陳慶慶，陳 帥，李 峰，許程劍（石河子大學食品學院，新疆石河子市832000）

阿魏菇子實體多糖的結構及其抗氧化活性研究

陳慶慶，陳 帥+，李 峰，許程劍*
（石河子大學食品學院，新疆石河子市832000）

以從阿魏菇子實體中分離純化得到的多糖-阿魏菇多糖（Pleurotus ferulae Lenzi polysaccharides，PFLPs）作為研究對象，對其化學結構、鏈構象以及抗氧化活性進行了研究。實驗結果表明，PFLPs含有鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖五種單糖，摩爾比為1∶1.26∶0.85∶12.40∶4.31，并且糖鏈內具有β-D-葡聚糖結構。鏈構象分析表明PFLPs是一種具有三股螺旋結構的多糖。體外抗氧化活性實驗表明，PFLPs具有較高的DPPH自由基、ABTS+自由基和羥自由基清除活性，適度的超氧陰離子自由基清除活性，還原力活性的和Fe2+的螯合活性。結果表明，PFLPs是一種很有潛力的天然抗氧化劑。

阿魏菇多糖，結構表征，鏈構象，抗氧化活性

多糖在生物體中不僅起到提供和存儲能量的功能，還具有多種生物活性［1］，如抗腫瘤、抗癌、抗真菌、抗氧化以及免疫調節(jié)作用。就整體而言，不同的食用菌的多糖其生物活性與其結構和鏈構象密切相關，大部分食用菌多糖是β-葡聚糖，具有1→3、1→6型糖苷鍵連接的構型。據報道，裂褶菌多糖的抗腫瘤活性與其三股螺旋結構的比例相關，香菇多糖的抗腫瘤活性和糖鏈構象之間的關系表明單柔性鏈的抗腫瘤活性遠低于三螺旋鏈［2］。人體自由基的過量產生會對機體內的大分子造成損害，并導致各種相關的疾?。?］。此外，活性氧自由基也是食品加工和貯存中導致食品腐敗的的主要因素之一。然而，合成的抗氧化劑在食品安全方面會導致許多嚴重的問題，并對人體健康具有顯著的副作用，例如導致肝損傷和致癌［4］。因此，開發(fā)天然抗氧化劑是一項具有顯著意義的研究。

阿魏菇（Pleurotus ferulae Lenzi）從屬擔子菌亞門層菌綱傘菌目側耳科側耳屬，是干旱草原上極具代表性的蕈菌之一，同時也是中國新疆維吾爾自治區(qū)的特產菌類。阿魏菇是中國傳統(tǒng)的食用和藥用真菌，具有美味的口感和較高的營養(yǎng)價值。目前為止有關新疆阿魏菇多糖結構或生物活性的研究報道較少。在本次研究中，從阿魏菇子實體中分離純化出阿魏菇多糖（PFLPs），通過紅外光譜法，高效氣相色譜法對PFLPs的化學結構進行分析。通過剛果紅實驗和流變儀對PFLPs的鏈構象進行分析。此外，對PFLPs的抗氧化活性，包括還原力，Fe2+的螯合能力，超氧陰離子自由基、DPPH自由基、羥自由基和ABTS+自由基清除活性也進行了測試。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿魏菇 采至新疆清河縣；單糖標準品木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖 北京鼎國生物技術有限責任公司；其他試劑 國產分析純或色譜純。

ENK-PRO型酶標儀 美國Bioteck公司；旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器公司；Ultrospec-5300型紫外分光光度儀 美國Amersham公司；DHR-3型流變儀 美國TA公司；真空冷凍干燥系統(tǒng)、GC-14C氣相色譜系統(tǒng)、IRPrestige-21型傅里葉變換紅外光譜儀日本SHIMADZU。

1.2 實驗方法

1.2.1 PFLPs的分離和純化 參考文獻中多糖提取方法［1］，并做出一定修改。阿魏菇子實體干燥之后粉碎，稱取100 g，無水乙醇浸泡24 h脫脂，用60目雙層紗布過濾。殘留物45℃干燥，之后用蒸餾水85℃浸提3 h，重復浸提三次，計算多糖產率。隨后，室溫下用5 L，1.25 mol/L的NaOH/0.05%NaBH4溶液浸泡并洗滌殘留物兩次，合并上清液，用乙酸中和，離心（4000 r/min，15 min，4℃）去沉淀，旋轉蒸發(fā)濃縮，Sevag法去蛋白。然后，將等體積的丙酮緩慢加入上清液中，離心（8000 r/min，10 min，50℃），收集沉淀，之后沉淀用透析袋進行透析（截留分子量3500），冷凍干燥之后得阿魏菇純多糖PFLPs，計算PFLPs產率。之后將PFLPs配制成濃度為500 mg/mL的溶液，在波長200～400 nm的范圍內掃描其紫外光譜，檢測PFLPs的純度。

1.2.2 單糖組成分析 稱取PFLPs樣品5 mg進行水解，加2 mol/L的三氟乙酸4 mL，120℃水解5 h，N2吹干。向PFLPs的水解物和單糖標準品中分別加入鹽酸羥胺10 mg、吡啶0.5 mL和內標肌醇8 mg，90℃水浴30 min并振蕩，冷卻至室溫，加入醋酸酐0.5 mL，繼續(xù)90℃水浴30 min，N2吹干，加入乙醇，反復吹干3次后，2 mL三氯甲烷萃取，過濾之后得到的糖醇乙酸酯衍生物進行GC分析。

色譜條件：GC-14C，毛細管管柱（OV-1701，30 mm×0.32 mm）；膜厚0.25 μm；進樣量1 μL。程序升溫：初始柱溫為160℃，以6℃/min升至190℃，保持5 min，以8℃/min升至230℃，保持5 min；進樣口溫度為250℃，檢測器溫度為270℃。

1.2.3 傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）分析 精確稱取 PFLPs樣品1 mg，與KBr研磨混合壓片，在4000～400 cm-1的范圍內進行紅外光譜掃描。

1.2.4 剛果紅分析 稱取PFLPs樣品4 mg，加蒸餾水2.0 mL，80 μmol/L的剛果紅試劑2.0 mL，加1.0 mol/L 的NaOH，使NaOH的濃度由0 mol/L逐漸升至0.5 mol/L，蒸餾水無添加PFLPs作為對照，用紫外可見光譜儀掃描，測得在不同NaOH溶液濃度下的最大吸收波長。以NaOH濃度作為橫坐標，最大吸收波長作為縱坐標，繪制曲線。

1.2.5 動態(tài)溫度掃描 儲能模量（G′）和損耗模量（G″）的變化作為溫度的函數。使用流變儀對其進行研究（直徑為60 mm的平行板幾何板）。從0～50℃，在中粘彈線性區(qū)對G′和G″進行測量。

1.2.6 還原力測定 根據現有的方法［5］，在2.5 mL pH6.6的磷酸緩沖溶液中加分別入PFLPs標準溶液（0.6 mg/mL）：0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.3 mL，雙蒸水0.00、0.95、0.90、0.85、0.80、0.75、0.70 mL，再加入鐵氰化鉀（1%，1 mL），混合物50℃加熱20 min。急速冷卻，加10%的三氯乙酸2.5 mL，離心（5000 r/min，15 min）。取上清液2.5 mL、雙蒸水2.5 mL，再加0.1% 的FeCl3（0.1%，0.5 mL），混合均勻，25℃靜置10 min，之后在波長700 nm處測定吸光度值，繪制曲線。反應混合液的吸光度值隨著還原力的增加而增加，抗環(huán)血酸（VC）作為陽性對照。

1.2.7 Fe2+螯合活性測定 根據Manivasagan等的方法測定［5］。不同濃度的1 mL樣品溶液依次與氯化亞鐵（2 mmol/L，0.05 mL）、Ferrozine溶液（5 mmol/L，0.2 mL）、雙蒸水（2.75 mL）混合?；旌衔?5℃反應10 min，之后在波長562 nm處測定吸光度值，繪制曲線。雙蒸水作對照，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）溶液作為陽性對照。Fe2+的螯合能力的計算公式如下：Fe2+的螯合活性（%）=（A0-A1+A2）/A0×100，其中A0是對照組的吸光度值（雙蒸水代替PFLPs），A1是樣品在反應體系過程中的吸光度值，A2是樣品的最終吸光度值。

1.2.8 超氧陰離子自由基清除活性測定 根據已報道的方法［6］，在本實驗中進行一些修改，不同濃度0.5 mL的樣品溶液依次與Tris-HCl溶液（50 mmol/L，2 mL）、雙蒸水（2mL）和鄰苯三酚溶液（25 mmol/L，0.5 mL）混合。混合物25℃反應5 min。之后用鹽酸終止反應，在波長560 nm處測定吸光度值，繪制曲線。雙蒸水作對照，VC作為陽性對照。計算公式如下：超氧化物陰離子自由基清除活性（%）=（A0-A1+A2）/A0×100，其中A0是對照組的吸光度值（雙蒸水代替PFLPs），A1是樣品在反應體系過程中的吸光度值，A2是樣品的最終吸光度值。

1.2.9 羥自由基清除活性測定 依據已報道的方法［7］，不同濃度的1 mL的樣品溶液與硫酸亞鐵溶液（9 mmol/L，1 mL）、水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L，1 mL）和H2O2溶液（9 mmol/L，1 mL）混合?；旌衔?7℃反應30 min。在波長510 nm處測定吸光度值，繪制曲線。雙蒸水作對照，VC作為陽性對照。計算公式如下：超氧化物陰離子自由基清除活性（%）=（A0-A1+A2）/A0×100，其中A0是對照組的吸光度值（雙蒸水代替PFLPs），A1是樣品在反應體系過程中的吸光度值，A2是樣品的最終吸光度值。

1.2.10 DPPH自由基清除活性測定 依據已報道的方法［8］，不同濃度的2.0 mL樣品溶液與DPPH溶液（100 μmol/L，2.5 mL）混合?；旌衔镌?5℃平衡30 min。雙蒸水作對照，VC作為陽性對照。在波長510 nm處測定吸光度值，繪制曲線。計算公式如下：DPPH自由基清除活性（%）=（A0-A1+A2）/A0×100，其中A0是對照組的吸光度值（雙蒸水代替PFLPs），A1是樣品在反應體系過程中的吸光度值，A2是樣品的最終吸光度值。

1.2.11 ABTS+自由基清除活性測定 依據已報道的方法［9］，用pH7.4的PBS配制成5 mmol/L的ABTS+儲液，與MnO2反應，用0.2 μm的PVDF膜過濾，再用pH7.4的PBS稀釋，直至在波長735 nm處測定吸光度值為0.70±0.02，-20℃保存?zhèn)溆?。不同濃度?0 μL樣品液與3 mL的ABTS+溶液混合，混合液搖勻25℃避光靜置6 min。雙蒸水作對照，VC作為陽性對照。在波長734 nm處測定吸光度值，繪制曲線。計算公式如下：ABTS+自由基清除活性（%）=（A0-A1+A2）/A0×100，其中A0是對照組的吸光度值（雙蒸水代替PFLPs），A1是樣品在反應體系過程中的吸光度值，A2是樣品的最終吸光度值。

1.2.12 數據分析 本文實驗進行三次平行實驗，數據值為平均值±標準偏差（SD）。數據分析采用Origin 8.0軟件。

2 結果與討論

2.1 PFLPs的分離純化

圖1 阿魏菇（a）和PFLPs（b）Fig.1 Pictures of the Pleurotus ferulae Lenzi（a）and the PFLPs（b）

圖2 PFLPs紫外光譜圖Fig.2 The UV spectrum of mushrooms PFLPs

脫脂浸提提取之后水溶性多糖的產率為12.41%，脫蛋白純化后PFLPs的產率10.13%。如圖1所示，新鮮阿魏菇子實體圓潤飽滿，無機械損傷。提取純化得到多糖PFLPs顏色雪白，質地均勻。

由于多糖的純度對后后續(xù)實驗具有一定的影響，因此對多糖純度的鑒定是必要的。如圖2所示，PFLPs溶液在260nm沒有峰值，說明純化的PFLPs中沒有核酸；在280nm處也沒有吸收峰，說明PFLPs中也沒有蛋白質等雜質，呈現出典型的多糖光譜［10］。表明純化得到的多糖純度很高，雜質極少。

2.2 PFLPs的結構表征

圖3 單糖標準品（a）和PFLPs（b）的氣象色譜圖Fig.3 Gas chromatograms of standard monosaccharide（a）and PFLPs（b）

圖4 PFLPs的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectrum of PFLPs

通過GC分析PFLPs的單糖組成如圖3所示，與標準的單糖相比，氣相色譜分析表明，PFLPs為雜多糖，含鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為1∶1.26∶0.85∶12.4∶4.31。

圖4為PFLPs的在4000～400 cm-1的范圍的傅里葉紅外吸收光譜。在3410 cm-1處的寬峰是多糖中O-H的伸縮振動；在2917 cm-1處的吸收峰是C-H伸縮振動的特征吸收；在1762 cm-1處有吸收，這是-CHO的C=O伸縮振動，是肽鍵上的酰胺碳基吸收峰，表明樣品是含有蛋白質的糖綴合物［10］；在1516 cm-1和1061cm-1處的特異性條帶，這是吡喃糖環(huán)上的兩種C-O伸縮振動，表明其為吡喃環(huán)結構［11］；在809 cm-1處有吸收峰表明存在，這是C-H面外彎曲振動，表明PFLPs存在有β-D-葡聚糖［12］。

2.3 鏈構象分析

圖5 PFLPs-剛果紅復合物最大吸收波長Fig.5 Maximum absorption of PFLPs-Congo red complex

圖6 儲能模量（G′）和損耗模量（G″）隨溫度變化圖Fig.6 G′and G″dependence of temperature in aqueous solution

剛果紅試劑是一種酸性染料，可以與具有三股螺旋鏈構象的多糖發(fā)生反應形成絡合物，其最大吸收波長（λmax）將會發(fā)生紅移，在一定范圍濃度的NaOH溶液中，λmax會發(fā)生特征性變化（顏色變成紅紫色），當NaOH溶液的濃度大于0.3 mol/L時，λmax快速下降。如圖5所示，以不添加PFLPs的純剛果紅溶液為空白對照，隨著NaOH溶液的濃度升高，純剛果紅溶液的λmax先略微增加隨后減小至恒定，PFLPs-剛果紅絡合物的λmax下降的很快，表明PFLPs中高度有序的螺旋結構正在發(fā)生解離，轉變成自由卷曲的結構，因此導致其λmax下降［14］，最后PFLPs的螺旋結構基本完全解離，絡合物被完全破壞，λmax趨于穩(wěn)定。

如圖6所示，儲能模量（G′）和損耗模量（G″）隨著溫度的變化而變化，圖的變化特征與已報道的研究變化特征類似［8］，據此可以保證數據的可靠性。G′在10～15℃這個狹小的范圍迅速下降，這種現象與一些研究人員已經發(fā)現了三螺旋多糖的現象類似，如裂褶菌多糖［8］。

根據剛果紅實驗和流變學分析，可以得出結論，PFLPs具有三螺旋鏈構象。

2.4 抗氧化活性分析

2.4.1 還原力 因為抗氧化活性與還原力關系密切，因此還原力可以作為衡量潛在抗氧化活性的的一個指標［8］。如圖7所示，還原力隨著PFLPs濃度的增加而增加，說明PFLPs具有一定程度的還原力，濃度在5 mg/mL，PFLPs的還原力為0.26。然而，PFLPs的還原力在所有的測試濃度均小于VC。

圖7 還原力Fig.7 Reducing power

2.4.2 Fe2+螯合活性 鐵是生長代謝和許多生化反應所必需的一種微量元素，但是鐵元素過剩會催化氧化蛋白質，脂質和其他物質，從而導致氧化損傷和細胞損傷［5］。PFLPs的Fe2+的螯合能力如圖8所示，螯合活性隨著PFLPs的濃度增加而增加。在5 mg/mL的濃度下，PFLPs螯合效果是28.06%，而EDTA-2Na在濃度為1 mg/mL即具有將近99%的螯合效果，相比之下，PFLPs的Fe2+螯合能力較低。

圖8 Fe2+螯合活性Fig.8 Fe2+chelating activity

圖9 超氧陰離子自由基清除活性Fig.9 Superoxide anion radical scavenging activity

2.4.3 超氧陰離子自由基清除活性 超氧陰離子自由基被認為是羥基自由基的前體。在本實驗中，超氧陰離子自由基通過鄰苯三酚在堿性條件的自氧化作用產生［6］。如圖9所示，PFLPs和VC的超氧陰離子自由基的清除活性隨著濃度的增加而增加。在5 mg/mL的濃度下，PFLPs超氧陰離子自由基的清除率為44.21%。雖然PFLPs的IC50（半抑制率）值無法在測試的劑量范圍內確定，然而可知VC在濃度為1 mg/mL時，超氧陰離子自由基的清除率為98%。相比之下，PFLPs的超氧陰離子自由基清除活性顯得較低。

2.4.4 羥自由基清除活性 羥基自由基可以很容易地穿過細胞膜與大多數生物分子，如糖類、脂類、蛋白質和DNA發(fā)生反應，并引起細胞死亡，甚至組織損傷［9］。PFLPs的羥基自由基清除活性測試如圖10所示，PFLPs對羥基自由基的清除作用與濃度呈正相關，PFLPs的濃度為5 mg/mL時，其羥自由基清除活性為55.30%。在測試的劑量范圍內，PFLPs的IC50值為4.48 mg/L，結果分析，PFLPs具有較強的羥自由基清除能力。

圖10 羥自由基清除活性Fig.1 0 Hydroxyl radicalscavenging activity

2.4.5 DPPH自由基清除活性測定 因其方便性和可重復性，DPPH自由基被廣泛地應用于測定各種天然化合物的自由基清除能力［13］。如圖11所示，隨著PFLPs和VC含量的增加，兩者的DPPH自由基清除活性也增加。PFLPs和VC的濃度為5 mg/mL時，清除率分別為90.26%和94.72%。在測試的劑量范圍內，PFLPs 的IC50值為1.57 mg/L。顯然，PFLPs具有很強的DPPH自由基清除活性。

圖1 1DPPH自由基清除活性Fig.1 1 DPPH radical scavenging activity

2.4.6 ABTS+自由基清除活性測定 ABTS+自由基的清除活性，依據吸光值的變化來表征，這種方法已經被廣泛地用來測定化學成分的抗氧化活性［14］。由圖12可知，PFLPs具有ABTS+自由基清除活性，并呈劑量依賴性，表明其對ABTS+自由基清除具有較好的效果。當PFLPs的濃度為5 mg/mL時，其清除活性為68.52%。在測試的劑量范圍內，PFLPs的IC50值為2.91 mg/L。表明其具有較強的ABTS自由基清除活性。

圖12 ABTS+自由基清除活性Fig.1 2 ABTS+radical scavenging activity

3 結論

多糖PFLPs具有三股螺旋結構，其為雜多糖，含有β-（1→6）-葡糖基，單糖組成為鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為1∶1.26∶0.85∶12.4∶4.31?？寡趸钚苑治龅慕Y果表明，PFLPs具有較高的DPPH自由基活性（90.26%，5 mg/mL），ABTS+自由基清除活性（68.52%，5 mg/mL）和羥自由基清除活性（55.30%，5 mg/mL），適度的超氧陰離子自由基清除活性（44.21%，5 mg/mL），適度的還原力活性的和Fe2+的螯合活性。綜合分析，PFLPs是一種很有潛力的抗氧化劑。以上研究一方面對于阿魏菇子實體多糖產品的開發(fā)和利用提供了一定的理論依據，另一方面為活性多糖的構效關系研究以及通過人工分子改造提高其生物活性奠定了基礎。而對于其取代基團位置，側鏈單糖的位置、排序和糖環(huán)的大小、連接方式等更深層次結構的表征，以及多糖的結構和活性之間的深層次關系還有待進一步研究。

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Structural analysis and antioxidant activities of polysaccharides from the fruiting bodies of Pleurotus ferulae Lenzi

CHEN Qing-qing，CHEN Shuai+，LI Feng，XU Cheng-jian*
（College of Food Sciences，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

A polysaccharide fraction PFLPs was isolated and purified from the fruiting body of Pleurotus ferulae Lenzi.The chemical structure，chain conformation and antioxidant activities of PFLPs were investigated.The results indicated that PFLPs was mainly composed of Rhamnose，Xylose，Mannose，Glucose and Galactose with a molar ration of 1∶1.26∶0.85∶12.4∶4.31，and indicated the presence of β-D-glucan in the PFLPs.The chain conformation analysis showed that PFLPs was a triple helical polysaccharide.The antioxidant activity test in vitro revealed that PFLPs exhibited high DPPH radical，ABTS+radical and hydroxyl radical scavenging activities，moderate superoxide radical scavenging activities，reducing power and Fe2+chelating activities.The results suggested that PFLPs could be used as a potential natural antioxidant.

Pleurotus ferulae Lenzi polysaccharides；structural characterization；chain conformation；antioxidant activities

TS201.2

A

1002-0306（2016）02-0108-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.013

2015－04－17 +同為第一作者

陳慶慶（1994-），女，大學本科，研究方向：食品科學與工程，E-mail：1049077091@qq.com。

陳帥（1990-），男，碩士研究生，研究方向：天然產物制備與功能活性研究，E-mail：chenshuaifood@126.com。

*通訊作者：許程劍（1978-），男，博士，副教授，研究方向：天然產物制備與功能活性研究，E-mail：xuchengjianfood@yahoo.com。

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101256）；國家大學生研究訓練計劃項目（SRP2015178）。