姜宇 閻一林 朱國興* 徐又佳

1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市第二人民醫(yī)院，骨科 214000 2. 美國俄勒岡州立大學(xué) 3. 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科

鐵過載可能是骨質(zhì)疏松癥的獨立危險因素[1]，高鐵環(huán)境對成骨細胞有抑制的作用[2]，而鐵過載對于成骨代謝影響的具體機制目前尚不明確。隨著第二代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，科學(xué)界也開始越來越多地應(yīng)用第二代測序技術(shù)來解決基因和機制上的問題[3]。主要原理是通過進行全基因組的深度測序，在基因組水平上掃描并檢測不同位點，發(fā)現(xiàn)個體差異的分子基礎(chǔ)。我們利用枸櫞酸鐵銨(FAC)造成高鐵環(huán)境，將斑馬魚生活在高鐵環(huán)境造成其鐵過載的模型[4]。運用高通量測序發(fā)現(xiàn)Bmp2(骨形態(tài)發(fā)生蛋白2)基因受到抑制，通過體內(nèi)以及離體的一系列實驗證實鐵過載對Bmp2通道的抑制作用。

1 材料和方法

1.1材料

聚合鏈式反應(yīng)基因擴增儀，MicroCL 17離心機；Step One Plus熒光定量PCR儀；GL212pro凝膠成像系統(tǒng)；SZ61體視顯微鏡。

1.2斑馬魚胚胎的收集

野生型斑馬魚(TUB ABC)取自蘇州大學(xué)生物鐘研究中心。按照Zebrafish Book的描述進行飼養(yǎng)和產(chǎn)卵。下午喂食半小時后設(shè)置斑馬魚交配盒，每盒中放入一雌一雄兩條魚，中間用透明擋板隔開。次日上午9:00抽去隔板，30～35min后用濾網(wǎng)收集魚卵并洗去雜物。

1.3枸櫞酸鐵銨干預(yù)試驗

挑選受精后第二天已破膜孵出的斑馬魚幼魚，至于合適的濃度[4]的枸櫞酸鐵銨(FAC)的培養(yǎng)皿中，每盤隨機放魚20尾，采用靜水式換水補藥法，每隔12小時換試液。

1.4高通量測序

RNA-seq序列是由信使核糖核酸樣品由Illumina公司HiSeq 2000測序(Illumina公司)、樣品的總RNA樣本磁吸附產(chǎn)生的碎片,并作為模板合成第一鏈cDNA使用隨機hexamersand逆轉(zhuǎn)錄酶，再使用DNA聚合酶I和RNaseH互補脫氧核糖核酸合成,再純化用QiaQuick PCR提取工具包(試劑盒、希爾登,德國),與EB緩沖液結(jié)束。

1.5實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測目的基因表達量的反應(yīng)體系與程序:SYBR Premix Ex Taq 10μL，正向引物(P1)0.8μL，反向引物 (P2)0.8μL，cDNA2.0μL，雙蒸水6.4μL，總體積20μL，反應(yīng)程序: 95℃，3min,1 cycles; 95℃，10s,58℃(退火溫度) 30S,40cycles:65℃- 95℃融解曲線。相關(guān)序列用軟件Primer5設(shè)計，并通過Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)檢驗其保守性引物序列。見表1。

表1 runx2a,runx2b,sp7,β-actin基因的引物序列 Table 1 Prima sequences of runx2a, runx2b, sp7, and β-actin gene

1.6轉(zhuǎn)基因魚獲取

Runx2a轉(zhuǎn)基因斑馬魚來自美國俄勒岡州立大學(xué)神經(jīng)所饋贈。

1.7構(gòu)建runx2a的啟動子和bmp2a的cDNA

根據(jù)Ensembl軟件設(shè)計runx2a的啟動子和bmp2a的cDNA并將其設(shè)計引物，將其PCR的產(chǎn)物通過連接和酶切連接到PCDNA3.1載體上，構(gòu)建質(zhì)粒。引物序列見表2。

表2 runx2a的啟動子和bmp2a的cDNA的引物序列Table 2 Prima sequences of runx2a promoter and bmp2a cDNA

1.8Luciferase reporter實驗

HEK293細胞培養(yǎng)在含10%血清的DMEM中，轉(zhuǎn)染根據(jù)LipofectAmine(英杰公司)制造商的指示。報告基因進行dual-reporter分析系統(tǒng)(Promega);分別加入100 ng runx2a-luc,bmp2a，40ng銨鐵(III)，每個實驗進行了重復(fù)三次。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法

使用△△Ct法分析，基因的相對表達量=2-△△Ct?！鳌鰿t=△Ct(實驗組)-△Ct (對照組)，△Ct=Ct (目的基因)- Ct (內(nèi)參基因)，每個樣本設(shè)3組生物學(xué)重復(fù)，每組生物學(xué)重復(fù)設(shè)3個技術(shù)重復(fù)。用Microsoft Excel分析工具t-test分析基因表達差異的顯著性，以**即P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1高通量測序結(jié)果

挑選受精后第二天已破膜孵出的斑馬魚幼魚，至于合適的濃度的枸櫞酸鐵銨(FAC)的培養(yǎng)皿中，4天后提取RNA，發(fā)現(xiàn)Bmp2通道受到抑制。見圖1。

圖1 高通量測序發(fā)現(xiàn)BMP2通道受到抑制Fig.1 BMP2 channel was inhibited shown by high throughput sequencing

2.2FQ-PCR

斑馬魚的WT和鐵過載的斑馬魚在96h提取其cDNA為模板進行比較，發(fā)現(xiàn)其高鐵環(huán)境下的斑馬魚的BMP2及其下游的相關(guān)的成骨基因相比WT的定量FQ-PCR后均明顯下降。表明在分子水平上鐵過載抑制BMP2相關(guān)的成骨基因。

圖2 FQ-PCR：斑馬魚的WT和鐵過載的斑馬魚的FQ-PCR結(jié)果比較，BMP2相關(guān)的成骨相關(guān)的基因都明顯下調(diào)。Fig.2 Comparison of FQ-PCR results between wild type and iron overloaded zebra fish. BMP2-related osteogenesis genes were significantly down-regulated

2.3在體實驗中鐵過載對斑馬魚中的runx2a基因表達下調(diào)：在體實驗中將轉(zhuǎn)基因runx2a標記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚高鐵環(huán)境下與正常環(huán)境在第九天后進行比較，基因runx2a表達下調(diào)。說明在體實驗中鐵過載抑制runx2a基因。

2.4Luciferase reporter實驗：HEK293細胞在含10%血清的DMEM中培養(yǎng)，加入100ng的runx2a-luc和bmp2a cDNA，加入40ng鐵(III)干預(yù)后后runx2a收到抑制。說明鐵過載對于成骨的bmp2a介導(dǎo)的runx2a的信號通道有影響。見圖4。

3 討論

圖3 鐵過載對斑馬魚中的Runx2a基因表達下調(diào)，A為WT的runx2a基因表達，B為高鐵環(huán)境下的runx2a基因表達(熒光顯色及放大倍數(shù)為5)。Fig.3 Effect of iron overloading on Runx2a gene expression in zebra fish. A, Runx2a gene expression in WT; B Runx2a gene expression in high-iron environment (fluorescent labeling, magnification ×5)

圖4 Luciferase reporter實驗，加入100ng的runx2a-luc和bmp2a cDNA，runx2a在加入BMP2后得升高，加入40ng鐵(III)干預(yù)后runx2a表達受到抑制。Fig.4 Luciferase reporter experiment. 100 ng of runx2a-luc and bmp2a cDNA were added. Runx2a increased after addition of BMP2, but it decreased after addition of 40 ng iron (III).

有文獻表明FAC干預(yù)斑馬魚4天后造成斑馬魚的鐵過載[4]，成功造模后我們觀察到FAC處理的斑馬魚的礦化面積明顯減少[4]。但導(dǎo)致鐵過載礦化障礙的具體機制目前不明確，因此我們利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，轉(zhuǎn)錄組廣義上指某一生理條件下細胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，狹義上指所有mRNA的集合。蛋白質(zhì)是行使細胞功能的主要承擔(dān)者，但由于目前蛋白質(zhì)實驗技術(shù)的限制，轉(zhuǎn)錄組成為研究基因表達的主要手段[5]。轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質(zhì)組的必然紐帶，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是目前研究最多的，也是生物體最重要的調(diào)控方式。相對于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺，轉(zhuǎn)錄組測序無需預(yù)先針對已知序列設(shè)計探針，即可對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測，提供更精確的數(shù)字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強大工具[6]。通過轉(zhuǎn)錄組測序，我們發(fā)現(xiàn)一系列的基因上調(diào)和下降，其中對于成骨代謝基因BMP2相關(guān)的通道基因尤為明顯，因此我們采用定量QPCR來驗證并證實這一發(fā)現(xiàn)。相關(guān)文獻報導(dǎo)提出[7]斑馬魚的破骨細胞在受精后20 d出現(xiàn)，本研究在10 d內(nèi)完成，因此我們推斷高鐵環(huán)境導(dǎo)致斑馬魚的骨礦化不全主要原因是抑制其成骨功能，而BMP2是其影響的重要通道之一。

在骨骼發(fā)育和骨折愈合中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白是一個極其重要的調(diào)節(jié)蛋白家族。BMP2 是BMPs家族中非常重要的一個亞型，可以刺激間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，并促進成骨細胞分化為骨細胞[8-10]。細胞外BMP2配體可以與Ⅱ型受體結(jié)合，進而磷酸化Ⅰ型受體，Ⅰ型受體磷酸化下游的R-Smads(Smad1、Smad5和Smad8)[10]，轉(zhuǎn)位進入核內(nèi)，復(fù)合物轉(zhuǎn)位進入核內(nèi)上調(diào)Runx2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、Osterix(sp7)和同源盒基因等基因促進成骨分化[11]。Park[12]在研究辛伐他汀與聯(lián)合作用成骨的研究中，證實用BMP2蛋白激活可以明顯增加ALP活性和Smad1/5/8蛋白的磷酸化水平從而促進成骨分化。有文獻表明BMP是調(diào)控鐵調(diào)素的上游通道[13],通過調(diào)節(jié)鐵調(diào)素來調(diào)節(jié)鐵的代謝，但鐵的代謝是否對BMP有影響成為我們關(guān)注的問題。

在研究中我們運用深度測序和定量驗證方法證實Runx2a, Runx2b, Osterix(sp7)等成骨基因均下調(diào)。在體內(nèi)實驗中，我們觀察到轉(zhuǎn)基因Runx2a標記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚高鐵環(huán)境下與正常環(huán)境在第九天后比較后基因表達的水平明顯下調(diào)。在體外實驗中，我們發(fā)現(xiàn)細胞熒光素酶報告基因Runx2a在Bmp2a轉(zhuǎn)染下大幅升高，鐵干預(yù)后runx2下降,細胞的蛋白實驗也說明證實了Runx2a的基因表達水平在高鐵環(huán)境下與正常組相比受到抑制。這些實驗證明在高鐵對于BMP2通道有抑制作用，具體相關(guān)機制還需要進一步探討中。

本研究第一次在使用高通量轉(zhuǎn)錄組測序這一工具，在基因?qū)用嫔?，用分子生物學(xué)的技術(shù)手段尋找相關(guān)通道，從定量PCR和轉(zhuǎn)基因在體斑馬魚的結(jié)果上來看，高鐵下調(diào)了BMP影響的下游的Runx2基因，并運用離體的一系列實驗證實鐵過載對Bmp2有抑制影響從而導(dǎo)致骨代謝的異常，初步解釋了鐵過載對于成骨代謝影響的相關(guān)機制。