25*3　20　11.68*　29.65*　38.81*3　40　25.45*　40.57*　48.68**3　80　33.68**　50.32**　61.01**3　160　39.32**　57.61**　69.26**

4.2β-欖香烯對(duì)Panc-1細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度β-欖香烯作用Panc-1細(xì)胞24、48、72 h后，與對(duì)照組比較，藥物組細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.01，P＜0.001），并呈時(shí)間-濃度依賴(lài)，80、160 μg/mL β-欖香烯誘導(dǎo)作用相同時(shí)間細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　各組Panc-1細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

表2　各組Panc-1細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　n 濃度/（μg/mL）　24 h　48 h　72 h對(duì)照組 3　0　5.38±1.36　5.94±0.90　6.79±1.32藥物組 3　10　5.35±0.99　10.26±1.25*18.56±1.29*3　20　8.32±1.01　21.18±2.18**33.40±3.24**3　40　15.66±1.13*　32.41±3.46**40.92±3.01**3　80　31.75±3.12*　40.09±3.75**51.28±3.63**3　160　30.29±4.62*　44.36±5.36**52.39±4.65**

4.3β-欖香烯對(duì)Panc-1細(xì)胞核形態(tài)的影響

經(jīng)Hoechst33258熒光染色后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)完整，呈弱藍(lán)色熒光；給予欖香烯作用Panc-1細(xì)胞72 h后，細(xì)胞核可見(jiàn)明顯碎裂，染色質(zhì)濃縮并致密濃染，呈強(qiáng)藍(lán)色熒光，伴有凋亡小體出現(xiàn)。隨著藥物濃度增大，細(xì)胞凋亡發(fā)生更加明顯。結(jié)果見(jiàn)圖1。

4.4β-欖香烯對(duì)Panc-1細(xì)胞Caspase-3、8、9活性的影響

Caspase-3、8、9均是細(xì)胞凋亡過(guò)程中關(guān)鍵的Caspase，20、40、80 μg/mL β-欖香烯作用Panc-1細(xì)胞48 h后，Caspase-3、8、9活性均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1　各組Panc-1細(xì)胞核病理形態(tài)（Hoechst33258熒光染色，×200）

表3　各組Panc-1細(xì)胞Caspase-3、8、9活性比較（±s）

表3　各組Panc-1細(xì)胞Caspase-3、8、9活性比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

4.5β-欖香烯對(duì)Panc-1細(xì)胞Fas、FasL、細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子蛋白表達(dá)的影響

20、40、80 μg/mL β-欖香烯作用Panc-1細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組比較，Panc-1細(xì)胞Fas、FasL、Cyt c及AIF蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。結(jié)果見(jiàn)圖2、表4。

圖2　各組Fas、FasL、Cyt c及AIF蛋白表達(dá)免疫印跡電泳圖

表4　各組Panc-1細(xì)胞Fas、FasL、Cyt c及AIF蛋白表達(dá)比較（±s）

表4　各組Panc-1細(xì)胞Fas、FasL、Cyt c及AIF蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

對(duì)照組　3　0　0.98±0.11　0.67±0.11　1.13±0.25　0.95±0.08藥物組　3　20　1.75±0.23*　1.64±0.65**　1.98±0.65**　1.29±0.41*3　40　3.44±0.45**　4.93±0.73**　2.45±0.74**　2.67±0.91**3　80　5.86±1.18***　7.54±0.82***　4.65±0.64**　4.36±0.70**組別　n　濃度/（μg/mL）　Fas　FasL　Cyt c　AIF

5　討論

由于β-欖香烯廣譜、高效、低毒等特點(diǎn)，目前臨床上應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療。研究表明，β-欖香烯具有直接抗腫瘤作用，體內(nèi)外均能夠抑制肺癌細(xì)胞DNA、RNA的合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，此作用具有一定的時(shí)間和濃度依賴(lài)性［5］。毛氏等［6］研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯通過(guò)下調(diào)人肝癌 HepG2細(xì)胞內(nèi)微管蛋白，從而抑制細(xì)胞內(nèi)微管的聚合，發(fā)揮增殖抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的β-欖香烯注射液作用Panc-1細(xì)胞24、48、72 h后，均有顯著的增殖抑制作用。

除抗腫瘤作用外，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是β-欖香烯重要的抗腫瘤作用機(jī)制之一。有研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯作用于膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，可將細(xì)胞周期阻滯于G1/S期，此外Fas和FasL的mRNA和蛋白表達(dá)水平上升，表明 β-欖香烯通過(guò)調(diào)節(jié)Fas/FasL信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。通過(guò)TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度β-欖香烯注射液作用24、48、72 h后能顯著誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞凋亡；再通過(guò)Hoechst33258染色，熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞核碎裂濃染，染色質(zhì)濃縮，伴有凋亡小體出現(xiàn)。但是，筆者發(fā)現(xiàn)，80、160 μg/mL β-欖香烯注射液在作用相同時(shí)間時(shí)誘導(dǎo)的凋亡率之間無(wú)明顯差異，可能是β-欖香烯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用與藥物濃度并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。當(dāng)藥物達(dá)到一定濃度時(shí)，腫瘤細(xì)胞其他死亡方式如壞死增多，β-欖香烯誘導(dǎo)的程序性死亡即凋亡減少［2］。

有研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯能促進(jìn)人胃癌SCG-7901細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與調(diào)節(jié)ERK/P38/MAPK信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)［7］；有研究顯示，β-欖香烯可能通過(guò)調(diào)節(jié)Fas/FasL信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡［8-9］。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在2條經(jīng)典的凋亡途徑：死亡受體途徑和線粒體凋亡途徑。Fas是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，在死亡受體途徑中，F(xiàn)as受體與Fas結(jié)合后，F(xiàn)as受體胞漿區(qū)的死亡域發(fā)生多聚化使Fas活化，活化的Fas與Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）連接，F(xiàn)ADD另一端與無(wú)活性的Caspase-8酶原發(fā)生交聯(lián)，從而激活Caspase-8，活化的Caspase-8可以剪切并活化Caspase-3、9及其他 Caspase，進(jìn)而引起隨后的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

Cyt c是第1種被發(fā)現(xiàn)的線粒體釋放促凋亡蛋白。線粒體凋亡途徑中，Cyt c從線粒體釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟，這是線粒體外膜通透性增高的結(jié)果［10］。釋放到細(xì)胞漿的Cyt c與凋亡相關(guān)因子1結(jié)合并將其激活，使其形成多聚體，并促使Caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，Caspase-9被激活，其進(jìn)一步激活下游的 Caspase-3，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，20、40、80 μg/mL β-欖香烯作用Panc-1細(xì)胞48 h后，Caspase-3、8、9活性均顯著增加，F(xiàn)as、FasL、Cyt c、AIF蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，這可能是 β-欖香烯誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。

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Effects of β-Elemene on Apoptosis of Human Pancreatic Cancer Panc-1 Cells

WANG Bing-jun，WANG Xian-kun， YAN Bo， LI Shao-ping
（Emergency Center， The Second Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730030， China）

Objective To investigate the effects of β-Elemene on the apoptosis of human pancreatic cancer Panc-1 cells； To discuss its mechanism of action. Methods β-Elemene （10， 20， 40， 80， 160 μg/mL） were incubated to the Panc-1 cells in vitro cultured for 24 h， 48 h and 72h， and trypan blue refusal method was used to detect cell inhibition rate；Apoptosis rate was measured by TUNEL； Hoechst33258 fluorescent staining was used to observe the changes of the nucleus. The activity of Caspase-3， 8 and 9 were detected by ELISA. Western blot was used to detect the expressions of Fas， FasL and Cyt c and AIF. Results The activity of Panc-1 cells was obviously inhibited time/concentration dependent inhibition （P＜0.05， P＜0.01）， and the apoptosis rate increased after incubated with β-Elemene （P＜0.01，P＜0.001） after incubated with β-Elemene for 24 h， 48 h and 72 h； After giving β-Elemene 72 h， Panc-1 cells nucleus were broken obviously， and chromatin condensed and showed strong blue fluorescence， along with of apoptotic bodies； After incubated with β-Elemene for 48 h， Caspase-3， 8 and 9 activity significantly increased （P＜0.05，P＜0.01）； protein expressions of Fas， FasL， Cyt c and AIF were significantly enhanced （P＜0.05， P＜0.01， P＜0.001）. Conclusion β-Elemene can inhibit Panc-1 cell proliferation， induce apoptosis， and the mechanism may be related to activating cell death receptor pathway and mitochondrial apoptosis pathway to play anti-tumor effects.

β-Elemene； pancreatic cancer； Panc-1 cells； cell apoptosis

R285.5

A

1005-5304（2016）10-0078-04

2015-12-07）

（

2015-12-30；編輯：華強(qiáng)）

甘肅省自然科學(xué)基金（1506RJZA251）；蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012-1-32）

李紹平，E-mail：lzulsp@163.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.018