陳宗鋒 趙汝崗 張強(qiáng)* 成軍 朱春曉 王晶晶 劉琨

1.泰山醫(yī)學(xué)院研究生部，泰安 271016 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院骨科，北京 100015 3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所 新發(fā)突發(fā)傳染病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100015 4.濰坊醫(yī)學(xué)院，濰坊 261042

富馬酸替諾福韋酯(Tenofovir Disoproxil Fumarate，TDF)，分子量為635.5149，有效成分為替諾福韋(tenofovir)，是一種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，自2001年美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA, USA)批準(zhǔn)應(yīng)用，目前廣泛應(yīng)用于人類免疫缺陷病毒(HIV, human immunodeficiency virus)感染、慢性乙肝等抗病毒治療。核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑作用于RNA逆轉(zhuǎn)錄酶，阻止核糖核酸病毒的遺傳物質(zhì)RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)而阻止病毒復(fù)制。

替諾福韋在臨床上取得良好效果，伴隨而來(lái)的是其各種副作用的發(fā)生，例如骨量降低、骨質(zhì)疏松癥[1]、低磷酸鹽血癥性軟骨病[2]、范可尼綜合征[3、4]。已經(jīng)證實(shí)，經(jīng)過(guò)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(antiretroviral therapy, ART)后，含TDF治療方案比其他核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的骨質(zhì)丟失率高1%-2%[5-9]。目前，為減少TDF相關(guān)性骨質(zhì)丟失的并發(fā)癥，相關(guān)替代藥物(如馬拉韋羅, Maraviroc, MVC[10]，輝瑞公司生產(chǎn)的一種新的抗艾藥)也在研發(fā)中。已報(bào)道，另一個(gè)并發(fā)癥是腎毒性，應(yīng)用TDF的患者腎毒性高達(dá)22-53%，包括近端小管功能不全、范可尼綜合征、腎衰[11，12]。近端腎小管功能異常導(dǎo)致尿磷酸鹽丟失或者腎1,α-二羥維生素D3丟失，伴隨骨軟化已報(bào)道，在含TDF治療組達(dá)1.6%-22%[13]。

正常骨代謝處于動(dòng)態(tài)平衡，是以成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨吸收為基礎(chǔ)。來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞，在人體內(nèi)合成膠原蛋白和糖蛋白形成類骨質(zhì)[14]。成骨細(xì)胞功能變化，可以導(dǎo)致骨丟失，或者骨量減少，或者骨質(zhì)疏松癥。

基于臨床中觀察到的替諾福韋酯相關(guān)性骨質(zhì)丟失，我們旨在探索替諾福韋酯相關(guān)性骨質(zhì)丟失的可能機(jī)制。在本研究中，我們探索替諾福韋酯是否能影響成骨細(xì)胞的生物學(xué)特征及礦化形成，進(jìn)一步影響成骨細(xì)胞的功能和骨形成。為此我們選擇成骨細(xì)胞前體細(xì)胞，暴露于含不同濃度的培養(yǎng)基中，收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡及礦化的變化。已經(jīng)有研究顯示替諾福韋酯可以導(dǎo)致成骨細(xì)胞基因表達(dá)紊亂，這些基因涉及到成骨細(xì)胞功能，進(jìn)而導(dǎo)致骨密度降低[15]。我們的研究第一次探索了TDF對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡及礦化的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株以及主要試劑和儀器

小鼠胚胎前體成骨樣細(xì)胞MC3TC-E1(購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，Chinese academy of medical sciences, institute of basic medical basic medical cell resource center)，富馬酸替諾福韋二吡呋酯藥物(Tenofovir Disoproxil Fumarate，正大天晴公司提供，批號(hào)：1505041102，含量：99.5%，水分：0.3%)、MEM-α培養(yǎng)基(Gibco公司)，新生胎牛血清(Gibco公司)，CCK8試劑(Dojindo，CK04)、Vitamin C(SIGMA公司)、β-甘油磷酸鈉(SIGMA公司)、100×青-鏈霉素溶液(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)、DMSO(美國(guó)AMRESCO公司)、PBS(Gibco公司，4.775 g/500 ml)、酶標(biāo)儀(BIO-RAD Model 680型)、超低溫保存箱(SANYO)、流式細(xì)胞儀(FACS,Fluorescence Activated Cell Sorter)、CO2溫箱(SANYO)、低速離心機(jī)(法國(guó)捷安公司)，以及實(shí)驗(yàn)室其他常用設(shè)備。

配制濃度為0.5 mmol/ml的TDF母液：稱取0.318 g TDF，溶于1 ml DMSO，充分振蕩混勻，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。按照?shí)驗(yàn)所需濃度，用普通培養(yǎng)基稀釋到相應(yīng)濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存：將新鮮購(gòu)置MC3T3-E1細(xì)胞，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，普通培養(yǎng)液含90%MEM-α基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%的胎牛血清、100 μg/ml雙抗(青霉素-鏈霉素)。誘導(dǎo)培養(yǎng)液在普通培養(yǎng)液基礎(chǔ)上含10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50 μg/L Vitamin C。每2～3天換液1次，細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%傳代，并凍存部分第一、二、三代以備用。

1.2.2細(xì)胞增殖情況檢測(cè)：CCK8比色法。96孔板接種細(xì)胞，每孔100 μL，每孔細(xì)胞數(shù)4800個(gè)細(xì)胞。鋪板24小時(shí)后，觀察細(xì)胞是否貼壁，貼壁后，更換含不同濃度TDF(50 nM、500 nM、5000 nM、50000 nM、250000 nM、500000 nM)的普通培養(yǎng)液。共分8組，即空白對(duì)照組、不同濃度TDF處理組、DMSO處理組。分別干預(yù)1 d、3 d、5 d、7 d后，用PBS洗一遍，加入CCK8(5 mg/mL)，每孔20 μL，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育1.5 h，570 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值(OD值)。

1.2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)：6孔板中接種細(xì)胞，每孔2 ml，每孔細(xì)胞數(shù)1.5×105個(gè)。24h細(xì)胞貼壁后，更換含不同濃度TDF(50 nM、500 nM、5000 nM、50000 nM、250000 nM、500000 nM)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，分別于24 h、48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS、cell staining buffer各洗一遍，100ul cell staining buffer重懸細(xì)胞，Annexin V 2ul/樣，室溫染色15 min，上機(jī)檢測(cè)前7AAD染色，2ul/樣，流式細(xì)胞儀檢測(cè)TDF對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

1.2.4細(xì)胞鈣化程度檢測(cè)：茜紅素染色法。6孔板接種細(xì)胞，每孔2 ml，每孔細(xì)胞數(shù)1.5×105個(gè)，培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞貼壁，更換含不同濃度TDF(50 nM、500 nM、50000 nM)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2天換液。于第14天以70%乙醇固定細(xì)胞1 h，以雙蒸水洗3次后，茜紅素溶液染色30 min。染色后以雙蒸水洗3遍后，觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行單因素方差分析，各實(shí)驗(yàn)組間比較采用Student-Newman-Keuls(SNK)檢測(cè)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 TDF對(duì)MC3T3-E1增殖的影響

本研究結(jié)果顯示，與DMSO對(duì)照組相比，TDF干擾24 h時(shí)，50 nM、500 nM、5000 nM濃度對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖無(wú)抑制(P>0.05)，而48 h時(shí)，50 nM、500 nM對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖無(wú)抑制(P>0.05)，余各濃度的TDF均抑制MC3T3-E1細(xì)胞增殖。結(jié)果表明，不同濃度的TDF對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖抑制差異較大，而在臨床血藥濃度(約500nM)下對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖無(wú)抑制(P>0.05)。

2.2 TDF對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與DMSO對(duì)照組相比，TDF濃度為250000 nM和500000 nM時(shí)，干擾48 h，MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率明顯增加。而在血藥濃度(約500 nM)，TDF對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡無(wú)影響。

2.6 TDF抑制成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成

鈣沉積，用來(lái)評(píng)估體外細(xì)胞外基質(zhì)礦化的生理過(guò)程。礦化對(duì)于骨形成過(guò)程非常重要。為了探究TDF對(duì)骨礦化過(guò)程的作用，我們用茜紅素染色分析誘導(dǎo)培養(yǎng)基中鈣結(jié)節(jié)的形成。MC3T3-E1 細(xì)胞分別用含TDF(0 nM、50 nM、500 nM、50000 nM)、DMSO(0.1‰)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和非誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理14 d。NC組培養(yǎng)基:不含β-甘油磷酸鈉和維生素C。結(jié)果如圖4所示，500 nM和50000 nM TDF處理組礦化結(jié)節(jié)明顯減少，同時(shí)對(duì)照組(含0.1‰DMSO)和正常組(除5%胎牛血清和0.5%雙抗的培養(yǎng)基外，不含DMSO和TDF)鈣結(jié)節(jié)較多，而非誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后(NC組)無(wú)鈣結(jié)節(jié)的形成。表明TDF能抑制MC3T3-E1鈣結(jié)節(jié)的形成。

注：Δ在相同濃度下，不同時(shí)間點(diǎn)兩組間抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TDF干擾24 h后，高濃度TDF(50000 nM、250000 nM、500000 nM)與DMSO對(duì)照組相比，抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低濃度(0nM、50 nM、500 nM、5000 nM)和DMSO對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.868、0.881、0.591、0.167);TDF干擾48 h后，空白組(0 nM)、TDF處理組(50 nM、500 nM)和DMSO對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.096、0.207、0.381)，余各組與DMSO對(duì)照組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ΔAt the same concentration, the rates have statistical significance between the two groups of different times (24 h and 48h);At 24 h, the rates of high concentration groups (50000 nM, 250000 nM, 500000 nM) are statistically significant (P<0.05), compared with the DMSO control group; the rates of low concentration groups (50nM, 500nM, 5000nM) and DMSO group do not have significance (P value are 0.868、0.881、0.591、0.167), compared with DMSO control group;At 48 h, the rates of treatment groups (0nM, 50nM, 500nM), have no statistical significance (P value are 0.096, 0.207, 0.381), compared with DMSO control group; the rates of the other groups have statistical significance , compared with DMSO control group

圖1 不同濃度TDF不同處理時(shí)間對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖抑制率Fig.1 The growth inhibition rate of MC3T3-E1 cells at different concentrations of TDF on 24 h and 48 h.

濃度(nM)24 h48 h011.58±5.08▲8.88±3.95△DMSO12.86±2.53▲7.98±2.31△5013.72±5.88▲8.33±4.13△50012.25±5.63▲10.97±7.15△500014.73±4.26▲11.82±6.21△5000018.21±6.98▲16.83±8.59△25000015.05±14.21▲●35.94±8.82△●5000009.57±2.42▲●48.00±20.85△●

注：●相同TDF濃度(250000 nm/L、500000 nm/L)，不同時(shí)間點(diǎn)，兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);▲TDF干擾24 h后，不同濃度TDF對(duì)成骨細(xì)胞凋亡率各組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;△TDF干擾48 h后，TDF濃度(500000 nmol/L、250000 nmol/L)處理組與對(duì)照組(DMSO處理組)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組間均無(wú)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);●At different points and same TDF concentration(250000nm/L or 500000nm/L), the apoptosis rates between groups are significant(P<0.05);▲after 24 h TDF treated, the apoptosis rates between groups have no significance;△after 48 h TDF treated, the apoptosis rates of 50000nM group and 250000nmol/L group have significance(P<0.05), compared with DMSO group.

圖2 不同濃度TDF對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。Fig.2 The effect of different concentrations of TDF on cell apoptosis

3 討論

本研究旨在探索TDF對(duì)成骨細(xì)胞增殖、凋亡、鈣結(jié)節(jié)形成的影響。我們選擇MC3T3-E1作為體外模型，探索TDF對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的影響。

HIV感染者中，骨量減少及骨質(zhì)疏松較普遍，原因是多方面的。包括HIV病毒活動(dòng)，藥物毒性，還有宿主因素。其中藥物毒性發(fā)揮重要作用，尤其是TDF。盡管很多臨床文獻(xiàn)報(bào)道骨代謝與TDF的關(guān)系，但是涉及的病理機(jī)制并未無(wú)完全闡明。

臨床研究已經(jīng)表明TDF與骨代謝密切相關(guān)。在含TDF抗病毒治療方案的患者中，將TDF轉(zhuǎn)換成阿巴卡韋(abacavir, ABC)，48周時(shí)，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)、膠原蛋白I型(Collagen type I)、I型前膠原氨基端肽(Procollagen I N-terminal Peptide，P1NP)等血清三種骨標(biāo)志物的含量有意義地降低，表明骨代謝減弱[16]，骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)無(wú)變化，遺憾地是此研究中核因子κB受體活化因子配體(receptor activator activator nuclear factor-κB ligand, RANKL)在樣本中未能檢測(cè)到，OPG/RANKL/RANK信號(hào)系統(tǒng)對(duì)調(diào)節(jié)骨代謝平衡起重要作用。持續(xù)應(yīng)用包含齊多夫定(zidovudine, AZT)/拉米夫定(lamivudine, 3TC)的ART治療方案，直接轉(zhuǎn)換成TDF/恩曲他濱(emtricitabine, FTC)方案時(shí)，骨代謝增加、骨密度(bone mineral density, BMD)降低，表明影響體內(nèi)骨代謝[17]。相同的研究指出，低骨密度的接受抑制病毒治療的HIV感染患者，從TDF換成雷特格韋(raltegravir)，48周時(shí)，髖骨和脊柱BMD升高，骨代謝標(biāo)志物(氨基末端肽、骨鈣素(bone gla protein, BGP)、骨堿性磷酸酶(bone specific alkaline phosphatase, BSAP))降低[18]。ABC/3TC和TDF/FTC聯(lián)合依非韋倫(efavirenz, EFV)，最低限度，影響腎小球?yàn)V過(guò)率，96周時(shí)，TDF/FTC組，腎小管功能障礙(視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein, RBP)/肌酐比值、微球蛋白(β-2 microglobulin, B2M)/肌酐比值)和骨代謝標(biāo)志物水平(P1NP、CTX、BGP、BSAP)都增加較大，髖骨骨密度降低更多[19]。

由TDF引起的腎磷和鈣丟失可能與代償性骨重吸收有關(guān)，并改變了再生骨的礦化。此外，由于HIV本身引起的炎癥性細(xì)胞因子的活化，也可引起骨密度降低[20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TDF對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖和凋亡的影響受TDF濃度和干擾時(shí)間的影響，即低濃度對(duì)增殖和凋亡無(wú)影響，高濃度抑制增殖并促進(jìn)凋亡，并隨干擾時(shí)間增加，增殖抑制率和促凋亡率增大；TDF抑制鈣結(jié)節(jié)形成，進(jìn)而影響成骨。在血藥濃度(約500 nM)時(shí)，TDF不影響MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖和凋亡，但長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用(TDF干擾14天)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯受到抑制。

圖3 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)不同濃度TDF對(duì)MC3T3-E1凋亡的影響Fig.3 The effect of different concentrations of TDF on cell apoptosis detected by flow cytometry

圖4 TDF對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響Fig.4 The effect of TDF on the mineralization of MC3T3-E1 cells

綜上所述，我們的研究證實(shí)，在體外，血藥濃度(約500 nM)TDF對(duì)MC3T3-E1前成骨細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)特性無(wú)影響，但抑制成骨細(xì)胞礦化，進(jìn)而影響骨形成。HIV患者骨病的病理機(jī)制是復(fù)雜的，也可能是HIV病毒本身和應(yīng)用抗病毒藥物兩者之間復(fù)雜的相互作用所導(dǎo)致。未來(lái)的我們的研究將更加深入地探索，HIV病毒本身對(duì)骨代謝的作用，以及暴露于HIV和TDF兩者時(shí)骨代謝的變化，來(lái)更充分地闡明艾滋病骨病的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。