龔忠勤 潘明珠 盧虹玉 崔燎 劉義

1. 廣東醫(yī)學院廣東天然藥物研究與開發(fā)實驗室，廣東 湛江 524023 2. 廣東醫(yī)學院藥理教研室，廣東 湛江 524023 3. 廣東海洋大學水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524088

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)退化為特征，導致骨脆性增加，骨折風險增大的全身性代謝性骨骼疾病[1]。研究表明，高血脂是引起OP的一個危險因子，在OP的發(fā)生與發(fā)展中扮演著重要的角色[2]。目前建立高血脂性骨質(zhì)疏松動物模型采用脂肪乳劑灌胃[3]，但由于脂肪乳劑的制備比較復雜，探究操作簡單的高血脂性骨質(zhì)疏松模型建立方法意義重大。

P407由約70%乙烯氧化物和30%丙烯氧化物組成，是聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯的三嵌段共聚物。因具有特殊的方向熱凝膠性質(zhì)，小劑量P407原位凝膠多被用于溫敏型藥物載體，具有毒性低，刺激性小，生物相容性好等特點[4,5]。近年來，高劑量P407腹腔注射已廣泛應用于實驗動物高血脂模型的建立[6,7]。本實驗通過腹腔注射P407建立大鼠HLP模型，評價其骨密度，骨生物力學及骨微結(jié)構(gòu)的變化，探討HLP與OP之間的關(guān)系，為進一步建立穩(wěn)定的高血脂骨質(zhì)疏松動物模型提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

注射用P407生產(chǎn)于浙江八達通精細化學品有限公司(批號：130507)；低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)抗體購于武漢博士德生物有限公司。其他試劑為分析純。

1.2 動物實驗及分組

3月齡雌性SD大鼠20只，體重為200±20 g，由廣東醫(yī)學院實驗動物中心提供。室溫條件下標準飼料飼養(yǎng)，自由飲用自來水。實驗過程對動物的處置符合科技部《關(guān)于善待動物的指導性意見》要求。20只大鼠隨機分成2組，分別是對照組和高血脂組，每組10只，每周一稱重。

1.3 給藥方法

分組適應性喂養(yǎng)3 d后，對照組每隔3 d腹腔注射生理鹽水(1 mL/10 g)，高血脂組每隔3天腹腔注射P407(392 mg/kg)。實驗進行12 w心臟取血處死大鼠，收集血清和雙側(cè)股骨及第五腰椎(-80℃保存?zhèn)溆?及脛骨(70%乙醇保存?zhèn)溆?。

1.4 血清中血脂水平檢測

檢測方法按照南京建成LDL，TG，TC試劑盒提供的說明書操作。樣品準備好后采用全波長酶標儀(Biotec，USA)測定，并按說明書提供的計算方法得出血清中血脂水平。

1.5 骨密度、骨生物力學檢測

把左側(cè)股骨及腰椎粘附的肌肉剃干凈后，獨立分裝在灌有生理鹽水、無水乙醇比例為1∶1混合溶液的EP管中，送往上海生物力學研究所檢測。其中股骨和腰椎均進行骨密度(BMD)，股骨進行骨生物力學檢測，包括彈性載荷(EL)，最大載荷(ML)，斷裂載荷(BL)，骨剛度系數(shù)(BRC)。

1.6 Micro-CT掃描

將大鼠股骨固定于掃描管中，沿骨長軸方向利用Micro-CT(vivaCT40，SCANCO，瑞士)在電壓50 kVp，電流160 μA，分辨率為2048×2048下進行掃描。掃描完畢后選取生長板下1 mm×4 mm為松質(zhì)骨重建區(qū)域，重建閾值均為125。重建完畢后可得骨組織體積分數(shù)(BV/TV)，結(jié)構(gòu)指數(shù)(SMI)，連接度(Conn.D)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁數(shù)目(Tb.N)，骨小梁分離度(Tb.Sp)等反應骨微結(jié)構(gòu)指數(shù)及圖片。

1.7 HE染色

樣本準備遵循本課題組前期報道[8]。石蠟切片4 μm用于蘇木素-伊紅(HE)染色。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，再經(jīng)高濃度至低濃度酒精，最后入蒸餾水。將已入蒸餾水的切片放入蘇木素中染色數(shù)分鐘，隨后酸水及氨水中分色，數(shù)秒后用流水沖洗1 h。70%和90%酒精脫水10 min后用伊紅染色2～3 min。隨后脫水透明，樹膠封片后顯微鏡(E400，Nikon，Japan)下觀察拍照。

1.8 骨免疫組織化學

骨免疫組織化學染色按照本課題組前期報道[8]以及試劑說明書操作。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 體重

結(jié)果如圖1所示，兩組間大鼠體重無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 實驗大鼠體重變化圖Fig.1 The change of body weight of the rats

2.2 大鼠血清血脂指標

HLP組血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)水平均明顯高于Cont組(P<0.01)(圖2)。結(jié)果說明長期使用P407能使大鼠血脂紊亂，出現(xiàn)高血脂癥。

圖2 實驗大鼠血清血脂濃度與對照組相比，** P<0.01 Fig.2 The serum concentrations of LDL, TG, and TC**P<0.01 vs Cont

2.3 股骨及腰椎骨密度

骨密度結(jié)果如圖3，經(jīng)P407處理后，HLP大鼠股骨骨密度相較于Cont組無明顯變化(P>0.05)。

圖3 實驗大鼠股骨與腰椎骨密度 Fig.3 The BMD of the femur and the lumbar vertebrae

2.4 股骨骨生物力學指數(shù)

與Cont相比，HLP組大鼠BL和ML未見顯著性差異，但BRC與EL均明顯低于Cont組(P<0.05)(圖4)。結(jié)果說明P407引起的HLP可降低大鼠股骨骨生物力學性能。

圖4 實驗大鼠股骨骨生物力學指數(shù) 與對照組相比，**P<0.01 Fig.4 Bone biomechanical properties of the femur**P<0.01 vs Cont

2.5 Micro-CT掃描

在HLP組中，大鼠BV/TV，Conn.D，Tb.N，Tb.Th均明顯下降(P<0.05)，而SMI，Tb.Sp顯著上升(P<0.05)(圖5)。3D重建圖及各指數(shù)說明注射P407后，大鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)退化。

2.6 脛骨HE染色

從圖6可以看出，HLP組中脛骨生長板下方骨小梁少于Cont組。

2.7 免疫組織化學染色

HLP組與Cont組相比，BMP2平均光密度值顯著下降，而PPARγ升高明顯(P<0.01)，結(jié)果見圖7。P407可降低BMP2的表達，而使PPARγ表達量上升。

3 討論

HLP是由于脂肪代謝異常使血漿中一種或幾種脂質(zhì)高于正常，可表現(xiàn)為高膽固醇血癥，高三酰甘油血癥或兩者兼有(混合型高脂血癥)。P407可以增加血液中膽固醇以及甘油三酯的濃度，引起動物血脂紊亂，其作用機制可能是P407可阻斷脂肪酶和肝素可釋放脂蛋白脂酶，減少膽固醇向外周組織轉(zhuǎn)移，抑制甘油三酯水解，增加內(nèi)生膽固醇的合成，從而導致高血脂癥[9,10]。本實驗表明，P407腹腔注射可增加大鼠血清脂質(zhì)(TC，TG，LDL)濃度，證實P407能引起大鼠血脂紊亂從而造成高血脂癥。

圖5 實驗大鼠骨微結(jié)構(gòu)3D重建及相關(guān)指數(shù)與對照組相比，* P<0.05,** P<0.01Fig.5 3D reconstruction and the trabecular microarchitecture of the femur*P<0.05,**P<0.01 vs Cont.

圖6 脛骨生長板下骨小梁(HE染色，×100)Fig.6 Trabecular bone in epiphysis of the tibia (HE staining, ×100)

圖7 免疫組織化學陽性染色及平均光密度值與對照組相比，** P<0.01Fig.7 The positive staining images of BMP2 and PPARγ and quantitative results of immunohistochemistry staining**P<0.01 vs Cont

骨密度是反應骨量丟失及骨質(zhì)疏松的一個重要指標，主要通過雙能X線吸收測定法(dual energy X-ray absorptiometery, DXA)。由Fig.3 可知，HLP組大鼠股骨及腰椎骨密度并未出現(xiàn)顯著的變化，可能的原因是：DXA會將骨組織、骨髓、脂肪和骨外肌肉均看作礦物質(zhì)，可能引起骨密度測定出現(xiàn)不準確[11]；實驗周期不夠長，注射P407的頻率不夠高。實驗發(fā)現(xiàn)，相對于正常組，股骨骨密度出現(xiàn)輕微下降，我們設(shè)想，假如延長實驗周期，股骨骨密度的變化有可能出現(xiàn)統(tǒng)計學意義，這有待于進一步實驗的驗證。

研究表明，部分患者骨密度差異不明顯，骨折風險也會增大，如糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松，其骨生物力學和骨微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的下降[12]。骨生物力學是以工程力學為基礎(chǔ)，研究骨組織在外界作用下的力學特性和骨組織在受力后的生物學效應，是對骨質(zhì)量進行評定的一種可靠手段[13]。最大載荷表示骨斷裂前所承受的最大載荷，其值越大說明骨試件能承受的外力沖擊越大；彈性載荷說明骨在彈性范圍所能承受的最大載荷；斷裂載荷表示骨斷裂或者碎裂所能承受的載荷值；剛度又稱外在硬度，反應抗變形的能力。Micro-CT可準確、科學、全面反應骨組織微觀結(jié)構(gòu)。SMI是用于評價骨小梁的形態(tài)結(jié)構(gòu)，定義骨小梁板狀和桿狀的程度，理想板狀結(jié)構(gòu)為0，理想桿狀結(jié)構(gòu)為3，發(fā)生骨質(zhì)疏松時，骨小梁從板狀向桿狀轉(zhuǎn)變，SMI數(shù)值增加[14]。由Fig.4 和5可知，高血脂組中，彈性載荷和剛度下降， BV/TV，Conn.D，Tb.N，Tb.Th均明顯下降，而SMI，Tb.Sp顯著上升。3D重建圖可以看出，HLP組骨微結(jié)構(gòu)退化。結(jié)果表明，高血脂可降低大鼠骨生物力學性能，惡化骨微觀結(jié)構(gòu)，增加骨折的風險，與文獻報道低密度脂蛋白水平升高會增加椎骨骨折的風險[15]一致。這可能HLP可抑制骨形成[2]，促進骨髓細胞向破骨細胞分化，促進破骨細胞的成熟，增加骨吸收[16]有關(guān)。

免疫組化結(jié)果顯示HLP組BMP2表達少于Cont組；BMP2是轉(zhuǎn)化生長因子β家族成員，可介導骨形成，BMP2表達下降可使骨形成降低[17]。同時結(jié)果也顯示腹腔注射P407能增加PPARγ的表達。PPARγ大量表達于白色和棕色脂肪組織中，可調(diào)控脂肪分化特異基因，是脂肪形成的關(guān)鍵調(diào)控因子[18]。高表達PPARγ可降低人或動物的骨量[19]。HE染色結(jié)果進一步證實了P407引起的HLP可減少骨小梁數(shù)目，降低骨量。

本研究發(fā)現(xiàn)P407腹腔注射不僅能導致大鼠HLP，還能明顯的降低大鼠的骨生物力學性能，使骨微結(jié)構(gòu)退化，降低BMP2的表達，使骨形成下降。該動物模型能為尋找預防高血脂骨質(zhì)疏松癥藥物提供研究平臺。