夏小榮，熊玉玲，朱玉林，王亞亭

85株兒童感染金黃色葡萄球菌耐藥性及流行病學(xué)研究

夏小榮，熊玉玲，朱玉林，王亞亭

目的 了解安徽省各地區(qū)近年兒童感染金黃色葡萄球菌（SA）耐藥性及其流行病學(xué)特征，分析耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的葡萄球菌盒式染色體（SCCmec）基因型分布特點(diǎn)，為臨床感染和控制提供依據(jù)。方法 臨床分離2010年～2013年每年9月非重復(fù)的兒童SA共85株，利用Microscan Walk-Away-40全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，MRSA經(jīng)瓊脂倍比稀釋法進(jìn)行表型篩選、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）最終確定。多重PCR法檢測(cè)MRSA SCCmec基因分型。結(jié)果 85株SA中檢出19株MRSA和66株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA），MRSA的檢出率為22.35%。MRSA檢出率最多的標(biāo)本是痰液及咽拭子，其次為分泌物。全部SA對(duì)青霉素、克林霉素完全耐藥，未發(fā)現(xiàn)萬(wàn)古霉素耐藥及中介的菌株。與MSSA藥敏結(jié)果比較，MRSA對(duì)16種常用抗菌藥物的耐藥性更高。MRSA SCCmec分型以SCCmecⅢ最多見(jiàn)，共12株，其次為SCCmec I5株，未分型2株，未發(fā)現(xiàn)SCCmecⅡ、Ⅳ、Ⅴ型。結(jié)論 本地區(qū)兒童感染SA有不同的耐藥譜，兒童MRSA對(duì)同種抗菌藥物耐藥率均高于MSSA。兒童臨床分離的MRSA菌株其SCCmec基因型以Ⅲ型為主。臨床應(yīng)合理使用抗菌藥物，定期監(jiān)測(cè)耐藥性變遷，避免院內(nèi)傳播。

兒童；金黃色葡萄球菌；耐藥性；葡萄球菌盒式染色體；聚合酶鏈反應(yīng)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-3-8 8：29：02 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.054.htm l

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是兒科院內(nèi)及社區(qū)感染重要的病原菌，其感染嚴(yán)重、病情多樣變化、病死率高，給臨床治療帶來(lái)了巨大困難。由于抗菌藥物的廣泛使用，兒童耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcusaureus，MRSA）感染分離率正逐年升高，細(xì)菌耐藥性已成為臨床上抗感染領(lǐng)域的嚴(yán)峻問(wèn)題。為了解安徽省地區(qū)兒童感染SA對(duì)抗菌藥物的耐藥性及MRSA基因型分布特征，對(duì)2010年～2013年每年9月安徽省各地區(qū)醫(yī)院兒童臨床標(biāo)本中分離的85株SA進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并采用多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法分析MRSA分離株的基因分型。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源及質(zhì)控菌株 85株SA收集自2010年～2013年每年9月安徽省細(xì)菌耐藥中心監(jiān)測(cè)網(wǎng)41所醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)送檢標(biāo)本。質(zhì)控菌株為安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)控中心標(biāo)準(zhǔn)菌株SA ATCC 25923、ATCC 29213和ATCC 43300（mecA陽(yáng)性菌株）。

1.2 儀器、試劑和培養(yǎng)基 Microscan Walk-Away-40全自動(dòng)微生物分析儀購(gòu)自美國(guó)DADE公司；PCR儀器購(gòu)自德國(guó)Biometra公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司；多點(diǎn)接種儀購(gòu)自英國(guó)AQS Manufacturing公司；電熱恒溫箱購(gòu)自上海精宏公司；M-H瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司；葡萄球菌溶菌素購(gòu)自大連寶生物公司；PCR試劑盒：dNTP、Ex-Taq酶、Buffer、瓊脂糖、DL 600、DL 2000等均購(gòu)自上海生物工程公司。

1.3 抗菌藥物 青霉素、苯唑西林、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻肟、亞胺培南、美羅培南、萬(wàn)古霉素、替考拉林、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、氯霉素、利福平、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素共19種抗生素均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，均在有效期內(nèi)使用。

1.4 藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂倍比稀釋法對(duì)分離株進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，結(jié)果判定按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）2013版指南標(biāo)準(zhǔn)［1］進(jìn)行判定。

1.5 PCR法鑒定MRSA及SCCmec的多重PCR擴(kuò)增分型 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用PCR法對(duì)SA菌株進(jìn)行耐藥基因的擴(kuò)增即mecA基因，每次PCR均有 ATCC 43300陽(yáng)性對(duì)照、ATCC 29213陰性對(duì)照及雙蒸水作為空白對(duì)照，見(jiàn)圖1。經(jīng)藥敏試驗(yàn)及PCR鑒定MRSA，其SCCmec復(fù)合擴(kuò)增引物反應(yīng)條件參考Zhang et al［2］的報(bào)道并做適當(dāng)改變。SCCmec基因分型引物由上海生工工程有限公司合成，PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像系統(tǒng)觀察，并切取有效片段經(jīng)上海生工工程有限公司測(cè)序，見(jiàn)圖2。測(cè)序結(jié)果在Genbank比對(duì)，比對(duì)結(jié)果確定其為擴(kuò)增產(chǎn)物，見(jiàn)圖3。

圖1 部分MRSA基因分型圖譜M：Marker；1～7：受試　MRSA菌株；8：陽(yáng)性對(duì)照菌株　ATCC 43300；9：陰性對(duì)照菌株 ATCC 29213；10：雙蒸水對(duì)照

圖2 部分 MRSA的 SCCmec多重PCR分型圖譜M：Marker；1～3：SCCmecⅠ型的　MRSA；4～8：SCCmecⅢ型的MRSA

圖3 測(cè)序圖A：mecA；B：SCCmecⅠ型；C：SCCmecⅢ型

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SA的分布及藥敏數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，兩組的比較采用χ2檢驗(yàn)。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2.1 MRSA分離情況 2010年～2013年每年9月共收集兒童金黃色葡萄球菌85株，其中MRSA 19株，檢出率為22.35%（19/85）。

2.2 SA標(biāo)本分離來(lái)源、病區(qū)分布及年齡分段 兒童SA標(biāo)本主要來(lái)源最多見(jiàn)為痰液及咽拭子，占52.95%，分泌物次之為11.82%；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，兩標(biāo)本來(lái)源所占比例比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.502，P＜0.05），見(jiàn)表2。病區(qū)分布多見(jiàn)于普兒內(nèi)科，占43.53%，其次為兒外科為32.94%，兩科室所占比例比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.243，P＜0.05），見(jiàn)表3。年齡段來(lái)源多見(jiàn)于嬰幼兒，占51.77%，學(xué)齡期兒童次之為27.27%，兩年齡段所占比例比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.306，P＜0.05），見(jiàn)表4。

表2 MSSA與MRSA臨床標(biāo)本來(lái)源構(gòu)成比［n（%）］

2.3 SA的藥敏結(jié)果分析 85株SA均對(duì)青霉素和克林霉素100%耐藥；對(duì)頭孢曲松、頭孢他啶、大環(huán)內(nèi)脂類耐藥率高，為50.59%～82.35%；對(duì)氯霉素、左氧氟沙星、苯唑西林等耐藥性較低，為20.00%～36.74%；對(duì)亞胺培南、利奈唑胺等耐藥率低，為9.41%～15.29%；未發(fā)現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥株。除青霉素、克林霉素和萬(wàn)古霉素外，MRSA與MSSA對(duì)其余16種抗菌藥物均有不同程度耐藥，且MRSA的耐藥率均高于MSSA，見(jiàn)表5。

表3 MSSA與MRSA臨床科室分布構(gòu)成比［n（%）］

表4 M SSA與　MRSA年齡段來(lái)源分類構(gòu)成比［n（%）］

表5 M RSA與　MSSA對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥性

2.4 MRSA的SCC基因分型結(jié)果 19株MRSA分離株SCCmec分型共有Ⅰ、Ⅲ型兩型，其中Ⅲ型為最常見(jiàn)的SCCmec型，占63.16%（12/19）；其次是Ⅰ型，占26.32%（5/19）；未分型的2株，占分離株的10.53%（2/19）。

3 討論

隨著抗菌藥物的廣泛使用，兒童SA感染的分離率呈逐年上升趨勢(shì)，是醫(yī)院感染的重要病原菌，并常有暴發(fā)流行的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，我省兒童MRSA分離率為22.35%，與近年國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)［3-6］報(bào)道的兒童感染資料相近。朱德妹等［3］對(duì)國(guó)內(nèi)主要地區(qū)14所教學(xué)醫(yī)院（12所綜合性醫(yī)院、2所兒童醫(yī)院）臨床分離的SA菌株采用統(tǒng)一方案進(jìn)行細(xì)菌藥敏試驗(yàn)，報(bào)道［3-7］顯示MRSA居歷年革蘭陽(yáng)性菌分離株的首位，2010年報(bào)道上述醫(yī)院共收集SA 4 452株，MRSA的平均檢出率為51.7%（11.5% ～77.6%），兒童?？漆t(yī)院MRSA的檢出率為11.5% ～24.5%［4］。2011年報(bào)道 SA 6 000株，MRSA平均檢出率為50.6%（20.2%～85.3%），兒童為20.2% ～27.7%［5］。2012年報(bào)道SA 7 339株，MRSA平均檢出率為47.9%（18.4%～82.9%），兒童為18.4% ～29.4%［6］。2013年報(bào)道 SA 8 127株，MRSA平均檢出率為45.2%（23.8%～72.0%），兒童為23.8% ～37.6%［7］。不同地區(qū)或醫(yī)院間、成人和兒童MRSA的檢出率比較有差異，可能與用藥習(xí)慣、標(biāo)本來(lái)源、研究菌株例數(shù)、研究方法等密切相關(guān)。

本研究顯示，安徽省各級(jí)醫(yī)院收集分離的85株SA主要分離自呼吸道標(biāo)本痰液和咽拭子，占所有臨床送檢標(biāo)本的52.95%。其次為分泌物，占18.82%，其他來(lái)源標(biāo)本占28.23%。提示臨床上要加強(qiáng)對(duì)兒童患者呼吸道感染好發(fā)部位的監(jiān)測(cè)與護(hù)理，是預(yù)防與控制臨床感染的重要途徑。從臨床來(lái)源各科室分布看來(lái)，兒內(nèi)科和兒外科尤其骨科檢出率居多，分別為43.53%和 32.94%，提示加強(qiáng)醫(yī)院里重點(diǎn)高危科室的綜合管理，對(duì)防止SA醫(yī)院內(nèi)感染的爆發(fā)流行極為重要。從年齡段分布來(lái)看，SA所致的感染在學(xué)齡前期（3～6歲）較少，所占比例為4.71%，而在嬰幼兒和學(xué)齡期兒童多見(jiàn)，分別為51.77%和27.05%。這與兒童的年齡特點(diǎn)相關(guān)，嬰幼兒的自身免疫功能尚未發(fā)育成熟，皮膚黏膜等非特異性免疫屏障功能薄弱，抗感染能力較差，易發(fā)生各種感染，而學(xué)齡期兒童經(jīng)常參加比較劇烈的體育運(yùn)動(dòng)或戶外活動(dòng)，外傷后易繼發(fā)感染［8］。

藥敏結(jié)果顯示，85株SA未發(fā)現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥株，對(duì)替考拉林、美羅培南、亞胺培南耐藥率低，表明這些藥物是SA感染患兒治療首選和有效的藥物，臨床在使用時(shí)應(yīng)做好耐藥性監(jiān)測(cè)，避免濫用。氯霉素、利福平、左氧氟沙星、慶大霉素耐藥率較低，表明這些藥物對(duì)SA仍具有較好的抗菌活性，提示這些抗菌藥物在藥敏結(jié)果未出來(lái)而SA感染較重時(shí)，可以優(yōu)先考慮使用，待藥敏結(jié)果再行調(diào)整。大環(huán)內(nèi)酯類、克林霉素、頭孢他啶、頭孢曲松耐藥率高，表明目前這些抗菌藥物已不適用于治療SA引起的兒童感染。本研究SA藥敏結(jié)果與李穎豐等［9］報(bào)道藥敏結(jié)果相比較顯示，兩者都對(duì)萬(wàn)古霉素完全敏感，對(duì)青霉素完全耐藥，其次對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率低，而對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均有所增高。

本實(shí)驗(yàn)藥敏結(jié)果進(jìn)一步顯示，MRSA和MSSA對(duì)苯唑西林、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、慶大霉素耐藥率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些抗菌藥物對(duì)MSSA有較好的治療效果，而對(duì)MRSA耐藥率高，所以在未確定SA是否為MRSA的情況下，臨床上不建議首選這些抗菌藥物。頭孢他啶、大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物在兩組中比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這些抗菌藥物耐藥率均在50%以上，無(wú)論SA是否為MRSA，臨床上均不予考慮使用。利福平、左氧氟沙星、氯霉素等其他7種抗菌藥物的耐藥率均在50%以下，表明在臨床SA感染較重時(shí)而藥敏結(jié)果未歸時(shí)，可以考慮使用這些抗菌藥物。臨床上在確診SA感染時(shí)，應(yīng)區(qū)別對(duì)待MRSA和MSSA，根據(jù)藥敏結(jié)果及時(shí)、合理使用抗菌藥物預(yù)防和控制感染。

目前認(rèn)為MRSA的耐藥機(jī)制是MSSA在獲得了SCCmec元件，此SCCmec元件上mecA基因編碼產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白（PBP2a），對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的親和力降低，從而產(chǎn)生對(duì)抗菌藥物的耐藥［10］。在世界不同地區(qū)MRSA菌株攜帶的SCCmec類型的流行趨勢(shì)亦不盡相同，亞洲地區(qū)MRSA菌株攜帶Ⅱ型SCCmec基因型主要見(jiàn)于日本和韓國(guó)，其他大多數(shù)地區(qū)MRSA菌株以攜帶Ⅲ型的SCCmec［11］為主。我國(guó)各地學(xué)者［12-14］對(duì)當(dāng)?shù)胤蛛x的MRSA SCCmec基因檢測(cè)分析結(jié)果表明，我國(guó)分離的MRSA攜帶的SCCmec基因型也以Ⅲ型為主，同時(shí)也有不同比例的其他類型SCCmec存在。本研究對(duì)所檢測(cè)的19株 MRSA進(jìn)行SCCmec擴(kuò)增分型，結(jié)果表明SCCmecⅢ型的MRSA為12株，SCCmec I型的MRSA為5株，未分型的2株，說(shuō)明引起本地區(qū)感染的MRSA以SCCmecⅢ型為主，和國(guó)內(nèi)報(bào)道一致。

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Antim icrobial resistance and epidem iology of 85 isolates of Staphylococcal aureus infection in paediatrics

Xia Xiaorong，Xiong Yuling，Zhu Yulin，et al
（Dept of Paediatrics，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the antimicrobial resistance and the epidemiological characteristics of Staphylococcusaureus（SA）.To analyze themethicillin-esistant SA（MRSA）staphylococcal cassette chromosome（SCCmec）genotype distribution characteristics，so as to provide evidence for clinical infection and control.Methods A total of85 clinical isolatesof SA were consecutively collected from different clinical significance specimens，and were excluded the repeated isolates from the same patients.All isolates SA and drug sensitivity testwere identified by the Microscan Walk-Away-40 automaticmicroorganism analyzer.The MRSA wasmade by agar dilutionmethod for phenotype screening and further identified by polymerase chain reaction（PCR）.The genotypes of SCCmec were determined bymultiplex PCR.Resu lts Of 85 strains isolated SA，there were 19 strains MRSA and 66 strainsmethicillin sensitive SA（MSSA）.The detection rate ofMRSA was22.35%.Themain detection rate ofMRSA specimens was sputum and throat swab，followed by secretions.All SAwere completely resistant to penicillin and childamycin，but entirely sensitive to vancomycin.Compared with MSSA，the drug resistance of16 common antimicrobial agengts was higher than that of MRSA.SCCmec genotyping results showed that themost frequent SCCmec type wasⅢ.The 12 isolates of MRSA were SCCmecⅢ，only 5 isolateswere SCCmecⅠ，and 2 isolates had no genotype.TypeⅡ，typeⅣand typeⅤwere not found in the group.Conclusion There are different resistance patterns of SA in the local area.The rates of drug resistance of MRSA for children are higher than those of MSSA.The main SCCmec genotype of MRSA in children is SCCmecⅢ.Clinician should use antimicrobial drugs rationally，and furthermore，we should regularlymonitor the change of resistance and preventnosocomial transmission.

children；Staphylococcus aureus；antimicrobial-resistance；staphylococcal cassette chromosome mec；polymerase chain reaction

R 446.5

A

1000-1492（2016）04-0574-05

2015-12-08接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1408085QH157）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，合肥 230022

夏小榮，女，碩士研究生；
王亞亭，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wangyating@163.com