何念武，白瑤，陳明山

（1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛　726000；2.陜西省煙草公司商洛市公司，陜西商洛　726000）

核桃青皮不同溶劑提取物的體外抗氧化活性

何念武1，白瑤1，陳明山2

（1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛726000；2.陜西省煙草公司商洛市公司，陜西商洛726000）

為了深入研究商洛核桃青皮不同溶劑提取物的體外抗氧化活性。在DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基、超氧陰離子以及總還原力等體外抗氧化體系上測定不同溶劑提取物的體外抗氧化活性。研究結(jié)果表明，核桃青皮不同溶劑提取物均有一定的體外抗氧化活性，且抗氧化能力呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，其中水提物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物的抗氧化活性高于乙醚與氯仿提取物?？傮w而言，核桃青皮乙酸乙酯提取物和乙醇提取物體外抗氧化活性最好。

核桃青皮；不同溶劑提取物；自由基；抗氧化活性

核桃青皮，中藥材名為青龍衣（Cortex Juglans Mandshuricae），為胡桃科（Juglandaceae）植物胡桃楸（Juglans Mandshurica Maxim）未成熟的外果皮，氣微，味微苦，有毒，主產(chǎn)于東北、河北、山東、山西、陜西等地。始載于《開寶本草》，稱為胡桃青龍，《救急方》中稱為青胡桃皮，自《山東中草藥手冊》稱為“青龍衣”后，現(xiàn)多延用此名稱［1］。研究表明，胡桃中主要含有黃酮類、醌類、鞣質(zhì)、沒食子酸類化合物等活性成份，并且核桃青皮中也含有這些活性物質(zhì)［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，核桃青皮具有抗腫瘤［4］、抑菌［5］、抗炎鎮(zhèn)痛［6］等功效。此外，在民間有用青核桃泡酒來治療神經(jīng)性皮炎的報道［7］。臨床上，李淑芳等［8］使用青龍衣酊劑可有效治療白癜風(fēng)。吳學(xué)勤等［9］將曬干的青龍衣水煎劑用來治療Ⅱ型糖尿病。呂俊芳等［10］從青龍衣中提取天然色素，而許澤宏等［11］進一步研究確定這種色素可以作為天然食用色素，在食品工業(yè)中有很好的應(yīng)用價值。然而，對于久負盛名的商洛核桃的相關(guān)研究則很少，尤其是關(guān)于核桃青皮的研究更是鮮有報道。商洛作為全國核桃主產(chǎn)區(qū)之一，每年都有大量的核桃青皮被倒入田間地頭、河流，嚴重污染環(huán)境。如果能夠從商洛核桃青皮中提取具有一定價值的活性成分，就有可能將其開發(fā)成天然抗氧化劑，這對于保護生態(tài)環(huán)境和以核桃青皮為原材料的新產(chǎn)品研發(fā)都具有重要意義。

1　材料與方法

1.1實驗材料與試劑

核桃青皮，于2014年8月采自商洛洛南縣寺坡中山，自然晾干。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-聯(lián)氮雙 （3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、還原型輔酶（NADH）、吩嗪甲硫酸鹽（PMS）、BHT（二丁基羥基甲苯）均購于sigma公司，氮藍四唑（NBT）上海藍季科技發(fā)展有限公司，其余試劑均為化學(xué)分析純，實驗過程用水均為蒸餾水。

1.2實驗方法

1.2.1核桃青皮提取物的制備

用不同溶劑提取核桃青皮所得提取物。將核桃青皮粉碎，過60目篩，備用。取核桃青皮粉末70 g，用紗布包好，放入索氏提取器中，按料液比1：10加入提取溶劑，浸泡20 min，超聲（40 kHz，25℃）提取3次，每次45 min。減壓濃縮，放入40℃烘箱中干燥，研磨成細粉，即得不同溶劑提取物，置干燥的試劑瓶中或放入冰箱備用。

1.2.2DPPH法

參照何念武等［12-13］方法并稍加調(diào)整，將試驗中DPPH溶液的溶劑甲醇改為乙醇，同時濃度調(diào)整為0.005%，靜置時間改為15 min。取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg·mL-1）各1 mL分別于1、2、3、4、5、6、7號離心管中，此后試劑添加次序不變，于517 nm處測吸光度（Ai），以溶劑代替樣品液作陰性對照（Aj），以相同濃度梯度的BHT作為陽性對照。

清除率/%=（1-Ai/Aj）×100

1.2.3ABTS法

參照何念武等［13］方法并做適當修改，將ABTS溶液濃度調(diào)整為5 mmol·L-1，K2S2O4水溶液濃度調(diào)整為50 mmol·L-1，二者等體積混合均勻，避光放置備用（宜現(xiàn)配現(xiàn)用），即得到（ABTS+）溶液，用磷酸鹽（PBS）緩沖溶液將ABTS+溶液稀釋至在734 nm波長處吸光度為0.70±0.02。取不同濃度的樣品溶液各1 mL，分別放于1、2、3、4、5、6、7號試管中，加入2.0 mL ABTS+溶液，混合均勻，分別在1、3、5、10 min時測其吸光度。ABTS+自由基清除率（S%）計算公式如下：

S%=（A0-A）/A0，其中A0為ABTS+溶液的吸光度，A為加藥液后的吸光度。

1.2.4總還原力測定方法

參照何念武等［12］方法進行。

1.2.5羥自由基清除能力測定方法

利用Fenton體系法測定并稍作改進，將試驗中過氧化氫用量調(diào)整為0.5 mL，水楊酸濃度和用量分別調(diào)整為0.035 mol·L-1和1 mL。取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液及相同濃度梯度的BHT溶液各1 mL，先后加入1.5 mL反應(yīng)液（含0.05 mmol·L-1EDTA、0.05 mmol·L-1FeCl3、1.4 mmol·L-1的PBS緩沖液）和20 mL H2O2，靜置10 min后加入水楊酸，37℃水浴45 min，終止反應(yīng)，于510 nm處測其吸光度（Ai），樣品溶劑為陰性對照（Aj），BHT為陽性對照。

清除率/%=（1-Ai/Aj）×100

1.2.6超氧陰離子清除能力測定法

根據(jù)何念武等［12-13］方法并加以改進，將NBT濃度改為0.05 mol·L-1，NADH濃度改為0.45 mol·L-1，PMS濃度改為 0.024 mol·L-1，用量均為1 mL，三種試劑添加次序不變。取上述不同質(zhì)量濃度的樣品溶液及BHT溶液各1 mL，分別放于1、2、3、4、5、6、7號試管中，依次加入NBT、NADH、PMS溶液，混勻，室溫放置5 min，測其560 nm吸光度（Ai），用溶劑作陰性對照（Aj），以相同濃度梯度的BHT作陽性對照。

清除率/%=（1-Ai/Aj）×100

2　結(jié)果與分析

2.1不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除作用

由圖1可以看出，核桃青皮幾種不同溶劑提取物對DPPH自由基都具有一定的清除作用，且清除率隨著樣品濃度的增加而增大，在整個遞增過程中95%乙醇提取物的清除率與陽性對照組（BHT）非常接近。當濃度為3.5 mg·mL-1時，BHT的清除率是95.36%，95%乙醇提取物的清除率為89.95%，兩者無明顯差異。由于BHT是公認的抗氧化劑，說明商洛核桃青皮提取物具有較強的體外抗氧化能力。

圖1　不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除能力

2.2不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除作用

ABTS經(jīng)活性氧活化后生成穩(wěn)定的淡藍綠色陽離子ABTS自由基，當其遇到抗氧化物質(zhì)時會與其發(fā)生顏色反應(yīng)，然后在ABTS自由基的最大收波長（一般為734 nm）下檢測吸光度變化情況，繼而反映該物質(zhì)的抗氧化能力強弱。因此，從圖2中可以看出，同一時間段核桃青皮不同溶劑提取物對ABTS自由基都具有一定的清除作用，且隨樣品濃度的增加而增大。當濃度達到3.5 mg·mL－1時，95%乙醇提取物的清除率與BHT基本相當，無明顯差異。幾種提取物清除ABTS自由基的能力大小依次為：95%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞水提取物＞氯仿提取物＞乙醚提取物。

圖2　不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除能力

2.3不同溶劑提取物的總還原力

通過對樣品總還原力的測定，可以判斷其是否是良好的電子供體，其供應(yīng)的電子除了可使Fe3+還原為Fe2+外，還可以參與自由基的反應(yīng)，從而使其形成穩(wěn)定的物質(zhì)便于后期分析檢測。

從圖3可知，核桃青皮不同溶劑提取物和BHT的總還原力都隨著樣品濃度的增加而增加，隨著樣品濃度的遞增乙酸乙酯、95%乙醇提取物和BHT的吸光度非常接近，無明顯差異。幾種提取物的總還原力大小依次為：乙酸乙酯提取物＞95%乙醇提取物＞水提取物＞氯仿提取物＞乙醚提取物。

2.4不同溶劑提取物對羥自由基的清除能力

從圖4中可以看出，核桃青皮不同溶劑提取物可有效清除羥基自由基，當樣品濃度達到3.5 mg·mL-1時乙酸乙酯提取物的清除率為88.67%，而此濃度下BHT的清除率為90.68%，二者的清除率無明顯差異，表明核桃青皮提取物具有很好的羥自由基清除能力。而羥基自由基（·OH）是ROS家族中非?；钴S的一類自由基，其能迅速與它接觸的物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致衰老、慢性疾病的發(fā)生。

圖3　不同溶劑提取物的總還原力

圖4　不同溶劑提取物對對羥自由基清除能力

2.5不同溶劑提取物對超氧陰離子的清除能力

從圖5中可以看出，核桃青皮不同溶劑提取物對超氧陰離子均有清除能力，其清除能力隨著樣品濃度的增大而增強。當樣品濃度為3.5 mg·mL－1時，可以看出BHT、乙酸乙酯提取物的清除率無明顯差異。五種不同溶劑提取物對超氧陰離子的清除能力為：乙酸乙酯提取物＞95%乙醇提取物＞水提取物＞氯仿提取物＞乙醚提取物。眾所周知，超氧陰離子對生物體的DNA有損傷作用，它不僅能產(chǎn)生不同形態(tài)的氧化因子，繼而進行脂質(zhì)過氧化，而且能同時放大細胞損傷，嚴重危害人體健康。因此，研究清除超氧陰離子具有重要意義。

圖5　不同溶劑提取物對超氧陰離子的清除能力

2.6各自由基體系的半數(shù)抑制濃度（IC50）

IC50值，即半數(shù)抑制率，也可稱作半數(shù)抑制濃度或者半數(shù)有效劑量等。常用來衡量活性物質(zhì)或某種藥物對抗刺激劑或者誘導(dǎo)劑所致反應(yīng)的強弱，其活性越強，則IC50值越小。本實驗的IC50值是通過樣品濃度與計算出的抑制率，在IC50計算軟件中算出IC50值。結(jié)果如表2。

表2　各自由基體系的IC50值

3　結(jié)論與討論

通過DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基、超氧陰離子以及總還原力等評價體系較詳盡地對商洛核桃青皮不同溶劑提取物體外抗氧化活性進行試驗，研究結(jié)果表明，核桃青皮具有較好的體外抗氧化能力，其抗氧化能力隨著樣品濃度的增大而增強，并且呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。當樣品濃度逐漸增大，其清除率愈接近陽性對照?？傮w而言，乙酸乙酯提取物和95%乙醇提取物的活性是最好的，這可能是與其有效成分有關(guān)，有待進一步研究。此外，翟梅枝［3］和蔣麗萍［4］等研究也表明核桃青皮主要的活性成分都是易溶于乙醇或者乙酸乙酯的，這與本研究結(jié)論一致。

眾所周知，天然產(chǎn)物活性成分主要是多酚類、黃酮類、醌類以及多糖等［14］，而在這些活性成分里面已知抗氧化活性較強的無非就是多酚類與黃酮類，其次才是多糖和醌類等其他成分，這與賈東升等［15］的研究結(jié)論一致。據(jù)此可以推測核桃青皮提取物具有開發(fā)成天然抗氧化劑的潛能，同時對于保護生態(tài)環(huán)境和新藥研發(fā)都具有重要意義。

［1］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典（上冊）［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：1744-1745.

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［15］賈東升，李榮喬，謝曉亮，等.連翹葉不同溶劑提取物體外抗氧化活性研究［J］.食品研究與開發(fā)，2016，37（2）：14-18.

（責(zé)任編輯：李堆淑）

A Study on Antioxidant Activity of Different Solvent Extracts of Walnut Green Husk

HE Nian-wu1，BAI Yao1，CHEN Ming-shan2
（1.CollegeofBiopharmaceuticalandFoodEngineering，ShangluoUniversity，Shangluo726000，Shaanxi；Shangluo Municipal Tobacco Company of Shaanxi Province，Shangluo726000，Shaanxi）

In order to study the in vitro antioxidant activity of the different solvents extract from walnutgreenhuskinShangluo.Invitroantioxidantactivityofdifferentsolventsextractswas determinedonDPPHradical，ABTSradical，hydroxylfreeradical，superoxideanionandtotal reducing power.The results showed that the walnut green husk of different solvent extracts had certain antioxidant activity in vitro，and the antioxidant ability was showing a good dose effect relationship，wherein the aqueous extract，ethanol extract，antioxidant activity of the ethyl acetate extract is higher than that of ether and chloroform extracts.Overall，the best green activity of ethyl acetate extract and ethanol extracts of walnut antioxidant.

walnut green husk；different solvent extract；free radical；antioxidant activity

TS201.2

A

1674-0033（2016）04-0044-05

10.13440/j.slxy.1674-0033.2016.04.012

2016-04-24

陜西省教育廳專項科研計劃項目（15JK1219）；商洛市煙草公司科技項目（KJ-2014-02）

何念武，男，陜西洛南人，碩士，講師