夏鳳君，申鐵兵

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，內(nèi)蒙古 呼和浩特　010050)

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細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1沉默增強人口腔癌細胞對化療藥物的敏感性

夏鳳君，申鐵兵

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010050)

目的研究細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(SOCS1)基因沉默對人口腔癌細胞化療藥物敏感性的影響及相關(guān)機制。方法Western blotting及實時熒光定量(PCR)驗證SOCS1干擾序列沉默人口腔表皮樣癌細胞(KB細胞)株中SOCS1的表達水平；MTT比色法分析細胞對化療藥物敏感性的變化；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。結(jié)果將SOCS1干擾片段轉(zhuǎn)染KB細胞后，SOCS1 mRNA及蛋白表達水平均明顯降低。沉默SOCS1表達后，化療藥物5-氟尿嘧啶和長春新堿對KB細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)均顯著變小(P<0.05)，SOCS1沉默還可增加長春新堿誘導(dǎo)的細胞凋亡(P<0.05)，SOCS1表達抑制后KB細胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的蛋白表達水平明顯降低，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論SOCS1表達有效抑制后，人口腔癌細胞KB對化療藥物的敏感性增強，且促進化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡。

口腔腫瘤；細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白抑制因子;基因沉默;氟尿嘧啶;長春新堿

研究表明RNA干擾(RNAi)沉默細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(SOCS1)表達可促進神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細胞的凋亡[1]，SOCS1表達下調(diào)還抑制人血管平滑肌細胞增殖并促進其凋亡[2]。miR-155抑制SOCS1表達激活信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子-3(STAT3)信號通路，阻止胰腺癌細胞遠處轉(zhuǎn)移，并減弱其侵襲能力[3]。人舌鱗癌細胞SOCS1沉默，顯著降低化療藥物卡鉑和紫杉醇對癌細胞的半數(shù)抑制濃度，提高其對化療藥物的敏感性[4]。為明確SOCS1對人口腔癌細胞化療藥物敏感性的作用，本研究通過小干擾iRNA(siRNA)抑制人口腔表皮樣癌細胞株(KB細胞)中SOCS1基因表達，以探討SOCS1對KB細胞化療藥物敏感性的影響，并研究其調(diào)控細胞凋亡的相關(guān)機制。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器人口腔癌細胞株KB購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基 (美國，Gibco)，real-time PCR試劑盒、2×Taq PCR MasterMix PCR擴增試劑 (日本，TaKaRa)，5-氟尿嘧啶、長春新堿、SOCS-1抗體 (美國，Sigma)，Lipo2000、BLOCK-iTTMU6 RNAi Entry Vector 試劑盒 (美國，Invitrogen)，α-tubulin抗體 (武漢，博士德)，二抗 (南京，碧云天)，細胞裂解液、甲基噻唑基四唑(MTT)(江蘇，凱基生物)，BCA蛋白濃度檢測試劑盒、預(yù)染蛋白Marker (美國，ThermoFisher Scientific)，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)抗體(美國，CST)，引物合成委托上海生工公司。流式細胞儀 (美國，BD)，梯度PCR儀 (美國，Applied Biosystems 9700)。

1.2載體構(gòu)建與細胞轉(zhuǎn)染SOCS1干擾片段設(shè)計參考文獻[4]。SOCS1-siRNA寡核苷酸片段退火形成雙鏈DNA后，與SilencerTM 2.1/U6neo載體連接，構(gòu)建成pU-SOCS1-siRNA真核表達載體。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pU-SOCS1-siRNA的KB細胞作為實驗組，KB細胞作為對照組。對數(shù)期口腔癌KB細胞于轉(zhuǎn)染前12 h種植細胞培養(yǎng)六孔板，使細胞匯合度在轉(zhuǎn)染時達到40%～50%，Lipo2000轉(zhuǎn)染步驟嚴格按照說明書進行，轉(zhuǎn)染時長為6 h，轉(zhuǎn)染后換含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至各項指標檢測所需的時間。

1.3Real-time PCR分析信使RNA(mRNA)表達情況siRNA轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細胞，六孔板每孔添加適量Trizol和氯仿，移液器吹打，提取總RNA，去基因組后檢測RNA純度，純度合格且無蛋白質(zhì)污染，用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄。GAPDH上游引物：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，下游引物：GAAGATGGTGATGGGATTTC；SOCS1上游引物：ATGCAGTCTCCACAGCAGCAGAG，下游引物：CGAACGGAATGTGCGGAAGTG。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進行定量分析，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃，5 min，變性94 ℃，30 s，SOCS1退火60 ℃，30 s(內(nèi)參GAPDH退火55 ℃，30 s)，延伸72 ℃，1 min，40個循環(huán)，72 ℃，6 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察DNA條帶，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.4MTT分析藥物敏感性各組細胞轉(zhuǎn)染處理后，取對數(shù)期細胞種植96孔培養(yǎng)板，接種密度為貼壁時匯合度達到50 %左右，按照分組添加不同濃度的5-氟尿嘧啶(0、5、10、20、30、40、50 mg·L-1)和長春新堿(0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1)作用48 h，3組細胞各個濃度值均設(shè)置3個重復(fù)，培養(yǎng)結(jié)束時添加(MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，棄MTT溶液，加二甲基亞砜(DMSO)后測OD490 nm，根據(jù)吸光度值繪制細胞生長率曲線圖，半數(shù)抑制濃度 (IC50)計算采用GraphPad Prism軟件。

1.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡各組細胞于轉(zhuǎn)染前8 h添加化療藥物長春新堿，終濃度為0.1 mg·L-1，培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞，加入5 μL 膜聯(lián)蛋白(Annexin Ⅴ)及緩沖液制成約每升1×109個細胞的懸液，避光反應(yīng)30 min，加入10 μL PI流式細胞儀上機檢測。

1.6Western blotting分析蛋白表達情況siRNA轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，冰上加裂解液充分裂解細胞，離心收集上清，使用BCA法測定樣品蛋白濃度，分裝成每小管30 μg，加上樣緩沖液后高溫變性，樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，TBST配制的5%脫脂奶粉常溫封閉1～2 h，TBS+Tween(TBST)洗膜3次后孵育一抗，SOCS1、NF-κB和Caspase-3抗體稀釋比例為1∶1 000，內(nèi)參α-tubulin稀釋比例為1∶2 000，一抗4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次后孵育對應(yīng)的HRP標記的羊抗小鼠或羊抗兔二抗，稀釋比例為1∶5 000，常溫孵育2 h；TBST洗膜后暗室添加適量ECL試劑后壓片、顯影、定影，膠片掃描后蛋白條帶用Image J軟件進行灰度分析，半定量檢測目標蛋白的表達情況。

2　結(jié)果

2.1SOCS1干擾作用驗證實驗組細胞轉(zhuǎn)染后48 h，SOCS1 mRNA水平顯著低于對照組 (P<0.05)，見圖1，實驗組SOCS1蛋白表達也明顯減少，見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05。

圖1 RT-PCR檢測KB細胞中SOCS1的表達(n=3)

圖2　Western blot分析KB細胞中SOCS1基因的蛋白表達情況

2.2SOCS1沉默增強口腔癌細胞對化療藥物的敏感性與對照組比較，SOCS1基因沉默提高KB細胞對化療藥物5-氟尿嘧啶和長春新堿的敏感性，實驗組細胞相同藥物濃度作用后，生存率均顯著降低 (P<0.05)，見圖3。實驗組KB細胞對5-氟尿嘧啶的半數(shù)抑制濃度(IC50)顯著小于對照組 (12.83±1.04vs20.43±1.27，P<0.05)，對長春新堿的IC50也顯著小于對照組 (0.13±0.08vs0.24±0.11，P<0.05)。

注：與對照組相同濃度比較，*P<0.05。

圖3SOCS1干擾對KB細胞化療藥物敏感性的作用(n=3)

2.3SOCS1沉默增加化療藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡KB細胞長春新堿處理后凋亡率分別為實驗組 (20.83±3.6)%，對照組 (13.41±2.5)%，與對照組比較，實驗組細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)，見圖4。

圖4　SOCS1基因沉默對吉西他濱誘導(dǎo)KB細胞凋亡的影響

2.4SOCS1沉默增加長春新堿誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制化療藥物長春新堿處理KB細胞后，與對照組比較，實驗組細胞NF-κB和Caspase-3的蛋白表達水平顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)，見圖5。

3　討論

SOCS1基因甲基化、缺失及突變所導(dǎo)致的SOCS1表達減少在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色[5-6]。如有研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者腫瘤組織56%的SOCS1基因甲基化，且40%患者SOCS1基因缺失[7]。人頰癌細胞、人舌鱗癌細胞中基因SOCS1沉默后，細胞增殖能力減弱，使細胞周期阻滯在G0/G1期[4,8]。SOCS1過表達老鼠可以增加胰島素抗性，而降低SOCS1的表達可以增加胰島素的敏感性[9-10]。探討SOCS1可能為腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展機制提供新策略，但未見SOCS1對人口腔癌細胞化療藥物敏感性的相關(guān)文獻報道。

注：與對照組比較，*P<0.05。

圖5SOCS1基因沉默對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響(n=3)

研究報道RNA干擾抑制人舌鱗癌細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶1表達，能有效抑制舌鱗癌細胞的遷移和侵襲能力[11]。miR-155過表達還可以通過激發(fā)SOCS1和STAT3途徑增強喉部鱗狀細胞癌細胞的侵襲性和增殖轉(zhuǎn)移[12]。SOCS1高表達可影響細胞對多種細胞因子的敏感性，在干擾素-γ(IFN-γ)敏感性降低的過程中可能發(fā)揮著重要作用。研究表明人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1中SOCS1 表達抑制后，增殖能力下降，并增強細胞對IFN-γ 的敏感性[13]，研究表明人頰癌細胞BcaCD885、人舌鱗癌細胞CAL27中基因SOCS1沉默后，顯著降低化療藥物卡鉑和紫杉醇對腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度，提高其對化療藥物的敏感性[4,8]。本研究結(jié)果顯示，人口腔癌KB細胞中SOCS1表達抑制后，其對化療藥物氟尿嘧啶與長春新堿的敏感性也明顯增強。

研究還表明SOCS1表達下調(diào)能增加人血管平滑肌細胞Bax和p53蛋白的表達水平，降低Bcl-2表達，抑制增殖并促進其凋亡，有望成為治療動脈粥樣硬化的作用靶點[2]。氯化釓抑制胃癌細胞株增殖，通過增強線粒體Caspase-3活性促進細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，人口腔癌KB細胞中SOCS1表達抑制后，使化療藥物長春新堿誘導(dǎo)的凋亡率上升，細胞中凋亡蛋白NF-κB、Caspase-3表達水平升高，與相關(guān)文獻報道一致[2]。提示基因SOCS1可能是影響人口腔癌細胞化療藥物敏感性的重要因素。

[1]Zitzmann K,Brand S,De Toni EN,et al.SOCS1 silencing enhances antitumor activity of type I IFNs by regulating apoptosis in neuroendocrine tumor cells[J].Cancer Res,2007,67(10):5025-5032.

[2]丁浩,李菊香,洪葵,等.SOCS1 對氧化型低密度脂蛋白促進人血管平滑肌細胞增殖作用的影響[J].廣東醫(yī)學(xué),2011,32(17):2232-2235.

[3]Huang C,Li H,Wu W,et al.Regulation of miR-155 affects pancreatic cancer cell invasiveness and migration by modulating the STAT3 signaling pathway through SOCS1 [J].Oncol Rep,2013,30(3):1223-1230.

[4]馬壯,張勝,朱郁文,等.人舌鱗癌細胞 SOCS1 基因沉默對細胞增殖和化療藥物敏感性的影響[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2015,31(3):283-286.

[5]Hussain S,Singh N,Salam I,et al.Methylation-mediated gene silencing of suppressor of cytokine signaling-1 (SOCS-1) gene in esophageal squamous cell carcinoma patients of Kashmir valley[J].J Recept Sig Transd,2011,31(2):147-156.

[6]賀振新,楊凌,劉琳,等.多發(fā)性骨髓瘤中細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子 1 (SOCS1) 基因異常甲基化的研究 [J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,34(3):58-62.

[7]Zhang X,Wang J,Cheng J,et al.An integrated analysis of SOCS1 down-regulation in HBV infection-related hepatocellular carcinoma[J].J Viral Hepatitis,2014,21(4):264-271.

[8]黃宏偉,馬壯,余志剛,等.人頰癌細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1沉默對細胞增殖及化療藥物敏感性的影響 [J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2015,23(8):1053-1056.

[9]Ueki K,Kadowaki T,Kahn CR.Role of suppressors of cytokine signaling SOCS-1 and SOCS-3 in hepatic steatosis and the metabolic syndrome [J].Hepatol Res,2005,33(2):185-192.

[10] Yuan Y,Wang X,Zhang Y,et al.Research of SOCS1 silent DC vaccine on laryngocarcinoma therapy[J].J Clin Otorhinol,Head & Neck Surg,2012,26(4):169-173.

[11] 郭瑞,儲偉明,王子露.RNA干擾抑制人舌鱗癌細胞 MMP-1 表達對細胞侵襲,轉(zhuǎn)移能力的影響[J].江蘇醫(yī)藥,2015,41(6):633-635.

[12] Zhao XD,Zhang W,Liang HJ,et al.Overexpression of miR-155 promotes proliferation and invasion of human laryngeal squamous cell carcinoma via targeting SOCS1 and STAT3 [J].PloS One,2013,8(2):e56395.

[13] 呂清林,王娟,陳黎萍.SOCS1 基因沉默對人胰腺癌細胞增殖和干擾素-γ 敏感性的影響 [J].天津醫(yī)藥,2014,42(9):863-866.

Effects of suppressor of cytokine signaling-1 silencing on the chemotherapeutic drugs sensitivity of human oral cancer

XIA Fengjun,SHEN Tiebing

(DepartmentofStomatology,TheAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Huhhot，InnerMongoliaAutonomousRegion010050,China)

ObjectiveTo investigate the changes of chemotherapeutic drugs’ sensitivity of human oral cancer after suppressor of cytokine signaling-1 (SOCS1) gene silencing.MethodsWestern blotting and real-time PCR were used to verify the downregulation of SOCS1 human oral cancer cell line (KB) after transfection;and the change of chemotherapeutic drugs’ sensitivity was detected by MTT assay;flow cytometry was used to detect the cell apoptosis rate.Resultsof RT-PCR and Western blotting showed that the expression levels of SOCS1 mRNA and protein were significantly decreased in small interfering SOCS1 (SOCS1-siRNA) transfected KB cells.After the silence of SOCS1,the median inhibitory concentration of chemotherapeutic drugs (5-fluorouracil and vincristine) for KB cells decreased significantly (P<0.05).The cell apoptosis rate of vincristine for KB cells significantly increased after SOCS1 gene silencing (P<0.05).The NF-κB and Caspase-3 protein expression levels in the experiment group dropped significantly compared with that of control group (P<0.05).ConclusionsInhibition of SOCS1 gene expression of oral cancer KB cells enhances the sensitivity to chemotherapeutic drugs,and promotes the apoptosis of cancer cells induced by chemotherapeutic drugs.

Mouth neoplasms；Suppressor of cytokine signaling proteins;Gene silencing;Fluorouracil;Vincristine

申鐵兵，男，主任醫(yī)師，研究方向：口腔頜面外科，E-mail:shentiebing1969@qq.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.035

2016-04-05，

2016-07-06)