金鑫 朱立國 李秀蘭 賈建 張揚(yáng) 孫曉雷 馬劍雄 李風(fēng)波 馬信龍*

1. 天津市天津醫(yī)院骨科研究所，天津 300211 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100102

褐藻多糖硫酸酯是一類從海帶中提取的天然硫酸化多糖，其主要成分為褐藻糖、硫酸根以及少量糖醛酸、半乳糖和木糖。國內(nèi)外大量研究表明，褐藻糖膠具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化等[1]。骨重建是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共同參與的過程，骨形成與骨吸收的失衡是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥和骨硬化癥等疾病的重要病因。成骨細(xì)胞參與骨形成，破骨細(xì)胞參與骨吸收。因此，破骨細(xì)胞的凋亡直接影響骨吸收，從而影響骨重建過程。大量研究證實(shí)柚皮苷可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增值、分化成熟；提高骨密度、提升骨骼力學(xué)性能，防治去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松[2-4]。但褐藻糖膠對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過在體外LMWF對(duì)RANKL誘導(dǎo)的成熟破骨細(xì)胞的作用，觀察LMWF對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響以及其機(jī)制，為L(zhǎng)MWF抗骨質(zhì)疏松在破骨細(xì)胞方面提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

小鼠單核細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株(中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心)；褐藻糖膠，(Sigma公司)；牛皮質(zhì)骨(自制)；小鼠重組可溶性核因子кB受體活化因子配體(sRANKL)(Peprotech公司)；capsase-3活性測(cè)試試劑盒(南京碧波公司)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒(Sigma公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清(Gibco公司)；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二鈉(Sigma 公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、D-hank’s液(自制)；All-in-OneTM qPCR Mix、All-in-OneTM qPCR Primer (美國 GeneCopoeia公司)。

1.2 儀器

掃描電子顯微鏡；細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning 公司)；倒置相差顯微鏡、CX-21 光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司)；5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus 公司)；流式細(xì)胞儀及相關(guān)分析軟件(BD公司)；iQ5 Real Time PCR檢測(cè)洗脫(Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1薄骨片制備：粗切獲取牛股骨的皮質(zhì)骨，沿著股骨的長(zhǎng)軸方向切取厚約100 μm的皮質(zhì)骨骨片，細(xì)砂紙將骨片打磨平滑，修剪成0.5 cm×0.5 cm大小的正方形，紫外線消毒正反面過夜， 75%乙醇浸泡30 min，無菌D-hank’s液清洗3遍，放置于培養(yǎng)基中，置于4 ℃?zhèn)溆?，用時(shí)取出晾干。

1.3.2破骨細(xì)胞誘導(dǎo)與鑒定：(1)誘導(dǎo)：將RAW264.7單核細(xì)胞株接種于6孔板上的預(yù)置無菌玻片和薄骨片上，細(xì)胞接種密度2×104/mL，4 h后待細(xì)胞貼壁，換為濃度為100 ng/mL RANKL的10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q液1次。(2)鑒定：誘導(dǎo)5 d后，①倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)特征；②TRAP染色：將玻片取出，用檸檬酸鹽/丙酮溶液固定30 s，在以萘酚AS-BI磷酸鹽作為底物的孵育液中37 ℃孵育1 h，蒸餾水洗3次，蘇木精復(fù)染2 min，干燥后二甲苯透明，封固后光鏡觀察抗酒石酸酸性磷酸酶陽性多核破骨細(xì)胞(≥3個(gè)核)。③骨吸收陷窩：先用胰蛋白酶和EDTA將薄骨片上的破骨細(xì)胞消化，2.5%的戊二醛固定30 min，PBS超聲清洗3次，每次5 min，30%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換乙醇，CO2臨界點(diǎn)干燥，噴金后掃描電鏡觀察骨吸收陷窩。

1.3.3TRAP陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)與骨吸收面積分析：實(shí)驗(yàn)分為空白組和低分子量褐藻糖膠組，按照上述的方法誘導(dǎo)5 d后，LMWF組采用含有5 ng/mL LMWF培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)3 d后取出玻片，進(jìn)行TRAP染色(方法同上)。計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：①兩組分別在100倍視野下隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值；②細(xì)胞呈現(xiàn)玫瑰紅色或粉紅色，細(xì)胞核≥3個(gè)，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。骨吸收陷窩操作方法同上，兩組各10張薄骨片，每張骨片隨機(jī)選取10個(gè)區(qū)域，區(qū)域之間無重疊，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)骨吸收面積進(jìn)行分析。

1.3.4吖啶橙染色：RAW264.7細(xì)胞株以2104/mL密度爬片，100 ng/mL RANKL誘導(dǎo)5 d后，換為含有5 ng/mL LMWF的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定5 min，醋酸酸化30 s，PBS清洗1 min；加入0.01%吖啶橙染液5 min，PBS清洗，用0.1 mol/LCaCl2分色2 min, PBS 緩沖液清洗3次(10 s/次)。以PBS 緩沖液做介質(zhì)封片, 用激發(fā)濾板BG-12, 阻斷濾片波長(zhǎng) 515 nm，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，換為含有LMWF的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2d后，胰酶消化，與培養(yǎng)液一起收集，離心5 min(1500 r/min)。培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次，之后用PBS洗滌1次，以 1×106/mL密度重懸細(xì)胞于結(jié)合緩沖液。取100μL細(xì)胞加入2μL Annexin V-FITC和10 μL PI(propidium iodide)。設(shè)置以下3組用于調(diào)試流式細(xì)胞儀：①不加 Annexin VFITC 也不加 PI；②加 Annexin V-FITC不加 PI； ③加 PI 不加 Annexin V-FITC。輕輕混勻后室溫避光反應(yīng) 15 min后，補(bǔ)加 400μL 結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。

1.3.6caspase-3活性測(cè)定：細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，換為含有LMWF的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，胰酶消化，離心(2000 r/min，5 min)，吸除上清，PBS清洗1次。加入50 μL裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解30 min，其間渦旋振蕩3次(10 s/次)。4℃離心(12000 r/m，10 min)，小心吸取上清液(含裂解的蛋白質(zhì))轉(zhuǎn)移至新的管中，按照試驗(yàn)說明書的反應(yīng)體系進(jìn)行加樣。用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值(OD)。計(jì)算caspase-3的活性單位，飽和底物濃度下1個(gè)酶活力單位在37℃每小時(shí)可以剪切1 nmol/L Ac-DEVE-pNA 產(chǎn)生1 nmol/L pNA 的caspase-3的酶量。計(jì)算結(jié)果顯示為各組相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)量。

1.3.7熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)：細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，換為含有LMWF的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d，之后將兩組細(xì)胞采用胰酶消化，收集細(xì)胞，加1 mLTRIzol溶液，振蕩混勻。采用相分離技術(shù)抽提取RNA，瓊脂糖電泳法檢測(cè)：BCL-2與BAX基因濃度及完整性。各組檢測(cè)基因反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以 GAPDH為內(nèi)參基因，引物由廣州復(fù)能基因有限公司設(shè)計(jì)?；蛞镄蛄校篏APDH 正向引物正向引物5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，反向引物5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’，擴(kuò)增片段為 96 bp； BCL-2正向引物5’-ACGGGGTGAACTGGGGGAGG-3‘反向引物5’-GCATGCTGGGGCCGTACAGT-3’，BAX正向引物5’-GATGGACGGGTCCGGAGA-3’反向引物5’-CTCAGCCCATCTTCTTCCAG-3’逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、PCR 擴(kuò)增體系以及反應(yīng)條件按照試劑盒說明書設(shè)定。反應(yīng)完成后進(jìn)行擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析?；虮磉_(dá)量以檢測(cè)基因的初始模板量以 2-△△Ct表示。

2 結(jié)果

2.1 TRAP陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)與骨吸收面積分析

由圖1A，1B可見，RANKL誘導(dǎo)5 d后，加入含有LMWF的培養(yǎng)液(LMWF濃度5 ng/mL)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，進(jìn)行TRAP染色?？瞻捉M成熟破骨細(xì)胞數(shù)量比較多于柚皮苷組，且細(xì)胞核較多；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，P<0.05，有差異。由圖1C、1D可見對(duì)照組骨吸收陷窩數(shù)目較多，骨吸收總面積較大；而LMWF組骨吸收數(shù)目少，總面積小，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，P<0.05，有差異。提示LMWF可以抑制破骨細(xì)胞的活性以及骨吸收功能，見表1。

2.2 吖啶橙染色結(jié)果

吖啶橙可以非特異性的結(jié)合細(xì)胞核的核酸，在592 nm波長(zhǎng)激發(fā)光下顯黃色熒光，圖2A正常的破骨細(xì)胞吖啶橙染色淺淡，細(xì)胞核大小均勻、染色質(zhì)分布均勻；圖2B凋亡的破骨細(xì)胞吖啶橙著色較深，細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞核大小不均、染色質(zhì)分布不均。提示LMWF能明顯的促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞的凋亡。

圖1 LMWF對(duì)破骨細(xì)胞TRAP染色與骨吸收陷窩的影響1A為對(duì)照組，1B為L(zhǎng)MWF組，1C為對(duì)照組，1D為L(zhǎng)MWF組Fig.1 Effect of LMWF on TRAP staining and resorption pits1A, 1C: Control group; 1B, 1D: LMWF group

組別樣本數(shù)目(n)TRAP陽性細(xì)胞數(shù)目(n) 骨吸收面積μm2對(duì)照組529.4±3.23451.6±108.2LMWF組517.6±2.4?1972.4±96.4?

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LMWF對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

破骨細(xì)胞經(jīng)Annexin V與PI雙染后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，得出四個(gè)象限。分別為Q1(左上)象限：為PI單陽性，代表細(xì)胞膜破壞而核膜存在的細(xì)胞，一般指機(jī)械損傷細(xì)胞；Q2(右上)象限為PI,V -FITC雙陽性，代表中晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞；Q3(右下)象限為V-FITC單陽性，代表早期凋亡細(xì)胞；Q4(左下)象限為雙陰性，代表活細(xì)胞。由圖2C、2D可見，與對(duì)照組相比，LMWF組破骨細(xì)胞的凋亡率明顯上升。

圖2 LMWF對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的吖啶橙染色與流式細(xì)胞術(shù)Fig.2 Effect of LMWF on osteoclast apoptosis2A為對(duì)照組，2B為L(zhǎng)MWF組，2C為對(duì)照組，2D為L(zhǎng)MWF組2A, 2C: Control group; 2B, 2D: LMWF group

2.4 caspase-3活性的變化

RANKL誘導(dǎo)5 d后的破骨細(xì)胞中caspase-3活性隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加；當(dāng)5 ng/mL LMWF作用于誘導(dǎo)5 d后的破骨細(xì)胞24 h后caspase-3活性稍微升高；隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，caspase-3活性進(jìn)一步上升，并在作用72 h后達(dá)到高峰。提示LMWF誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡的過程中，可提高caspase-3的活性，見圖3。

圖3 LMWF在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)破骨細(xì)胞caspase-3活性的影響注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01Fig.3 Effect of LMWF on caspase-3 activity at different time pointsNote：*P<0.05 vs Control group；** P<0.01 vs Control group

2.5 對(duì)破骨細(xì)胞分化過程相關(guān)基因的表達(dá)情況

熒光定量PCR檢測(cè)各組BCL-2和BAX基因mRNA表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)。與空白組比較，5 ng/mL LMWF組中成熟破骨細(xì)胞中BCL-2表達(dá)明顯減少，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；BAX表達(dá)明顯升高，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；BCL-2/BAX比值顯著下降，P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖4。

圖4 LMWF處理后細(xì)胞中BCL-2與BAX mRNA表達(dá)水平的變化注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，** P<0.01Fig.4 Expression of BCL-2 and BAX mRNA in osteoclasts after 72 h-treatment with LMWF detected using RT-PCRNote：*P<0.05 vs Control group；** P<0.01 vs Control group

3 討論

骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨的微結(jié)構(gòu)退變?yōu)樘卣鳎瑢?dǎo)致骨脆性增加容易發(fā)生骨折的全身性骨病[5]。在骨代謝過程中，破骨細(xì)胞對(duì)骨吸收起主要作用，陳舊骨折的吸收速率與時(shí)間長(zhǎng)短主要由破骨細(xì)胞的活性和數(shù)量決定；破骨細(xì)胞是來源于單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，成熟的破骨細(xì)胞有多個(gè)細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中有大量的線粒體、高爾基體、溶酶體等特點(diǎn)，成熟破骨細(xì)胞不能進(jìn)行有絲分裂，壽命約為14d左右[6-8]。目前破骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要有兩種：①四肢長(zhǎng)骨機(jī)械分離法：采用酶消化法分離提取動(dòng)物四肢長(zhǎng)骨的成熟破骨細(xì)胞，分離的破骨細(xì)胞骨吸收活性大，但數(shù)量較小，難以大量使用；②破骨樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法：采用RANKL、M-CSF等誘導(dǎo)單核細(xì)胞為成熟的破骨樣細(xì)胞，誘導(dǎo)得到的破骨樣細(xì)胞數(shù)量較多，但骨吸收活性稍弱[9-11]。由于本實(shí)驗(yàn)需要大量的破骨細(xì)胞，因此采用了100 ng/mL RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞株為成熟的破骨細(xì)胞，經(jīng)破骨細(xì)胞特異性的TRAP染色和骨吸收功能成功的進(jìn)行了鑒定，已有大量文獻(xiàn)證明[12-14]單獨(dú)100 ng/mL的RANKL即可誘導(dǎo)出成熟的破骨細(xì)胞。

褐藻糖膠是目前研究最多的非哺乳動(dòng)物來源的，具有生物學(xué)活性的硫酸化多糖，主要存在于藻類和棘皮動(dòng)物中。褐藻糖膠又稱巖藻聚糖、巖藻聚糖硫酸酯、褐藻多糖硫酸酯，是從褐藻中提取的一類硫酸多糖，主要位于褐藻的細(xì)胞壁基質(zhì)中，占褐藻細(xì)胞壁干重的40%以上，是藻體維持體內(nèi)濕度、防止體表干燥和保護(hù)其免受損傷的一種成分，為褐藻利用光能所必需。大量研究已表明褐藻糖膠具有廣泛的生物學(xué)活性，如具有調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和保護(hù)腎臟等作用[15]。

已經(jīng)有報(bào)道[16]采用含有褐藻糖膠的骨支架，可以誘導(dǎo)成骨性，但褐藻糖膠對(duì)破骨細(xì)胞的影響尚未見報(bào)道。通過我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)TRAP(+)細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)LMWF可以減少RANKL誘導(dǎo)成熟破骨細(xì)胞的數(shù)量；應(yīng)用掃描電子電鏡對(duì)薄骨片骨吸收陷窩掃描發(fā)現(xiàn)LMWF可以抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能，骨吸收陷窩數(shù)量與骨吸收面積顯著減少。提示LMWF不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化、增值。同時(shí)能抑制破骨細(xì)胞的數(shù)量及骨吸收功能。

吖啶橙染色發(fā)現(xiàn)LMWF組的破骨細(xì)胞細(xì)胞核變小，染色質(zhì)不均勻，細(xì)胞核著色較深，提示LMWF組的破骨細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對(duì)照組的破骨細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)Annexin V與PI雙染得出LMWF組早期凋亡破骨細(xì)胞明顯高于正常對(duì)照組，而中晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞與正常對(duì)照組無差異，提示LMWF具有促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡的作用。

Caspase家族是一組半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和完成中起重要作用，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，決定了細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變和生物化學(xué)改變。Caspase的活化途徑有兩條：一條途徑是由死亡受體如Fas或TNFR介導(dǎo)的。另一條途徑由很多的促凋亡信號(hào)(如Bax)集中在線粒體水平，使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與Apaf-1(apoptosis protease acticating factor-1))結(jié)合, 進(jìn)而激活Caspase-9，三者共同組成一個(gè)重要的效應(yīng)Caspase的激活因子，接著逐步活化Caspase-3和Caspase-6、Caspase-7，產(chǎn)生Caspase的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)[17-19]。Caspase-3處于凋亡Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是最重要的效應(yīng)型Caspase。 Caspase-3是多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)，是細(xì)胞凋亡性死亡的最終執(zhí)行者，Caspase-3的活化說明凋亡進(jìn)入不可逆階段[20]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)LMWF可以明顯提高破骨細(xì)胞Caspase-3的活性，促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡。

凋亡相關(guān)基因中的BCL-2家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，由抗凋亡和促凋亡成員協(xié)同作用，發(fā)揮著細(xì)胞凋亡開關(guān)的作用。BCL-2是B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2基因的縮寫，能抑制細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制為：①抑制氧自由基；②影響細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的Ca2+內(nèi)流；③干擾細(xì)胞色素C的釋放而阻斷Caspase蛋白酶的激活,抑制細(xì)胞凋亡；④影響其他誘導(dǎo)凋亡的基因,如BCL-2可抑制p53、 c-myc誘發(fā)的細(xì)胞凋亡[21]。BAX即BCL-2相關(guān)的X蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡， BAX基因的表達(dá)并不立即導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而是僅在細(xì)胞接受死亡信號(hào)之后BAX才可以開始發(fā)揮作用，通過抑制BCL-2的作用而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。BAX可以同BCL-2形成異二聚體，使后者喪失抑制凋亡的作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[22]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生與BCL-2/BAX比值有關(guān)，比值降低有利于破骨細(xì)胞發(fā)生凋亡[23]。 BCL-2/BAX降低，可引起線粒體膜電位的改變,進(jìn)一步激活Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。BCL-2/BAX的相互抑制關(guān)系是細(xì)胞死亡的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)點(diǎn)。在正常情況下, BCL-2和BAX在細(xì)胞內(nèi)保持平衡。如果BCL-2相對(duì)量高于BAX,則促進(jìn)形成BCL-2/BAX異二聚體，并使BCL-2同二聚體的量增多，從而抑制細(xì)胞凋亡；如果BAX相對(duì)量高于BCL-2，則BAX同二聚體的量增多，并抑制形成BCL-2/BAX異二聚體，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]。本實(shí)驗(yàn)PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LMWF可以可下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)，上調(diào)BAX基因的表達(dá)，導(dǎo)致BCL-2/BAX比值降低，這可以促進(jìn)了線粒體膜的通透性的下降，導(dǎo)致細(xì)胞色素C等促細(xì)胞凋亡因子向細(xì)胞質(zhì)的釋放，最終激活Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，本課題組認(rèn)為，低分子量褐藻糖膠可以抑制破骨細(xì)胞的活性與骨吸收功能，促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制與線粒體凋亡途徑密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)了褐藻糖膠在骨科中的用途，為海洋醫(yī)藥在骨科中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)理論。