徐冬蘭，王晴川，曾曉雄，孫 怡*（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

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苦丁冬青苦丁茶咖啡酰奎尼酸類物質(zhì)與a-淀粉酶的相互作用特性

徐冬蘭，王晴川，曾曉雄，孫 怡*
（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

摘 要：探討苦丁冬青苦丁茶中咖啡?？崴幔╟affeoylquinic acids，CQA）：3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA對(duì)α-淀粉酶的體外抑制活性，并采用熒光光譜法和圓二色譜法分析CQA與α-淀粉酶的相互作用特性，使用修正后的Stern-Volmer方程與van't Hoff方程探討CQA-酶之間的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明：3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA對(duì)α-淀粉酶均有較強(qiáng)的抑制作用，半抑制濃度（IC50）分別為1.54、1.05、1.28、0.96、0.33、0.64 mg/mL；CQA與α-淀粉酶發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，生成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而造成酶分子內(nèi)部熒光發(fā)生猝滅；熱力學(xué)參數(shù)分析表明CQA與α-淀粉酶主要靠疏水作用力結(jié)合，反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行。此外，圓二色譜結(jié)果顯示CQA的結(jié)合引起α-淀粉酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，破壞了酶蛋白的天然構(gòu)象，從而降低了酶的催化活性。

關(guān)鍵詞：α-淀粉酶；咖啡?？崴?；熒光光譜；圓二色譜；相互作用

引文格式：

徐冬蘭， 王晴川， 曾曉雄， 等.苦丁冬青苦丁茶咖啡酰奎尼酸類物質(zhì)與α-淀粉酶的相互作用特性［J］.食品科學(xué)， 2016，37（13）: 6-12.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613002. http://www.spkx.net.cn

XU DongLan， WANG Qingchuan， ZENG Xiaoxiong， et al.Interaction properties of caffeoylquinic acid derivatives from Ilex kudingcha C.J.Tseng with α-amylase［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 6-12.（in Chinese with English abstract）

隨著現(xiàn)代生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，2型糖尿病和肥胖癥的發(fā)病率日益增高，其預(yù)防和治療方法成為了人們關(guān)注的焦點(diǎn)。已有研究表明餐后血糖濃度過高成為2型糖尿病和肥胖癥發(fā)生的重要因素［1-2］。胰α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）作用于淀粉或糖原分子內(nèi)部的α-1，4-糖苷鍵，最終生成麥芽糖、低聚糖、糊精和少量葡萄糖，是消化系統(tǒng)中的一個(gè)關(guān)鍵酶［3-4］。抑制α-淀粉酶的活性可以減緩淀粉的水解過程，從而控制餐后血糖水平的升高［5-6］。因此，有效和無毒的α-淀粉酶抑制劑對(duì)于2型糖尿病和肥胖的預(yù)防和治療具有重要的意義。

近年來，多酚類物質(zhì)對(duì)α-淀粉酶的抑制活性被廣泛探討。Fei Qunqin等［7］利用酶抑制動(dòng)力學(xué)探討了烏龍茶多酚及其單體表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、甲基化EGCG（EGCG3''Me）對(duì)胰α-淀粉酶體外活性的影響，表明烏龍茶多酚對(duì)胰α-淀粉酶具有顯著的抑制效果，抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。Miao Ming等［8］的研究表明葡萄皮中的白藜蘆醇具有較強(qiáng)的α-淀粉酶抑制活性，同時(shí)熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能以靜態(tài)猝滅的方式與酶發(fā)生結(jié)合。阮妙蕓等［9］采用體外模擬淀粉消化實(shí)驗(yàn)表明茶多酚在低濃度下便能對(duì)淀粉酶具有明顯的抑制作用。

苦丁茶是我國(guó)南部和東部地區(qū)居民長(zhǎng)期飲用的一種代用茶，也是傳統(tǒng)的藥用植物，其富含多酚類、萜類、黃酮類、多糖等活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血壓以及降脂減肥等功效［10-12］。本課題組前期建立了苦丁茶中多酚類物質(zhì)的分離、純化以及高效液相色譜分析方法，表明苦丁茶中的主要多酚類物質(zhì)為咖啡酰奎尼酸（caffeoylquinic acids，CQA）類衍生物，并通過柱層析和半制備色譜制備得到了6 種物質(zhì)，包括3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA［13-15］。CQA類衍生物被證明具有較強(qiáng)的α-淀粉酶抑制活性［16］，然而關(guān)于其與α-淀粉酶的相互結(jié)合作用機(jī)理卻未見報(bào)道。因此，在前期的研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)擬采用熒光光譜法研究CQA與α-淀粉酶的相互作用特性，為闡明CQA對(duì)α-淀粉酶的抑制機(jī)理提供信息，并為天然α-淀粉酶抑制劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咖啡?？崴幔?-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA，按照食品與納米生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道的方法自制［13-15］，純度均大于95%。

淀粉天青、豬胰α-淀粉酶、Tris-HCl緩沖溶液（pH 6.9、0.05 mol/L）、醋酸 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BL-220H分析天平 日本Shimadzu公司；DELTA 320 pH計(jì) 德國(guó)Mettler-Toledo公司；Genius 3旋渦混勻器德國(guó)IKA公司；TDL-5型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Synergy-2酶標(biāo)儀 美國(guó)Biotek公司；F-7000型熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇國(guó)華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CQA對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用

參照Hansawasdi等［17］的方法并稍作修改：用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的淀粉天青底物溶液，并于沸水浴中助溶5 min，之后置于37 ℃條件下預(yù)熱備用。將0.2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）分別與0.1 mL α-淀粉酶溶液（2.2 U/mL）充分混合，37 ℃預(yù)熱10 min后加入0.2 mL底物溶液，充分混勻后于37 ℃反應(yīng)10 min。最后各加入0.5 mL 50%醋酸溶液終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合液于4 ℃、3 000 r/min離心5 min，取上清液，測(cè)定其在595 nm波長(zhǎng)處的吸光度。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，按下式計(jì)算不同樣品對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

式中：Ac+為不加樣品但含酶的對(duì)照組在595 nm波長(zhǎng)處的吸光度；Ac－為不加樣品也不含酶的空白組在595 nm波長(zhǎng)處的吸光度；As為既加樣品也含酶的樣品組在595 nm波長(zhǎng)處的吸光度；Ab為加入樣品但未加酶的樣品對(duì)照組在595 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.2 CQA與α-淀粉酶相互作用特性的熒光光譜法分析

熒光猝滅作用：將3.0 mL 0.05 mg/mL的α-淀粉酶溶液準(zhǔn)確移入離心管中，用移液槍分別加入不同的樣品溶液（5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA或4，5-diCQA），使其終質(zhì)量濃度為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 mg/mL，在設(shè)定溫度（293、310 K）條件下于恒溫水浴中保溫0.5 h。使用1.0 cm的石英比色皿，固定激發(fā)波長(zhǎng)（λex）為280 nm、發(fā)射波長(zhǎng)（λem）290～450 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5.0 nm，掃描速率1 200 nm/min，在熒光分光光度計(jì)上恒溫掃描α-淀粉酶及反應(yīng)混合物的熒光光譜。

結(jié)合常數(shù)及熱力學(xué)相關(guān)參數(shù)的計(jì)算：固定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為340 nm，記錄α-淀粉酶及反應(yīng)混合物在293、310 K溫度條件下的熒光強(qiáng)度，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用于結(jié)合常數(shù)和相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算。

3D熒光光譜分析：設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的掃描范圍均為200～600 nm，狹縫寬度為5 nm，掃描α-淀粉酶及反應(yīng)混合物的3D圖譜。

1.3.3 圓二色譜（circular dichroism，CD）掃描

α-淀粉酶及其與樣品反應(yīng)混合液的CD光譜在Jasco-810圓二色譜儀上進(jìn)行。用緩沖液配制α-淀粉酶與樣品體系，使體系中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度始終固定為0.5 mg/mL，而樣品（5-CQA、3，5-diCQA）質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02 mg/mL。在室溫條件下反應(yīng)0.5 h后，分別測(cè)定α-淀粉酶原液及反應(yīng)混合液在200～250 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)遠(yuǎn)紫外CD光譜。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品重復(fù)掃描3 次。采用CDpro軟件中Selcon3算法分析取得的CD數(shù)據(jù)，得到關(guān)于α-淀粉酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 CQA對(duì)α-淀粉酶的抑制作用

以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制抑制曲線，結(jié)果如圖1所示，隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，抑制率明顯升高，當(dāng)3，5-diCQA的質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，抑制率接近100%，表明6 種CQA對(duì)α-淀粉酶的活性均有較強(qiáng)的抑制作用。通過線性擬合計(jì)算出不同樣品對(duì)α-淀粉酶的半抑制濃度（IC50），結(jié)果顯示3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA的IC50分別為1.54、1.05、1.28、0.96、0.33、0.64 mg/mL，抑制能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋?，5-diCQA＞4，5-diCQA＞3，4-diCQA＞4-CQA＞5-CQA＞3-CQA。雙取代咖啡酰奎尼酸的抑制效果明顯優(yōu)于單取代咖啡?？崴?，咖啡?；龆啵种苹钚栽鰪?qiáng)，表明結(jié)構(gòu)中的咖啡?；侵饕幕钚曰鶊F(tuán)，對(duì)抑制活性貢獻(xiàn)最大。

2.2 CQA對(duì)α-淀粉酶熒光光譜的猝滅效應(yīng)

藥物小分子與蛋白質(zhì)的相互結(jié)合作用通常會(huì)降低蛋白質(zhì)內(nèi)部的熒光強(qiáng)度，稱為熒光猝滅效應(yīng)［18］。胰α-淀粉酶由496 個(gè)氨基酸殘基組成，包括17 個(gè)色氨酸，因此在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm處能夠檢測(cè)到內(nèi)源性熒光［19-20］。實(shí)驗(yàn)中固定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，掃描α-淀粉酶及CQA與α-淀粉酶反應(yīng)混合物在300～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射光譜，結(jié)果如圖2所示。隨著4 種CQA質(zhì)量濃度不斷增大，α-淀粉酶的熒光強(qiáng)度逐漸降低，熒光光譜發(fā)生明顯猝滅。此外，α-淀粉酶在340 nm波長(zhǎng)處具有最大熒光發(fā)射峰，隨著CQA的加入，最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生明顯紅移（5-CQA，從340 nm移至360 nm；3，4-diCQA，從340 nm移至358 nm；3，5-diCQA，從340 nm移至362 nm； 4，5-diCQA，從340 nm移至365 nm）。這些結(jié)果表明CQA小分子與α-淀粉酶之間發(fā)生了結(jié)合作用，形成了復(fù)合物，使得酶蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，發(fā)色團(tuán)所處微環(huán)境的極性增強(qiáng)，疏水性發(fā)生變化［21］，最終改變了α-淀粉酶與作用底物之間的親和作用，導(dǎo)致催化活性下降。

2.3 結(jié)合常數(shù)及熱力學(xué)相關(guān)參數(shù)的分析

根據(jù)熒光猝滅數(shù)據(jù)，當(dāng)熒光供體分子與猝滅劑受體分子發(fā)生結(jié)合時(shí)，熒光猝滅強(qiáng)度和猝滅劑濃度之間的關(guān)系符合修正后的Stern-Volmer方程［22］：

式中：F0、F分別為樣品加入前后α-淀粉酶的相對(duì)熒光強(qiáng)度；Ka為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；［Q］為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

以lg［Q］為橫坐標(biāo)，lg［（F0－F）/F］為縱坐標(biāo)作圖，可得一組直線（圖3）。由直線的截距和斜率可以求出不同CQA與酶相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n（表1）。

小分子與蛋白質(zhì)之間可通過范德華力、氫鍵、靜電引力以及疏水性作用力相互作用。根據(jù)CQA和α-淀粉酶結(jié)合過程中的反應(yīng)焓變（ΔH）和熵變（ΔS）可確定兩者之間的結(jié)合類型。根據(jù)van't Hoff方程，可計(jì)算出ΔH 和ΔS。

式中：K為相應(yīng)溫度條件下（293、310 K）熒光物質(zhì)與猝滅劑之間的結(jié)合常數(shù)；R為氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））；T為反應(yīng)溫度/K，當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變可以看作常量。

根據(jù)公式（3）、（4）計(jì)算得到ΔH和ΔS，再由式（5）可計(jì)算得到CQA與α-淀粉酶結(jié)合過程的吉布斯自由能（ΔG），結(jié)果列于表1。

據(jù)文獻(xiàn)［23］報(bào)道，茶多酚與蛋白之間的結(jié)合常數(shù)通常為1.0×104～1.0×105L/mol。由表1可知，4 種CQA物質(zhì)與α-淀粉酶的結(jié)合常數(shù)為1.65×106～2.18×107L/mol，表明兩者之間存在較強(qiáng)的結(jié)合作用，雙取代咖啡?？崴岬慕Y(jié)合常數(shù)略大于5-CQA，表明咖啡酰基的增多提高了結(jié)合能力，與抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。此外還可發(fā)現(xiàn)，在293 K和310 K溫度條件下，結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而增大，說明溫度升高增加了CQA與α-淀粉酶之間的親和性，提高了CQA-酶復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而說明在人體體溫條件下更利于CQA抑酶活性的發(fā)揮。表1結(jié)果顯示n值約為1，表明4 種CQA與α-淀粉酶之間均存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

Ross等［24］根據(jù)大量實(shí)驗(yàn)總結(jié)了水相中小分子與生物大分子結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)與主要作用力之間的關(guān)系：1）當(dāng)ΔH＞0、ΔS＞0時(shí)，兩者間為疏水作用力；2）當(dāng)ΔH＜0，ΔS＜0時(shí)，則為氫鍵和范德華力；3）當(dāng)ΔH≈0，ΔS＞0，則為靜電引力。根據(jù)表1結(jié)果可知，4 種CQA與α-淀粉酶結(jié)合反應(yīng)的ΔH和ΔS均大于0，表明兩者之間主要靠疏水作用力相互結(jié)合，同時(shí)，CQA與α-淀粉酶分子結(jié)構(gòu)中均含有較多的羥基基團(tuán)，因此氫鍵的作用仍然不可忽視。此外，結(jié)合過程中的ΔG小于0，表明CQA與α-淀粉酶之間的相互作用是自發(fā)進(jìn)行的。

2.4 3D熒光光譜猝滅分析

3D熒光光譜是近年來發(fā)展起來的熒光分析技術(shù)，不僅具有靈敏度高和選擇性強(qiáng)的特點(diǎn)，還能全面展現(xiàn)蛋白質(zhì)的熒光特性［25］。α-淀粉酶具有內(nèi)源熒光發(fā)色基團(tuán)（主要為色氨酸、酪氨酸和脯氨酸），因此可采用3D熒光光譜有效表征CQA與α-淀粉酶相互作用后酶蛋白構(gòu)象和空間分子結(jié)構(gòu)的變化。

如圖4所示，CQA在測(cè)定范圍內(nèi)無熒光發(fā)射，對(duì)結(jié)果不會(huì)造成干擾。α-淀粉酶在激發(fā)波長(zhǎng)為200～300 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～400 nm范圍內(nèi)具有兩個(gè)強(qiáng)熒光峰，標(biāo)為峰1（230 nm/340 nm，λex/λem）和峰2（280 nm/340 nm，λex/λem），其中峰1是與酶蛋白多肽鏈的骨架結(jié)構(gòu)相關(guān)，反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，而峰2反映的主要是酶分子中色氨酸殘基的熒光行為［26］。從圖中可以看出，加入CQA后α-淀粉酶的兩個(gè)峰明顯被猝滅，其中3，4-diCQA和4，5-diCQA的猝滅效果最好，與常規(guī)熒光猝滅分析結(jié)果一致，再次證明雙取代咖啡?？崴釋?duì)α-淀粉酶有較強(qiáng)的結(jié)合作用。據(jù)報(bào)道，相對(duì)分子質(zhì)量較大的多酚-蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)比相對(duì)分子質(zhì)量較小的多酚-蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)要大，這可能是由于相對(duì)分子質(zhì)量較大的多酚中存在更多羥基基團(tuán)，與蛋白質(zhì)分子之間形成更多的氫鍵，從而增加了復(fù)合物的穩(wěn)定性［27］。CQA與α-淀粉酶相結(jié)合，由此導(dǎo)致酶蛋白空間構(gòu)象以及所處微環(huán)境疏水性的變化，最終表現(xiàn)為對(duì)酶活性的抑制作用。

2.5 CQA對(duì)α-淀粉酶圓二色譜的影響

圓二色譜是一種特殊的吸收譜，它利用蛋白質(zhì)等生物大分子具有的圓二色性得到關(guān)于生物大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。圓二色譜遠(yuǎn)紫外區(qū)段（178～250 nm）的主要生色團(tuán)是肽鏈，這一波長(zhǎng)范圍的CD譜包含了生物大分子主鏈構(gòu)象的信息［28-29］。為了進(jìn)一步理解CQA與α-淀粉酶之間的結(jié)合機(jī)制，探討其對(duì)酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響，本實(shí)驗(yàn)采用遠(yuǎn)紫外CD光譜分析5-CQA和3，5-diCQA結(jié)合后α-淀粉酶的構(gòu)象變化。如圖5所示，α-淀粉酶在208 nm 和222 nm波長(zhǎng)左右有兩個(gè)負(fù)峰，這是由肽鏈中的α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生n-π*躍遷而產(chǎn)生的，即負(fù)Cotton效應(yīng)［30］。加入樣品（5-CQA或3，5-diCQA）后，α-淀粉酶的CD光譜發(fā)生了較大的變化。隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，α-淀粉酶在208 nm和222 nm波長(zhǎng)處的兩個(gè)負(fù)峰信號(hào)變?nèi)酰⑶椅恢冒l(fā)生明顯移動(dòng)，表明酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋含量降低。并且從圖中可以看出，3，5-diCQA對(duì)α-淀粉酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響要大于5-CQA，這表明CQA結(jié)構(gòu)中的咖啡?；谂cα-淀粉酶的結(jié)合過程中發(fā)揮了重要作用。

為了進(jìn)一步定量分析CD圖譜數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)采用CDpro軟件中的Selcon3算法對(duì)α-淀粉酶分子中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果列于表2。α-淀粉酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含17.6%的α-螺旋，19.2% 的β-折疊，8.2%的β-轉(zhuǎn)角和55%的無規(guī)卷曲。5-CQA、3，5-diCQA與酶結(jié)合后使其4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)含量均發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為α-螺旋含量降低，β-轉(zhuǎn)角含量增多，說明酶蛋白的天然空間構(gòu)象受到破壞，穩(wěn)定性下降。

表2a-淀粉酶及a-淀粉酶與CQA結(jié)合后的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table2 Secondary structuralanalysisofa- amylaseandtheCQA-enzyme systems%樣品 α-螺旋 β-折疊 β-轉(zhuǎn)角 無規(guī)卷曲α-淀粉酶 17.6 19.2 8.2 55.0 α-淀粉酶+5-CQA（0.01 mg/mL） 16.7 43.1 9.2 31.0 α-淀粉酶+5-CQA（0.02 mg/mL） 11.9 29.9 21.0 37.2 α-淀粉酶+3，5-diCQA（0.01 mg/mL） 9.3 24.8 32.7 33.2 α-淀粉酶+3，5-diCQA（0.02 mg/mL） 3.4 15.8 32.7 48.1

3 結(jié) 論

本研究探討了苦丁冬青苦丁茶中CQA類物質(zhì)對(duì)α-淀粉酶的抑制作用，并采用熒光光譜法和圓二色譜法研究了兩者之間相互作用的機(jī)理。結(jié)果表明CQA類物質(zhì)能夠抑制α-淀粉酶的活性，抑制能力由大到小為：3，5-diCQA＞4，5-diCQA＞3，4-diCQA＞4-CQA＞5-CQA＞3-CQA。雙取代咖啡?？崴岬囊种菩Ч麖?qiáng)于單取代咖啡?？崴?，說明分子中的咖啡酰基發(fā)揮了主要作用。CQA與α-淀粉酶的相互作用引起酶蛋白熒光光譜的猝滅，造成酶內(nèi)部基團(tuán)所處微環(huán)境的疏水性減弱。CQA與酶之間主要依靠疏水性作用力結(jié)合，并且只具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，所有反應(yīng)均自發(fā)進(jìn)行。CD光譜結(jié)果表明，CQA與α-淀粉酶形成穩(wěn)定的復(fù)合物后使酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，破壞了酶分子的空間構(gòu)象，從而有效抑制了酶的催化活性。因此，本研究為探究苦丁茶中CQA類物質(zhì)作為天然α-淀粉酶抑制劑的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，在糖尿病和肥胖癥的預(yù)防和治療中具有一定意義。

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中圖分類號(hào)：TS272；TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）13-0006-07

收稿日期：2016-01-14

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171666）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：徐冬蘭（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：2013108031@njau.edu.cn

*通信作者：孫怡（1966—），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：sunyi01@njau.edu.cn

Interaction Properties of Caffeoylquinic Acid Derivatives from Ilex kudingcha C.J.Tseng with α-Amylase

XU Donglan， WANG Qingchuan， ZENG Xiaoxiong， SUN Yi*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract:The inhibitory effects of six caffeoylquinic acid （CQA） derivatives （3-CQA， 4-CQA， 5-CQA， 3，4-diCQA，3，5-diCQA and 4，5-diCQA） against α-amylase were studied comparatively by inhibitory activity assay.Furthermore， the potential interaction mechanisms between CQA derivative and α-amylase were investigated by fluorescence quenching and circular dichroism （CD） spectroscopy.The binding parameters were calculated according to modified Stern-Volmer equation，and the thermodynamic parameters were determined by the van't Hoff equation.The results showed that all CQA derivatives exhibited inhibitory effects on α-amylase and the half inhibitory concentrations （IC50） were 1.54， 1.05， 1.28， 0.96， 0.33 and 0.64 mg/mL， respectively.CQA derivatives interacted with α-amylase， forming stable complexes and leading to fluorescence quenching.Thermodynamic analysis indicated that the interaction process was spontaneous， and hydrophobic force might be primarily responsible for the interaction.In addition， the CD spectra suggested that the binding of CQA derivatives to the enzyme induced the change of protein structure， thus destabilizing the enzyme and reducing its activity.

Key words:α-amylase； caffeoylquinic acid； fluorescence spectroscopy； circular dichroism spectrum； interaction